JPS6133593B2 - - Google Patents

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JPS6133593B2
JPS6133593B2 JP55500310A JP50031079A JPS6133593B2 JP S6133593 B2 JPS6133593 B2 JP S6133593B2 JP 55500310 A JP55500310 A JP 55500310A JP 50031079 A JP50031079 A JP 50031079A JP S6133593 B2 JPS6133593 B2 JP S6133593B2
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collagen
cells
fibroblasts
skin
hydrated
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JP55500310A
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Eugene Bell
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Massachusetts Institute of Technology
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Publication of JPS6133593B2 publication Critical patent/JPS6133593B2/ja
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    • C07C311/00—Amides of sulfonic acids, i.e. compounds having singly-bound oxygen atoms of sulfo groups replaced by nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C311/30—Sulfonamides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by singly-bound nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C311/37—Sulfonamides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by singly-bound nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups having the sulfur atom of at least one of the sulfonamide groups bound to a carbon atom of a six-membered aromatic ring
    • C07C311/38—Sulfonamides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by singly-bound nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups having the sulfur atom of at least one of the sulfonamide groups bound to a carbon atom of a six-membered aromatic ring having sulfur atoms of sulfonamide groups and amino groups bound to carbon atoms of six-membered rings of the same carbon skeleton
    • C07C311/39—Sulfonamides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by singly-bound nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups having the sulfur atom of at least one of the sulfonamide groups bound to a carbon atom of a six-membered aromatic ring having sulfur atoms of sulfonamide groups and amino groups bound to carbon atoms of six-membered rings of the same carbon skeleton having the nitrogen atom of at least one of the sulfonamide groups bound to hydrogen atoms or to an acyclic carbon atom
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61F—FILTERS IMPLANTABLE INTO BLOOD VESSELS; PROSTHESES; DEVICES PROVIDING PATENCY TO, OR PREVENTING COLLAPSING OF, TUBULAR STRUCTURES OF THE BODY, e.g. STENTS; ORTHOPAEDIC, NURSING OR CONTRACEPTIVE DEVICES; FOMENTATION; TREATMENT OR PROTECTION OF EYES OR EARS; BANDAGES, DRESSINGS OR ABSORBENT PADS; FIRST-AID KITS
    • A61F2/00—Filters implantable into blood vessels; Prostheses, i.e. artificial substitutes or replacements for parts of the body; Appliances for connecting them with the body; Devices providing patency to, or preventing collapsing of, tubular structures of the body, e.g. stents
    • A61F2/02—Prostheses implantable into the body
    • A61F2/10—Hair or skin implants
    • A61F2/105—Skin implants, e.g. artificial skin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
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    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N5/0698—Skin equivalents
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    • A61F—FILTERS IMPLANTABLE INTO BLOOD VESSELS; PROSTHESES; DEVICES PROVIDING PATENCY TO, OR PREVENTING COLLAPSING OF, TUBULAR STRUCTURES OF THE BODY, e.g. STENTS; ORTHOPAEDIC, NURSING OR CONTRACEPTIVE DEVICES; FOMENTATION; TREATMENT OR PROTECTION OF EYES OR EARS; BANDAGES, DRESSINGS OR ABSORBENT PADS; FIRST-AID KITS
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
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    • C12N2502/09—Coculture with; Conditioned medium produced by epidermal cells, skin cells, oral mucosa cells
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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Description

請求の範囲 １ ａ 水和コラーゲンラテイスを形成せしめ、 ｂ 該コラーゲンラテイスに線維芽細胞を接触せ
しめ、そして ｃ 該ラテイスと該細胞とを、該細胞が該コラー
ゲンラテイスに結合し且つ該コラーゲンラテイ
スを収縮せしめるに充分な条件下に維持し、そ
れによつて生きている組織を形成せしめる、 ことを特徴とする生きている組織を製造する方
法。
２ 該水和コラーゲンラテイスが非湿潤性表面上
に形成されている請求の範囲第１項による方法。
３ 請求の範囲第１項又は第２項の方法に従つて
製造された生きている組織。
４ ａ コラーゲンの酸性溶液を形成せしめ、 ｂ 線維芽細胞と栄養媒体とを、コラーゲンの該
酸性溶液と一緒にし、 ｃ コラーゲンの該溶液のPHを、水和コラーゲン
ラテイス中にコラーゲン原線維を沈澱せしめる
のに充分な水準にまで上昇せしめ、そして ｄ 該ラテイスと該細胞とを、該細胞が該コラー
ゲンラテイスに結合し且つ該コラーゲンラテイ
スを収縮せしめるに充分な条件下に維持し、そ
れによつて生きている組織を形成せしめる、 ことを特徴とする生きている組織を製造する方
法。
５ 工程ｂおよびｃが同時に行われる請求の範囲
第４項の方法。
６ ａ 水和コラーゲンラテイスを形成せしめ、 ｂ 該コラーゲンラテイスに線維芽細胞を接触せ
しめ、 ｃ 該ラテイスと該細胞とを、該細胞が該コラー
ゲンラテイスに結合し且つ該コラーゲンラテイ
スを収縮せしめるに充分な条件下に維持して生
きている組織を形成せしめ、 ｄ 該生きている組織上にケラチン細胞を植え付
け、そして ｅ 該生きている組織を、該線維芽細胞と該ケラ
チン細胞との生長がそれによつて皮膚等価物を
生成するに充分な条件下に維持する、 ことを特徴とする皮膚等価物を形成せしめる方
法。
７ ａ 線維芽細胞を含有する濃厚な水和コラー
ゲンラテイス、および ｂ 該濃厚な水和コラーゲンラテイス上に担持さ
れたケラチン細胞、 とから成ることを特徴とする皮膚等価物。
８ ａ 水和コラーゲンラテイスを形成せしめ、 ｂ 該水和コラーゲンテライスを潜在的受容体か
ら得られた細胞と一緒にする、 ことを特徴とする、潜在的受容体に対する生物的
に適合し得る補綴を形成せしめる方法。
技術分野 本発明は生物学の分野に属するものであり、特
に皮膚に対する創傷を被覆するために用いられ得
る物質に関する。
背景の技術 人間の皮膚の重要な領域に対する損傷に関する
多くの創傷、特に重度の火傷の場合に、その創傷
を皮膚の機能の１部を備えた物質で被覆する緊急
の必要性がある。これらの機能は、流体損失の減
少、感染防止、および潜在的瘢痕領域の減少を意
味する。
この問題を解決するのに採られてきたアプロー
チは同種移植、改質された皮膚の異種移植、合成
重合体構造物又は再構成されたコラーゲンフイル
ムの使用を含んでいる。これらのアプローチの
夫々は部分的成功をもたらしているが、夫々解決
されていない重大な問題で同様にいつぱいになつ
ている。特に、これらのアプローチの中の多くの
ものにおける重大な問題は、皮膚置換の、特に免
疫抑制剤の不存在下における、拒絶であり、ある
いは宿主の酵素による移植片の分解である。
発明の開示 本発明は生きている組織が形成され得るという
発見に関する。この生きている組織は、試験管内
で水和コラーゲンラテイスを形成せしめ且つこの
ラテイス内に線維芽細胞を植え付けることによつ
て製造される。ラテイスの形成とその内への細胞
の植付けとを同時に行うための便利な技法は、培
養皿中に維持された酸性コラーゲン溶液を線維芽
細胞を含有する栄養媒体で中和することを含む。
中和によつて、コラーゲン原線維は溶液から沈澱
せしめられ、その内に均一に分散された線維芽細
胞を持つたラテイスを形成する。細胞とラテイス
は、次いで、細胞がコラーゲンラテイスに結合し
且つ初めの大きさのフラクシヨンにまでそれを収
縮せしめそれによつて生きている組織を与える条
件下に維持される。
皮膚等価物は、この生きている組織から、この
生きている組織にケラチン細胞を植え付けそして
その生長を与えることによつて、製造され得る。
この皮膚等価物は、その基本的な組織が皮膚のそ
れと類似しており且つその生きている構成細胞が
潜在的移植組織受容体によつて供給され得るた
め、上述した人工の皮膚とは特異的に相違してい
る。
【図面の簡単な説明】
第１図は水和コラーゲンラテイスの収縮を図示
しているデータのプロツトである。第２図は異な
るコラーゲン含量を有する水和コラーゲンラテイ
スの収縮を図示しているデータのプロツトであ
る。第３図は異なる数の繊維芽細胞を含有する水
和コラーゲンラテイスの収縮を図示しているデー
タのプロツトである。第４図は相異なる集団の二
重水準（different population doubling levels）
の細胞の、水和コラーゲンラテイス中における収
縮能力を示しているデータのプロツトである。第
５図は水和コラーゲンラテイスを収縮せしめる細
胞の能力に対する、禁止剤チトカラシンＢ
（inhibitor cytochalasin Ｂ）10.0μｇ/mlの影響
を図示しているデータのプロツトである。第６図
は、水和コラーゲンラテイスを収縮せしめる細胞
の能力に対する、禁止剤コルセミド（colcemid）
0.36μｇ/mlの影響を図示しているデータのプロ
ツトである。第７図は、水和コラーゲンラテイス
を収縮せしめる細胞の能力に対する、チトシン
アラビノサイド（cytosine arabinoside）の影響
を図示しているデータのプロツトである。
本発明の実施の最良の態様 水和コラーゲンラテイスは、ラツトの尾の腱お
よび牛の皮膚のコラーゲンに由来するコラーゲン
を採用して製造された。コラーゲンの他の源も、
もちろん適当であろう。コラーゲンの溶液は僅か
な酸性条件下で製造され且つ維持される。ラテイ
スは、栄養媒体およびそのPHを溶液からコラーゲ
ン原線維を沈殿せしめるに充分なまで上昇せしめ
る塩基と一緒に線維芽細胞を添加することによつ
て製造される。水和コラーゲンラテイスの製造は
以下の参考文献により詳細に記載されており、そ
れらの教示は参考として加入される。Elsdale、
T.およびBard、J.、“Collagen Substrata for
Studies on Cell Behavior、”J.Cell Bio、54、
626−637（1972）；Ehrmann、R.L.およびGey、
G.O.、“The Growth of Cells on Ａ
Transparent Gel of Reconstituted Rat−Tail
Collagen、”J.Natl.Cancer Inst.、16、1375−
1403（1956）；Emermann、J.T.および
Pitelka、D.R.、“Hormonal Effects on
Intracellular and Secreted Casein in Cultures
of Mouse Mammary Epithelial Cells on
Floating Collagen Membranes、”In Vitro、
13、316−328（1977）；Michalopoulous、G.お
よびPitot、H.C.、“Primary Culture of
Parenchymal Liver Cells on Collagen
Membranes、”Exp.Cell Res.94、70−78
（1975）；Gey.G.O.、Svotelis、M.、Foard、M.
およびBang、F.B.、“Long−Term Growth of
Chicken Fibroblasts On Ａ Collagen
Substrate、”Exp.Cell Res.、84、63−71
（1974）；およびHillis、W.D.およびBand、F.B.
、“The Cultivation of Human Embryonic
Liver Cells、”Exp.Cell Res.、26、９−36
（1962）． ここに記載された実験に実際に使用された線維
芽細胞は、人間の包皮線維芽細胞およびモルモツ
トの皮膚の線維芽細胞であつた。他の源からの線
維芽細胞も同様に用いられ得、そして如何なる脊
椎動物からの線維芽細胞も水和コラーゲンラテイ
スを収縮せしめるために適当であろうことが、実
際に、信じられている。
水和コラーゲンラテイス中への線維芽細胞の導
入は、トラツプされた水が絞り出されるにつれ
て、ラテイスを収縮せしめる。ラテイスが形成さ
れた表面が非湿潤性の、例えば疎水性のプレート
であれば、得られる組織は規則的な幾何学のもの
となる。組織培養プレート上で、１部の細胞はラ
テイスからプレート表面に移動しそしてラテイス
の収縮は常に規則的ではなかつた。細菌学的ペト
リ皿の如き非湿潤性表面が用いられたときには、
ラテイスはその直径が細胞によつて減少せしめら
れるにつれて殆んど完全な板のままであつた。
線維芽細胞はコラーゲンラテイス内に均一に分
散され、単にラテイスの表面に分散されていない
ことが見い出された。これは、そして、人間およ
び他の哺乳動物の皮膚の層に類似している。
細胞の非存在下では、ラテイスは直径に変化を
こうむらない。例えば、栄養媒体中で５日間、１
×106人間の包皮の線維芽細胞を生長せしめるこ
とによつて製造された調整された媒体は、細胞が
存在しないときには収縮を起さなかつた。
細胞を持つた収縮されたコラーゲンラテイス
は、皮膚又は真皮に似ている。部分的に収縮した
ときでさえ、それらは合理的な密度を持つており
且つ容易に取扱いがなされ得る。細胞と一緒に作
られた当初は、ラテイスは殆んど透明であるが、
水が排除され直径が減少するにつれ、次第に乳白
色となつた。ラテイス面積が20〜30倍減少した
後、それらは硬いゴム状密度、白味がかつたピン
ク色調を持ち、そして引裂きもしくは変更されず
に幾分引き伸ばされ得る。
ラテイスの最初の直径は、それを形成せしめる
プレートによつて決定される。それ故、最大収縮
は任意の寸法である。
大部分の収縮されたコラーゲンラテイスはシー
トとして形成されるが、他の形にも形成され得
る。例えば、環状型内で収縮されたラテイスを形
成せしめることによつてチユーブを形成せしめる
ことができ、あるいは適当な型から皮膚の手袋が
作られ得る。
生検で得られた人間の包皮のケラチン細胞が収
縮された水和コラーゲンマトリツクス上に担持せ
しめられる。同じことが、もちろん、試験管内で
培養されたケラチン細胞を用いて行なわれ得る。
ケラチン細胞のプレーテイングは、マトリツクス
ゲルが生成するとき、ラテイスの収縮の期間中の
何時かあるいは収縮が完了した後に何時かに、な
され得る。解離したラテイス細胞のサスペンジヨ
ンをプレーテイングした後３日以内に、細胞はラ
テイスの表面上に融合性の層を形成し、そしてケ
ラチン化の工程が、組織液体の損失を妨げる角膜
層の形成を先導して開始する。
ここに記載した生きている組織は人間もしくは
他の哺乳動物の皮膚の創傷の処置のために適当で
ある。それは、それが皮膚の等価物として機能す
る重度の火傷に対し特に適当である。線維芽細胞
による水和コラーゲンラテイスの収縮は、収縮力
を含む、線維芽細胞機能を測定するためのアツセ
イとしても用いられ得る。
皮膚等価物、傷の保護等々の他に、この生きて
いる組織は他の応用に対しても仕立てられ得る。
例えば、線維芽細胞により収縮せしめられたコラ
ーゲンラテイスは、他の細胞形、例えば膵臓機能
を有する組織の製造におけるパンクレアチン小島
細胞、特に潜在的受容体から得られた細胞から製
造されたもの、に対するキヤリーとして採用され
得る。
更に、チユーブおよび他の形は、線維芽細胞、
心筋細胞あるいはその他の細胞を含むラテイスか
ら製造され、生きている補綴を形成する。そのよ
うな補綴は、例えば照射あるいは化学薬品によつ
て、更に処理を受けることさえでき、生きていな
いがしかしながら生物学的に適合し得る補綴に転
換され得る。
本発明は次の実施例により更に特定的に説明さ
れ得る。
実施例 １ 線維芽細胞で接種されたコラーゲンラテイスの
製造 粗製コラーゲン溶液は次のようにして製造され
た。450ｇのラツトからの凍結ラツト尾を、70％
エタノール中で20分間解凍した。腱の束を層流フ
ード中、70％エタノール中で切取つた。個々の腱
を腱の鞘から引き出し、細かく切り、そして尾当
り250mlの希酢酸（１：1000）中に置いた。この
溶液を４℃で48時間放置しておいた。その時点で
細かく切つた腱は全容積を占めるまで膨潤した。
この粘性溶液をベツクマンＬ超遠心分離機中、
SW25ローター中で、23Krpmで１時間遠心分離
した。上澄を取り去り、そして粗製コラーゲン溶
液（プロテイン“Ｃ”）として４℃で貯蔵した。
精製したコラーゲン溶液は、粗製コラーゲン溶
液を0.1M NaOHと６：１の比率で混合し、酢酸
で中和しそれによつてコラーゲンを沈殿せしめる
ことによつて製造した。この溶液は、臨床遠心分
離機で５分間1500rpmで遠心分離された。上澄は
無視されそして同容量の新しい酢酸（１：1000）
がコラーゲンを再溶解するために導入された。こ
の溶液は、精製されたコラーゲン溶液（プロテイ
ン“Ｒ”）として４℃で貯蔵された。
蛋白質濃度はローリーら（Lowry et.al.）の方
法により決定された。Lowry、O.H.、
Rosebrough、N.J.、Farr、N.J.およびRandall、
R.J.、J.Biol.Chem.、193、265−275（1951）参
照。
蛋白質ラテイスは、60mmフアルコン細菌学的皿
中で、それに線維芽細胞を弱く接着せしめて製造
された。それぞれの皿は、1.0ml５×マツコイ
（McCoy）の5a媒体、1.0ml胎児の牛血清、0.25ml
0.1M NaOH、1.5コラーゲン溶液および1.0ml１
×マツコイの媒体中に懸濁した線維芽細胞、を含
んでいた。これらの皿は上記体積のマツコイの媒
体、血清およびNaOHで先ず満たされ、次いで線
維芽細胞サスペンジヨンが製造されるまでしまつ
て置かれた。コラーゲン溶液と線維芽細胞との同
時添加においては、スピードが重要であつた。な
ぜなら、ゲルが直ちに硬化を開始したためであ
る。皿は、５％CO2雰囲気中、37℃で恒温器中に
置かれた。線維芽細胞を導入しているゲルは、10
分後に完全に硬化した。
用いた線維芽細胞は、ニユージヤージー、ケム
デンのHuman Genetic Cell Repository at the
Institute for Medical Researchから得られた、
人間の包皮の線維芽細胞、ストレイン1519であつ
た。これらの細胞は、20％血清、ペニシリンおよ
びストレプトマイシンを含むマツコイの5a改質媒
体中で生育され且つ維持された。培養物はミコプ
ラズマを有さなかつた。M.I.T.の細胞培養センタ
ー（Cell Culture Center）は、10世代毎の、集
団の二重水準（PDL）、の細胞を製造し且つ凍結
した。
ラテイス直径を測定するため、これらの皿を黒
い背景上の透明なメートル法定木の上に置いた。
ゲル縁の最適視度は、皿の縁に付し水平に白色光
を照らすことによつて得られた。収縮したゲル
は、良好に形成された板であつた。それらは、
種々の点において直径がほんの僅かに相違してい
るだけであつた。主軸と副軸との平均として取ら
れた。
実施例 ２ 線維芽細胞による水和コラーゲンの収縮の測定 実施例１の手順に従つて製造され、且つ7.5×
106人間の包皮の線維芽細胞、精製された1519、
19番目のPDLによるプロテイン“Ｃ”570μｇ/ml
を含有する、水和コラーゲンラテイスの収縮が決
定された。媒体は、最初と、４日目と８日目と
に、皿内で変えられた。得られたデータは第１図
にプロツトされており、７日を僅かに超えた時点
でラテイス面積が112倍減少していることを示し
ている。１日以内に、７倍の面積の収縮があつ
た。
実施例 ３ 異なる蛋白質濃度の水和コラーゲンラテイスの
収縮 水和コラーゲンラテイスの蛋白質濃度のラテイ
ス収縮に対する影響は、次のようにして決定され
た。３種の水和コラーゲンラテイスが夫々が異な
る濃度でプロテイン“Ｒ”を含有することを除け
ば、実施例１の手順に従つて製造された。人間の
包皮の線維芽細胞、ストレイン1519、19番目の
PDLが用いられ、媒体は４日目に変えられた。
得られたデータは第２図にプロツトされてお
り、それからラテイス収縮速度はゲル蛋白濃度と
逆に変化することがわかる。面積の差は時間が経
過するにつれて、より少さい大きさとなつた。
実施例 ４ 水和コラーゲンラテイスの収縮に対する細胞の
数の影響 水和コラーゲンラテイスの収縮に対する細胞の
数の影響は、次のようにして決定された。720μ
ｇ／mlのプロテイン“Ｒ”を含む沢山の水和コラ
ーゲンラテイスが実施例１の手順に従つて製造さ
れた。人間の包皮の線維芽細胞、ストレイン1519
が用いられ、そしてそれぞれの培養物の媒体は３
日目、７日目および10日間に変えられた。
細胞が添加されない対照例が採用された。更
に、４つのシリーズの実験が細胞の数を変えて添
加することにより実施された。得られたデータが
第３図にプロツトされており、それぞれの点は３
つ又は４つのラテイスの収縮の平均を表わしてい
る。偏差は全て非常に小さかつた（＜±1.0mm）
ので、示されていない。
見れば分かるように、細胞の数はゲル収縮速度
に対し影響するが、収縮におけるこの差は時間の
関数としてより重要性の小さいものとなつてい
る。ゲルの直径は、ある最低の値以上の濃度で
は、共通の小さな数に接近した。最低の値未満で
は、ゲル収縮速度と細胞数との間の関係は、明ら
かに非直線的であつた。8.1×104細胞を持つラテ
イスは24時間で収縮を開始しなかつた。これらの
細胞希薄なゲルは、実験の期間を通じ、より細胞
稠密なゲルによく遅れた。
実施例 ５ 異なるPDLの細胞の水和コラーゲンラテイスに
おける収縮能力 相異なる集団の二重水準（PDL）の細胞、すな
わち、細胞分裂の数が異つた細胞の水和コラーゲ
ンラテイスにおける収縮能力は、次のようにして
決定された。培養物は実施例１の手順に従つて製
造された、720μｇ/mlプロテイン“Ｒ”を含有す
る水和コラーゲンラテイスから形成された。媒体
は３日間、７日目および10日目に変えられた。
対照培養物は、細胞を含んでいなかつた。更
に、異なるPDL水準の細胞を用いて、一連の実験
が実施された。
集められたデータは第４図にプロツトされてお
り、それぞれの点は３つ又は４つのラテイス収縮
の平均を表わしている。偏差は＜±0.1mmであつ
た。見ればわかるとおり、35番目のPDLの細胞は
19番目のPDLのそれと同様に目的を達成している
が、50番目のPDLの細胞は相応する速度でラテイ
スを収縮せしめることができなかつた。
実施例 ６ 水和コラーゲンラテイスを収縮せしめる細胞の
能力に対するチトカラシンＢの影響 水和コラーゲンラテイスを収縮せしめる細胞の
能力に対する禁止剤チトカラシンＢの影響は次の
ようにして決定された。水和コラーゲンテライス
は実施例１に従つて製造され、570μｇ/mlのプロ
テイン“Ｃ”含量を含んでいた。培養物中におけ
る線維芽細胞（人間の包皮、ストレイン1519、19
番目PDL）濃度は、5.0×105であつた。10.0μ
ｇ／mlチトカラシンＢがそれぞれ培養物に添加さ
れ、そして媒体は４日目と８日目とに変えられ
た。
得られたデータは第５図にプロツトされてお
り、そして見れば分かるとおり、チトカラシンＢ
のこのような濃度は、比較的高い細胞濃度を用い
たときでさえ、ラテイス収縮を完全に防止した。
実施例 ７ コラーゲンラテイス濃度に対するコルセミドの
影響 蛋白質ラテイス収縮に対する禁止剤コルセミド
の影響は次のようにして決定された。水和コラー
ゲンラテイスを含む培養物は実施例１の手順に従
つて製造され、570μｇ/mlのプロテイン“Ｃ”を
含有していた。0.36μｇ/mlコルセミドが、コル
セミドを含まない対照を除いて、これらのそれぞ
れに添加された。同じ数の細胞が被験培養物と対
照培養物の両方に添加された。得られたデータは
第６図にプロツトされている。見れば分かるとお
り、45番目のPDL細胞は19番目のPDL細胞の成績
を凌駕し、一方45番目のPDL未処理細胞は19番目
のPDL未処理細胞に遅れている。コルセミドはラ
テイスの収縮の速度と度合とを制御するのに用い
られ得ることが明らかである。
実施例 ８ 異なるPDLの細胞による、コラーゲンラテイス
収縮に対するチトシンアラビノサイドの影響 異なるPDL水準の細胞による、蛋白質ラテイス
収縮に対するチトシンアラビノサイド1.0μｇ/ml
の影響は、次のようにして試験された。プロテイ
ン“Ｃ”を570μｇ/mlの濃度で含有する水和コラ
ーゲンラテイスを含有する培養物が製造された。
19番目のPDL又は47番目のPDLの人間の包皮の線
維芽細胞、ストレイン1519がチトシンアラビノサ
イドを含まない対照とチトシンアラビノサイドを
含む試験培養物との両方に添加された。得られた
データは第７図にプロツトされている。４７番目
のPDL細胞が数が少ないにもかかわらず、より低
いPDL細胞を凌駕していることがわかる。これら
の実験において、テトシンアラビノサイドは
DNA合成を防止し、そしてそれによつてラテイ
ス中の細胞の数を一定に維持するために使用され
た。
実施例 ９ 人間の包皮の線維芽細胞とケラチン細胞を用い
た皮膚等価物の形成 水和コラーゲンラテイスは実施例１の手順に従
つて製造され、500μｇ/mlのプロテイン“Ｃ”を
含有していた。生検で得られた人間の包皮の線維
芽細胞が、培養皿からEDTAとトリプシンの溶液
によつて除去された。単細胞のサスペンジヨンが
細胞を小球に集めるために遠心分離に付された。
その後、細胞は培養媒体中に再び懸濁せしめら
れ、次いで線維芽細胞が導入された後、水和コラ
ーゲンラテイスの頂部の上に７日間担持された。
３日以内に、ケラチン細胞がラテイス基質に結合
し、そしてケラチン化工程が不浸透性皮膚角質層
の生成に次いで開始した。組織学的観察が電子顕
微鏡によつてなされた。
実施例 10 モルモツトの線維芽細胞とケラチン細胞を用い
た皮膚等価物についての試験管内研究 皮膚生検がモルモツトから取られ、真皮が表皮
から外科的に分離された。真皮は酵素的に構成細
胞に解離せしめられ、構成細胞は粗織培溶皿の上
に置かれそして増殖せしめられた。それぞれの実
験動物からの細胞は、それらの固定が保持される
ように、別個の皿の中で生長せしめられた。組織
は、モルモツトからの線維芽細胞を用いる外は実
施例１の手順に従つて収縮した水和コラーゲンラ
テイスを形成せしめることによつて、試験管内で
製造された。ラテイスの１部は、収縮の後、それ
ぞれの植接用片内のケラチン細胞と線維芽細胞と
がその植接用片の受容体となるべき動物からのも
のであるように、第２の生検から取られた表皮細
胞又はケラチン細胞を用いて実施例９に従つてブ
レート化された。
これらの皮膚等価物の植接用片は実験動物（モ
ルモツト）の背に築き上げられ、そしてそのよう
な植接用片が１週間以内で全ての水準において完
全に統合されたことが見い出された。以下から、
それらは血管化された；真皮の水準では植接用片
のコラーゲン原線維は周囲の宿主組織のそれと織
り合されていた。組織学的領域では、この植接用
片は高い線維芽細胞密度によつておよび偏光顕微
鏡により観察したとき周囲の皮膚のそれと比較し
て減少した配向度によつて特色づけられ得る。表
皮を備えていないこれらの植接用片でさえ、表皮
細胞層（ケチラン細胞）によつて数多くの細胞を
深く完全に被覆した。この層は隣接する宿主の皮
膚のそれと連続していた。皮膚の創傷の収縮は、
丁度自家移植がなされた場合のように、皮膚等価
物の存在によつて禁止されることが同様に明らか
となつた。
工業性適用性 この発明は、皮膚組織の如き、生きている組織
の製造に工業的な適用性を有している。
均等物 当技術分野の熟練者は、ここに記載した特定の
反応剤、触媒、工程、技術等々に対する他の均等
物を認識するかあるいは通常の実験以上のものを
用いずに確かめることができるであろう。このよ
うな均等物は以下の請求の範囲の概念内に包含さ
れるべきことが意図されている。
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