JPS63119754A - 細胞成長特異性を有する人工素子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、表面に接触する生体細胞またはＭＬ　？２ｍ
が、増大した親和性と減少した防御反応とを示すととも
に、それらに細胞成長特異性を与える細胞培養容器、人
工臓器器材等の人工素子に関し、細胞工学、組織培養学
、医学並びに人工臓器学等に跨がる技術分野において利
用されるものである。

（従来の技術） 従来、動物細胞、植物細胞、細菌の細胞、カビ細胞等、
各種生体細胞の増殖・分化・発生等を人工環境下でコン
トロールする細胞培養技術の進歩は、２種類の異なった
技術改良、即ち、細胞と直接接触する培養用容器の改良
と、細胞に栄養を供する培地の改良とに依っている。こ
れらの内、過去におけるアプローチの主流は後者であっ
た。

また従来、生体中に長時間埋め込むことを意図した人工
臓器等の医療用器材は、結合組繊細胞との反応性や親和
性を高め、いわゆる防御反応を下げることを狙い、その
材質や巨視的形状の改良に主力が注がれてきた。

しかして現在使用されている前記培養容器や人工臓器に
おいては、その巨視的な形状（板状、皿状、筒状、等）
も、そしてその材質も極めて多岐に亘るが、それら容器
や器具の表面で、細胞に直接接触し、細胞増殖等に直接
間わる部分の形状は、さほど工夫が凝らされぬま＼に放
置され、殆どが平滑な表面加工を施しであるか、あるい
は、材料本来の平坦な表面形状のま＼であり、表面の微
細構造に着目した改良または研究は未だ提案された例を
見ない。

更に、生体細胞や組織の成長方向を制御する技術、例え
ば、神経突起の成長を方向付ける技術として従来は、細
胞をフィブロネクチン、ラミニン、コラーゲン、ポリオ
ルニチン、ＮＧＦ　（神経成長因子）等の化学物質に沿
って、あるいはそれらの存在部位に向かって成長させる
ことにより配向成長させるというものがあった。この方
法では、これらの化学物質を、個々の分子に方向性を与
えて配置させなければならず、従って、極めて高度の技
術を必要とするばかりか、これらの手法は、化学物質の
不活性化に伴い、特性が失われるという安定性における
難点があった。

また、従来の方法の一つとして、生体組織および細胞で
の電場による電界方向への成長誘引も知られているが、
この方法では電場の生体組織に与える影響が充分解明さ
れていない等の問題があった。

（発明が解決しようとする問題点） 本発明者等は、従来等間断されていた、人工素子の表面
における微細構造がそれと接触する生体組織や細胞に特
異な性質並びに挙動を与えることを解明し、上述の種々
の問題点を解決することに成功し本発明を完成したもの
である。

本発明の第一の目的は、接触する生体細胞ならびに組織
が、増大した親和性と減少した生体防御反応とを示す表
面を具えた人工素子、例えば細胞・組織等の培養容器、
医療用器材等を提供するにある。

本発明の別の目的は、細胞増殖の制御、細胞成長の制御
、更には神経再生の制御を可能にする人工素子を取得せ
んとするものである。

本発明の更に別の目的は、効果の持続性と安全性とを以
って上述の優れた性質を具えた人工素子を安価・容易に
提供するにある。

（問題点を解決するための手段） 上述の目的は、生体組織ないし細胞と接する部分に多数
の微細起伏を刻設した表面を具えてなることを特徴とす
る細胞成長特異性を有する人工素子によって達成される
。

すなわち、本発明によれば、細胞培養用容器あるいは医
療用器材などの人工素子において、生体組１ａ幇よび細
胞と接する表面に微細な起伏を機械的または化学的手法
によって刻設することによって、細胞や組織に対する接
着性や選択性を増し、細胞の増殖を制御することが可能
となるもので、更にこの起伏を条溝となせば、か＼る条
溝に沿って配向した細胞の成長や細胞群の形成を行なわ
せることもできる。

（作　用） 以下本発明の構成をその作用と共に詳述する。

本発明人工素子の生体細胞または組織と接触する表面部
分は、多数の微細起伏によって粗に面をなすか、更に好
ましくは多数の細条溝を有してなる。か＼る細条溝は、
例えば幅、深さともに約０．１　μｍ−１０００μ鴫の
範囲とすることがよく、必ずしも互いに平行である必要
もなく、又、幅深さも均一であったり規則的形状を備え
ている必要もない。すなわち人工素子の材質、形状に従
って微細条溝の深さや幅は上記範囲内で適宜に変化し得
る。条溝断面形状も、Ｖ形、Ｕ形、ばち形等任意に選定
し得る。更に条溝は直線、曲線、波状のいずれの平面形
状でもよく、それらが相互に重なり合って複雑な微細表
面構造を作った場合においても上述の特異的効果を奏す
る。

しかしながら、上記細条溝の形状・配列は、前記範囲内
の幅および深さを具えた直線細条溝を互いに平行に配置
することが最も好ましく、かくすることによって細胞増
殖の制御、細胞成長の制御、さらには神経再生の制御を
可能とするのみならず、生体組織や細胞を容易且つ確実
に、しかも適合性よく所望の方向に成長させ得るという
驚くべき作用が確認された。すなわち、結合組織性細胞
は溝の中に、反対に神経細胞等は畝の上に成長する性質
が顕著に現れ、条溝に沿った配向成長が達成される。

さらに上記性質は人工素子の表面の起伏に生理活性物質
、好ましくは、例えばコラーゲン、ポリーＬ−リジン、
ポリーＬ−オルニチン、ラミニン、フィブロネクチン、
チックプラズマ、ＬＢ囚子（人工脂質膜）およびＮＧＦ
　（神経成長因子）よりなる群から選ばれる物質を被着
することによって更に増強することができる。

上述の微細起伏を刻設する人工素子の材質は特に限定さ
れないが、通常、石英ガラス；硬質ガラス；軟質ガラス
；有機高分子材料、例えばポリスチレン、ポリ塩化ビニ
ル等のプラスチック、コラーゲン、セルロース、寒天、
等；金属；セラミックス、例えばＳｉＮ、、ＢＮ、アパ
タイト等；シリコーンゴム；半導体、例えばＳｉｓ　Ｇ
ｅ％　ＧｅＡｓ、ＩｎＰ　−。

ＧａＳｅ、　ＩｎＳｅ等；より選ばれる少なくとも一種
であり、また生体高分子、例えばコラーゲン板、プラズ
マクロットの表面等も包含する。

本発明人工素子、例えば容器、器材等の全体の巨視的形
態は、特に規定しない。すなわち、板状、皿状、球状、
繊維状、筒状、粒子状等目的、用途に応じて任意に形成
し得るが、少なくとも生体細胞または組織と接する部分
の表面に上記微細起伏を具えることが肝要である。一般
に、細胞培養容器または人工臓器等の医療器材に適合さ
れる人工素子は、平板、円形の皿、太さ１０μｍ１〜１
０ｃｒａの円柱状または繊維状、直径１００μｍ〜１０
ｃｎ＋の球、あるいは外径１０μ１１１〜１０ｃｍの中
空円筒形状等である。

本発明により、かような微細起伏を施した表面には、従
来の未加工の表面には見いだし得なかった細胞増殖性、
細胞接着性ならびに細胞配列制御性等が付加されるとい
う特異な作用を発揮する。

これらの作用は素子の前記材質の相異によって差があり
、また素子の巨視的な形状によってもその程度に変化が
認められる。更に素子と相対する細胞や組織の種類、由
来する動物の種類、性別、年齢等によっても変化するも
のである。しかしながら、本発明素子の作用である表面
の微細起伏構造に伴なって生ずる特異な性質は、上記諸
要因の影響を超えて普遍的且つ顕著であって、本発明の
目的を充分に達成することができる。

第１図は、本発明による微細条溝加工を施した石英ガラ
ス板上における細胞の成長を模式的に示した斜視拡大図
である。

同図において、石英ガラス板ｌ上に断面Ｕ型の直′ｌｆ
Ａ微細条溝２の複数本を互いに平行に刻設し、その面に
生体細胞を接触して培養すれば、神経細胞ＮＣは微細条
溝間の畝３の表面部分に、畝に沿つて神経突起ＡＸを再
生させるが、ダリア細胞などの結合組繊細胞ＧＣは条溝
２の中に条溝に沿って突起を成長させる。

第２図は同様にガラス平板１上に刻設した微細条溝２に
沿って細胞Ｃの成長する様子をイラストして示したもの
である。更に第３図には、プラスチツク繊維１′表面に
繊維軸に平行に刻設した微細条溝２に沿って細胞Ｃが成
長する状態を示している。

本発明人工素子に微細起伏を刻設するには、フォトレジ
スト法、レプリカ法、スクラッチ法、プレス法、エツチ
ング法等を適宜に応用することができる。例えば、第２
図に示したようなガラス皿、ガラス板等の表面の加工に
はフォトレジストを用いたリソグラフィー技術を適用す
ることがよく、また第３図の繊維表面あるいはガラス球
表面並びにガラス管内部表面の微細加工にも同様の方法
を適用することができる。更に、プラスチック皿、繊維
等の加工には主として三つの方法が用いられる。すなわ
ち、（１）上述のリソグラフィー法、（２）リソグラフ
ィーで加工したガラス板のレプリカを取る方法、および
（３）微小な粒子あるいは繊維の切断面により表面にス
クラッチ条溝を付ける方法である。更にまた、シリコン
ゴム、プラスチックチューブ等の表面あるいはコラーゲ
ンを素材とする繊維、プレート、チューブ等の表面の微
細加工はガラスチューブのレプリカをとる方法か、ある
いはスクラッチ法によることがよい。

第４図はレプリカ法によりプラスチック、シリコンゴム
等に微細構造を転写する方法の概要を説明するもので、
微細条溝構造を刻設した金属ないしは石英ガラス板等の
素材による原型４をもって基材１に転写したシリコンゴ
ム等のレプリカ５を本発明人工素子として実用に供する
。

第５図は繊維状の材料の表面に微細条溝を刻設する方法
の一例を示すもので、内壁に軸方向の微細条溝を刻設し
た金属またはガラス円筒を原型４′として、内部に繊維
を通過させ矢印方向に引抜くことにより表面に微細条溝
２を刻設した繊維１′よりなる本発明人工素子が得られ
る。

第６図はスクラッチ法の典型的態様を示すもので、硬質
材料よりなる櫛の歯状または鋸歯状の原型４″′を、そ
れよりも硬度の小さいプラスチック、ゴム、その他各種
材質の板１の表面に圧接して、原型４＃と板１とを矢印
方向に相対運動せしめ、板表面にスクラッチ性の傷を付
けることにより、微細条溝を刻設する。

（実施例） 次に本発明を更に実施例について説明する。

失立■工 成熟マウスのを髄後根神経節細胞を採取し、細胞を単離
するためにトリプシン、コラゲナーゼ等の酵素で処理し
た後、幅０．５μｍ、深さ０．２μｍの微細条溝を刻設
した石英ガラス上および、微細条溝を有しない平滑面の
石英ガラス上でそれぞれ培養した。培養液は、ハムス（
Ｈａｍｓ）　Ｆ−１２培養液とダルベツコ（Ｄｕｌｂｅ
ｃｃｏ）　ＭＥＭ液との１＝１混合液にプロゲステロン
、インシュリン、トランスフェリンを適宜添加したもの
である。培養は、５％の二酸化炭素を含む空気中３７℃
で無血清条件下に２４〜４８時間行なった。培養の結果
、神経突起がガラス板上で再生した状態を第７図および
第８図に示す。

微細条溝を設けない石英ガラス上における神経突起の再
生は第８図に示すように、軸索再生が起こるが、その方
向は一定しない。一方、微細条溝を刻設した（微細条溝
は可視光線の解像限界以下の深さ０．２μｍ、幅０．５
μｍであるため観察されていない）石英ガラス上では、
第７図に示す如く微細条溝の方向に沿って配向した軸索
再生が観察される。この場合、条溝から外れて突起を伸
ばすものも認められるが、その長さは溝方向の突起の２
０％以下に留まる。

ソーダガラス、プラスチック、コラーゲン、アパタイト
等の材料にそれぞれ微細条溝加工を施した素子を用い、
神経細胞の種類、動物の種類、年齢並びに神経周囲組織
の種類を変えて、上記同様の方法で培養した結果、若干
の差異は認められるものの上記同様の結果が観察された
。

皇施五ｌ 受精後１５日口のニワトリ胎児のを髄後根神経節細胞と
を髄中の運動神経細胞を別々に取り出し、幅５μｍ、深
さ２μｍの条溝加工したプラスチック板の溝の両端で同
時に培養した。その結果、を髄後根神経節細胞と運動神
経細胞は条溝に沿って成長し、それらの間で、高い効率
でシナプス結合を形成した。このとき、を髄後根神経節
細胞に加えた電気刺激は運動神経細胞においても検出さ
れ、シナプス結合に特有なしきい値特性が得られた。

（神経繊維、細胞に対する再生促進性）爽施炭１ 本発明の素子のなかで、材質がガラスもしくはプラスチ
ックでその表面に幅２−１０μｍ、深さ０．５−１μｍ
の溝を有するものの上で、成熟マウスのを髄後根神経節
細胞を、実施例１の方法で培養した。但し、本例では、
培地にＦＣＳ　（牛胎児の血清）を加え、８４時間培養
する。を髄後根神経節には神経細胞の他シュワン細胞や
ダリア細胞が含まれ、これらの細胞は培養中に増殖する
。本発明素子の上では神経細胞は９０％以上溝の上で生
育し、逆に神経以外の細胞は９０％以上溝の下で増殖す
る。

この性質の違いから神経細胞と他の細胞をたやすく分離
することができ、それぞれをわけて収集することができ
る。（セルソーターの機能）！血■土 受精後１５日口のニワトリより入手した繊維芽細胞、シ
ュワン細胞、皮膚細胞、骨格筋肉細胞、腎臓細胞、肝臓
細胞、を本発明素子上で培養すると、特異な細胞増殖並
びに細胞配置を示し、素子形状と細胞選択性、細胞成長
刺激性に固有の関係があることが判明した。とりわけ、
細胞配置に特徴のある臓器由来の細胞組織の培養に著明
な効果が認められた。これらの特徴は、また、細胞の由
来する動物の種類、年齢、培養方法によっても太き（左
右された。それぞれの細胞に最適の素子材質、溝形状、
幅、深さなどがあたえられた。（異なる種類の細胞に対
する選択性） 実ｌｌ肌ｉ 石英ガラス板上に幅１０μｌ、深さ３μｍの微細条溝を
所定範囲に刻設し、その範囲外は平滑表面のま＼に残し
た。その上に前記実施例１と同様な方法で細胞培養を行
なったところ、第９図に示す如く、条溝のある部分６に
おいては、神経細胞や結合組織の成長は条溝に沿って起
こるが、条溝加工の施されていない部分７においては、
その成長は一定していなかった。

夫星五工 前記実施例５で用いた石英ガラス板を用い、同実施例と
同様の方法で神経細胞を含まない単一種類の細胞（結合
組繊細胞）の培養を行なった。第１０図に示すごとく、
条溝加工を施した部分６と、施さない部分７とでは、細
胞成長の配向性に顕著な差が生ずるとともに、細胞接着
性、細胞選択性等にも差が見られた。

（発明の効果） 本発明は、細胞培養容器あるいは医療用器材において、
生体組織および細胞と接する表面に微細な起伏構造を機
械的または化学的に刻設することによって、細胞や組織
に対して接着性や選択性を増し、細胞の増殖を制御し、
更にこの起伏を細条溝、特に互いに平行な多数の直線状
細条溝とすれば、細胞や組織を条溝に沿って配向成長さ
せることができ、より性質の優れた培養容器あるいは医
療器材のための素子となすことができる。

本発明素子は、従来公知の手法、すなわち単に培養容器
、医療器材等の表面に成長誘引性の化学物質を塗布した
り、熱や放電によって加工するのではなく、素子表面に
特殊な微細起伏、とりわけ条溝構造の機械的または化学
的加工を施すものであるから、加工技術も比較的簡単容
易であり、また大量生産も可能であるのみならず、安定
した作用、特性を長期間維持することができる。

また、従来の方法の一つとして、生体組織及び細胞での
電場による電界方向への成長誘引も知られているが、こ
の方法では電場の生体組織に与える影響が十分解明され
ていない等の問題があった。

本発明素子は、これらの解明の一助をなす素子として利
用されるとともに、その特性をセルソーターとしても利
用出来る。

とりわけ、本発明素子は、その細胞選択性並びに細胞配
列制御性に特に優れており、特異な細胞配列の必要な臓
器、器官に留置する医用器材の素子たりうる。すなわち
、従来、生体中に長時間埋めこむことを意図した医療用
器材は、生体の、いわゆる防御反応を下げる事を狙い、
材質や形状の改良に主力がそそがれてきていた。しかし
本発明素子は、表面加工の方法によって、特異な細胞群
に特異な調和性を持たせるとともに、素子表面に細胞の
配列を制御する特異な細胞選択性を持っているため、そ
の性質を利用して、各種の医療用機材の表面被覆用の素
子として利用出来る。とりわけ結合組繊細胞との反応性
、親和性が高いので、素子の材質と、溝加工の工夫によ
り、生体防御反応の低い特性を持つ医療用器材として応
用できる。

以上説明したように、本発明は、化学物質や電場を用い
た場合に考えられる様な問題点がなく、簡便にかつ確実
に所望の方向に生体組織及び細胞を育成できるという利
点がある。従って、本発明は特異的なシナプス形成等の
バイオテクノロジーや損傷の治癒促進等の医療、細胞か
らの物質を抽出する新しい方法を提供する等、物質生産
にも応用できるものである。

特に強調しておきたいのは、本発明が、培養容器材質、
大きさ、形状等に制限されず、従来進められていた素材
の材質、形状の改良を損なうことなく、巨視的形状を変
えることなく、むしろ、従来技術のうえに、付は加わる
技術として利用されるということである。本発明による
、微細な表面加工により、現有の培養容器、医療用器材
に、それまでになかった性質であるところの細胞選択性
や、細胞増殖制御性がくわわり、−層性能が高まると考
えられる。さらに、本発明素子は、その元の材質にあま
り規定されず、一種類ないしは多種類の材質よりなる容
器、器材に適応が可能であり、従来考えられなかった性
質をもつ新たな容器、医療用器材が生まれる可能性が高
く、下記の用途において将来性が期待される画期的発明
といえる。

１）人工臓器、生体内に留置する医用器材。とりわけ人
工血管、人工心臓、ペースメーカーの表面素子として、
また、神経縫合、移植用の材料、素子として。

２）バイオチップ、バイオコンピューター。

３）細胞分離装置（セルソーター）、細胞クローン化装
置 ４）　１ｉｌｉ器移植、脳、神経移植用器材

【図面の簡単な説明】

第１図〜第３図は、本発明人工素子上に生体細胞が成長
する状態を説明する、それぞれ拡大斜視図、平面図およ
び斜視図であり、 第４図は本発明人工素子を製作する方法を説明するため
の概要側面図、 第５図および第６図は本発明人工素子の別の具体例を製
作する方法を説明するための斜視図、第７図は本発明人
工素子上に神経突起が再生する状態を示す顕微鏡写真、 第８図は従来公知の人工素子上に神経突起が再生する状
態を示す顕微鏡写真、 第９図および第１０図は本発明人工素子の効果を示すた
めの顕微鏡写真より写生した図である。 １・・・ガラス板　　　　　１′・・・プラスチック繊
維２・・・微細条溝　　　　　３・・・畝４．４’、４
“・・・原型　５・・・レプリカ特許出願人　　東　京
　大　学　長 代理人弁理士　　杉　　村　　暁　　六回　　　弁理士
　　　杉　　　村　　　興　　　作第１図 ｌ し 図面の浄書°（内二゛につ更なしゝ 第７図　　　　　　（訂正図） 第８図 手　　続　　補　　正　　書（方式） 昭和６２年　２月　２日 特許庁長官　　　黒　　１）　明　　雄　　殿１、事件
の表示 昭和６１年特許願第２６５５６４号 ２、発明の名称 細胞成長特異性を有する人工素子 ３、補正をする者 事件との関係　　特許出願人 東京大学長　森　亘 ４、代理人 ′Ｎ　。 （１）明細書第２０頁第１８行および第２０行の「顕微
鏡写真」の次に、「より写生した図」をそれぞれ挿入す
る。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、生体組織ないし細胞と接する部分に多数の微細起伏
   を刻設した表面を具えてなることを特徴とする細胞成長
   特異性を有する人工素子。 ２、微細起伏が細条溝である特許請求の範囲第１項記載
   の人工素子。 ３、細条溝が幅約０．１〜１０００μｍ、深さ約０．１
   〜１０００μｍの寸法を有する特許請求の範囲第２項記
   載の人工素子。 ４、細条溝が互いに平行である特許請求の範囲第３項記
   載の人工素子。 ５、微細起伏表面に更に生物活性物質を被着した前記特
   許請求の範囲各項のいずれかに記載の人工素子。 ６、生物活性物質がコラーゲン、ポリ−Ｌ−リシン、ポ
   リ−Ｌ−オルニチン、ラミニン、フィブロネクチン、チ
   ックプラズマ、人工脂質膜（ＬＢ膜等）、神経成長因子
   よりなる群から選ばれる特許請求の範囲第５項記載の人
   工素子。 ７、前記人工素子が石英ガラス、硬質ガラス、軟質ガラ
   ス、有機高分子材料、金属、セラミックス、シリコーン
   ゴム、半導体よりなる群から選ばれた少なくとも一種の
   物質を含んでなる前記特許請求の範囲各項のいずれかに
   記載の人工素子。