DE19725318A1 - Zellkulturvorrichtung zur 3D-Kultivierung - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft eine Zellkulturvorrichtung zur 3D-Kultivierung mit einem Kulturraum, der verschiedene Polymere oder andere biokompatible Materialien enthält und der sich durch eine lokale, sterile Immobilisierungen von unterschiedlichen biologischen Materialien, vorzugsweise Proteinen, in definierten Strukturen auszeichnet. Durch die Lokalisation dieser biologischen Immobilisierungen entsteht die Möglichkeit der heterogenen Kulturführung von Zell- und Gewebeverbänden bzw. die ortsgerichtete Konzentration spezifischer Zellbestandteile. Damit wird die erfindungsgemäße Zellkulturvorrichtung der in vivo Situation gerecht. Diese zeichnet sich durch die Kompartimentierung auf zellulärer Ebene sowie durch die lokale Gewebestrukturierung auf Organebene aus. Mit dieser strukturellen Differenzierung sind evolutionär wesentliche Funktionen höherer Lebewesen möglich geworden.

Für die Kultivierung von Säugerzellen wurden in den letzten zwei Jahrzehnten verschiedene Kultursysteme entwickelt. Die bisherigen in-vitro Kultursysteme auf der Basis von Kulturplatten und -flaschen sind, durch die auftretende Nährstofflimitierung und die diskontinuierliche Substratzufuhr, bestenfalls für die Kultur von Spheroiden, Monolayern oder Zellsuspensionen geeignet. Für die batchweise oder kontinuierliche Massenkultivierung von transformierten Suspensionszellen haben sich gerührte Systeme und Airliftreaktoren bewährt [1-8]. Adhärente Zellinien lassen sich in diesen Bioreaktortypen durch den Einsatz von Mikrocarriern und Enkapsulierungsverfahren kultivieren. Mit zunehmendem Erfolg werden Hohlfaserbioreaktoren für die Kultivierung von Hybridomzellen sowie anderen genetisch modifizierten Säugerzellinien eingesetzt [9-14]. Keramikmatrix- und Fließbettreaktoren vervollkommnen das Bild der möglichen Varianten [15-17]. Aufgrund verschiedener Mängel hat sich bisher keines der Systeme als universelles Säugerzellfermentationssystem durchsetzen können. So werden in Airliftfermentoren und Rührreaktoren im batchweisen Betrieb in der Regel nur geringe Zelldichten erreicht. Aspekte wie Scherkrafteinwirkungen, Produktakkumulation, pH-Wert und unzureichende Sauerstoffversorgung sind hierfür ausschlaggebend [18]. Bei Hohlfasersystemen, in Keramikmatrixreaktoren und im Fließbettreaktor gestaltet sich die visuelle Kontrolle der Lebensfähigkeit der Zellen problematisch. Das neuentwickelte Kultursystem Tecnomouse® vereinigt die Vorteile konventioneller Hohlfaserbioreaktoren mit einer Miniaturisierung der Zellkulturräume und einer Optimierung der Begasung über eine Membran, so daß hier erstmals optimierte Kulturbedingungen bei gewebeähnlichen Zelldichten erhalten werden [19].

Primärzellkulturen wurden bisher üblicherweise in zweidimensionalen Kultursystemen (Platten, Flaschen) durchgeführt. Mit Hilfe kleiner zweidimensionaler Kultursysteme können auch Stoffwechselprozesse untersucht und modelliert werden [20]. Dabei kann durch Verwendung von semisoliden Medien wie Collagen ein Mikromilieu eingestellt werden [21]. Prozesse wie Chemotaxis, Phagozytose und Gewebepenetration sind aber ohne Zell-Zell- Kontakte nicht möglich, so daß man hier auf dreidimensionale Kulturen angewiesen ist. Der Einsatz von Hochzelldichtebioreaktoren für die Kultur von Primärmaterial ist bisher nur in Einzelfällen beschrieben worden [22,23,24].

Die Entwicklung "allgemein biokompatibler" Materialien ist gekennzeichnet durch eine Vielzahl von Untersuchungen, wobei aufgrund der Komplexität der Wechselwirkungen praktikable Lösungen meist mittels "trial-and-error"-Strategien gefunden wurden [25]. Die Biokompatibilität wird oft in Studien mit Modellproteinen oder -zellen charakterisiert (für Reviews s. [26]). Bevorzugte biokompatible Materialien haben meist hydrophile, mehr oder minder flexible Oberflächen [25-29], z. B. erzeugt durch heterogene Pfropfcopolymerisationen [27]. Diese können je nach Struktur (Hydrophilie, Ladung) von Protein oder Zelle "inert" sein (keine Adsorption [27,28]); aber auch spezifische Bindungen von Proteinen oder Zellen - dann an im Vergleich zum Ausgangsmaterial wesentlich vergrößerter spezifischer Oberfläche - können erzielt werden [28,29]. Konsequenterweise sind in komplexen biologischen Medien, z. B. Blut, auch sehr hydrophobe ("niederenergetische", z. B. fluorierte) Polymeroberflächen "biokompatibel" [26].

Beim Design von synthetischen Oberflächen mit spezifischen Erkennungs- /Wechselwirkungsfunktionen (incl. deren Biokompatibilität) gibt es eine Reihe von experimentellen Ansätzen, z. B. durch Immobilisierung von spezifischen Peptiden bzw. Sacchariden [25,30-32]. So läßt sich eine Bindung von sog. RGD-Peptiden an Polymeroberflächen - mit nutzbarer spezifischer Wirkung - nach konventionellen chemischen Verfahren realisieren (Bindung an Carboxylgruppen mittels aktivierter Ester [31] oder mit Carbodiimid [32]), wobei Spacer-Kettenlängen von C2 [32] bis C6 [31] zwischen Oberfläche und Peptid offensichtlich für eine effektive Wechselwirkung mit Zellen bereits hinreichend sind. Aber auch Polymerbeschichtungen [33] oder Pfropfpolymerstrukturen [34], jeweils in Kombination mit kovalenter Bindung von RGD- Peptiden können zur Präparation biospezifischer Oberflächen genutzt werden.

Für Affinitätstrennungen - vor allem von Proteinen - gewinnen Prozesse mit oberflächenfunktionalisierten porösen Membranen (incl. Hohlfaser-Membranen) zunehmendes Interesse. Die Hauptmotivation für diese Entwicklungen besteht in der Möglichkeit der gerichteten Anströmung der trennspezifischen Gruppen (Liganden/Rezeptoren) und der damit möglichen drastischen Verbesserung der Effektivität (Geschwindigkeit, Ausnutzung der Kapazität) des Prozesses im Vergleich zur Chromatographie mit Partikeln [35-40]. Inzwischen sind von vielen Firmen (z. B. Knauer [35,40], Sartorius [36], Millipore oder Amicon) Membranmaterialien für die "Membranchromatographie" oder "Perfusionschromatographie" kommerziell verfügbar bzw. in Entwicklung. Allen Beispielen ist gemeinsam, daß bislang die Affinitätstrennung nicht in eine UF- oder MF-Membrantrennung integriert wurde; typischerweise werden makroporöse Filter eingesetzt. Die Arbeiten von Staude et al. [39] mit asymmetrischen UF-Membranen stellen eine Ausnahme dar; allerdings wird auch da die UF-Trennfunktion der Membran nicht genutzt. Der Weg der nachträglichen Modifizierung, zumindest zur "Feineinstellung" der Spezifität, wird in den meisten Fällen genutzt. Die Anwendungsflexibilität für Membranen mit einer reaktiven Gruppierung (z. B. Epoxy) zur anschließenden Ligandenimmobilisierung kommt dabei vorteilhaft zur Geltung [35,36,39-41]. Von besonders großem Interesse sind Modifizierungen, die z. B. Tentakel-Affinitätsstrukturen in mikroporöse Membranen einführen (hohe Kapazität bezogen auf das Membranvolumen), wie es am Beispiel der elektronenstrahl-induzierten Pfropfpolymer-Modifizierung von MF- Membranen aus Polyethylen demonstriert wird [41].

Die Photomodifizierung von Polymeroberflächen findet neben etablierten Varianten wie der Druckfarbenhärtung oder der Photolithographie zunehmend auch unkonventionellere Anwendungen: von der gezielten Beeinflussung der Oberflächenhydrophilie/phobie-Balance [42] bis zur topologisch gerichteten Festphasensynthese [43]. Je nach Komplexität der Fragestellung sowie gewünschten Strukturen kommen Varianten der gezielten Polymerdegradation/oxidation, der Photofunktionalisierung mittels photoreaktiver Polymere oder der Photopfropfung mit photoreaktiven Substanzen zum Einsatz.

Der vielleicht attraktivste Vorzug der Lichtanregung von Funktionalisierungsreaktionen wird in Arbeiten zur mittels Photolithographie topologisch gerichteten Immobilisierung von Biomolekülen auf Oberflächen im Mikrometermaßstab deutlich [44-47]. Dabei ist jüngst erstmals über definierte Arrays aus zwei verschiedenen Proteinen bei gleichzeitiger Minimierung unspezifischer Adsorption publiziert worden [47]. Aufgrund der Lichtaktivierung von Chromophoren, die sich isoliert an der Substratoberfläche [44-49] oder in Monoschichten [47] befinden, ergibt sich eine Beschränkung auf zweidimensionale Strukturen.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine neuartige Zellkulturvorrichtung (ZKV) zu entwickeln, die eine Immobilisierung von Zellpopulationen eines Gewebeverbandes auf biologischen Materialien erlaubt. Die Aufgabe wurde erfindungsgemäß durch eine ZKV zur 3D-Kultivierung gelöst, die aus einem Zellkulturraum (ZKR), Pumpen für die Nährstoffperfusion und aus der Begasung, aus Schlauchsystemen, Polymeren, semisoliden Medien, biologischen Materialien und einem Belichtungsstand besteht und die dadurch gekennzeichnet ist, daß der Zellkulturraum als Bioreaktionsraum für den funktionellen Erhalt von Zellbestandteilen ausgestaltet ist, die polymeren oder semisoliden Medien zur Kultivierung von heterogenen Zell- und Gewebeverbänden ausgebildet sind und die biologischen Materialien an die in die Vorrichtung integrierten polymeren bzw. semisoliden Membranen gebunden werden.

Die polymeren oder semisoliden Medien zur erfindungsgemäßen Kultivierung von heterogenen Zell- und Gewebeverbänden sind unter zell- und gewebetypischen Lebensbedingungen ausgestaltet und die biologischen Materialien lokal, geordnet und kontrolliert an die in die Vorrichtung integrierten polymeren bzw. semisoliden Membranen gebunden und dadurch immobilisiert. Die lokale Bindung der biologischen Materialien - wie Eiweiße, Fette oder Glycane - führt durch spezifische Wechselwirkung erfindungsgemäß zur Immobilisierung von lebensfähigen Zellsubpopulationen eines Gewebeverbandes auf den biologischen Materialien. In dem Bioreaktionsraum erfolgt die Bindung von Zellbestandteilen - wie Organellen, Enzym komplexen und DNS/RNS-Eiweiß-Komplexen - an die immobilisierten biologischen Materialien durch spezifische Wechselwirkungen.

Die erfindungsgemäße ZKV enthält neben unterschiedlichen Polymeren und/oder anderen biokompatiblen Werkstoffen eine Anordnung zur kontinuierlichen Nährstoffdurchströmung und regulierten Begasung. Die Bindung der biologischen Materialien in der ZKV erfolgt - lokal und steril - chemisch an solchen primärfunktionalisierten polymeren bzw. semisoliden Membranen, die durch kontrollierte photoinitiierte heterogene Pfropfcopolymerisation erzeugt werden.

Innerhalb des Kulturraumes der ZKV können überraschenderweise durch lokale Immobilisierung simultan verschiedene Kulturen unter identischen Bedingungen gehalten werden. Diese Kulturen enthalten identische oder heterogene Zell- und Gewebeverbände. Die Materialien der ZKV werden unter Reinstraumbedingungen in einer inerten Atmosphäre, positionierbar, mikroskopierbar und UV-belichtbar erzeugt.

Die erfindungsgemäße Zellkulturvorrichtung stellt eine Kombination von bekannten und von neuen Elementen dar. Sie besteht aus einem Kulturraum und aus einer Anordnung, die mindestens die kontinuierliche Nährstoffdurchströmung und die regulierte Begasung zum Erhalt von organtypischen Kulturen erlaubt. Der Kulturraum enthält verschiedene Polymere oder andere biokompatible Materialien, die eine kontinuierliche Nährstoffversorgung, Begasung und Schlackeabfuhr gewährleisten. Dieser Kulturraum zeichnet sich im Gegensatz zu bekannten Zellkulturvorrichtungen erfindungsgemäß durch lokale, sterile Immobilisierungen von unterschiedlichen biologischen Materialien, vorzugsweise Proteinen, in definierten Strukturen aus (Fig. 1). Durch die Lokalisation dieser biologischen Immobilisierungen in einem entsprechenden Muster innerhalb des Kulturraumes entsteht die Möglichkeit der heterogenen Kulturführung von Zell- und Gewebeverbänden bzw. die ortsgerichtete Konzentration spezifischer Zellbestandteile. Damit wird die erfindungsgemäße Zellkulturvorrichtung der in vivo Situation gerecht. Diese zeichnet sich durch die Kompartimentierung auf zellulärer Ebene sowie durch die lokale Gewebestrukturierung auf Organebene aus. Mit dieser strukturellen Differenzierung sind evolutionär wesentliche Funktionen höherer Lebewesen möglich geworden.

Die erfindungsgemäß angewandte Photo-Pfropfcopolymerisation hat neben den allgemeinen Vorzügen photoinitiierter Reaktionen (milde äußere Bedingungen, hohe Spezifität, relative geringe - steuerbare - Eindringtiefe in Festkörper, Potential zur Flächenmodifizierung, topologische Adressierbarkeit, relativ preiswerte Variante) als weitere Vorteile die hohen Bruttoquantenausbeuten (Umsatzgeschwindigkeiten) und eine überragende Flexibilität hinsichtlich der Auswahl von Monomeren und Reaktionsbedingungen und damit möglicher Oberflächenstrukturen (chemisch und morphologisch). In den Arbeiten von Rånby et al. [48-49] wurde dieses große Potential - bis zu Möglichkeiten der technischen/industriellen Umsetzung - erstmals systematisch aufgezeigt. Trotzdem sind die Anwendungen bislang im wesentlichen auf Filme und Fasern, d. h. typischerweise auf die Modifizierung der äußeren Oberfläche von einfachen Formkörpern, beschränkt. Allerdings wird bereits deutlich, daß sich funktionelle Gruppen, die für die Ligandenimmobilisierung geeignet sind (Carboxyl [48] bzw. Epoxy [49]), auf diesem Wege in verschiedene "inerte" Materialien einführen lassen. Modifizierungen von makroporösen Membranen beschränken sich auf Varianten, die der UV-Härtung von Coatings entlehnt sind. D.h., die Membranen werden mehr oder weniger dick beschichtet und diese Schicht wird vernetzend (u. U. auch unter Pfropfung auf die MF-Unterlage) photo­ polymerisiert [50].

Auch biokompatible bzw. -spezifische Strukturen auf dichten Filmen lassen sich mit (Pfropf)-Photopolymerisationen erzeugen [33,34]. Besonders interessant ist das jüngste Beispiel von Hubbell et al. [34], wo in einer Photo-Copolymer-Netzwerkstruktur eine biokompatible (aus Polyethylenglycol-methacrylat) und eine funktionalisierbare Komponente (aus Acrylsäure) genutzt werden, um eine biospezifische Oberfläche zu erzeugen: Die Zelladhäsion wird induziert durch ein an Acrylsäure-Carboxylgruppen kovalent gebundenes Peptid, während die Polyethylenglycol-Strukturen unspezifische Wechselwirkungen mit der Kulturlösung unterdrücken [34]. Einfache laterale Photopfropfpolymer-Strukturierungen sind durch Maskenbelichtung oder mit Lasern realisierbar [51]. Durch Kombination eines photolithographischen Schrittes (mittels Arylazid- Photolyse) zur topologisch gerichteten Fixierung von Initiatorstrukturen und anschließende Pfropfpolymerisation sind Modifizierungen von Polymeroberflächen auch mit Mikrometer- Auflösung möglich [52].

Photomodifizierungen an asymmetrischen UF-Membranen beschränken sich bislang auf eher empirische Versuche zur Photopfropfung, wobei die Arbeiten von Nyström et. al. [53] zur Hydrophilierung von Polysulfon-UF-Membranen ein instruktives Beispiel dafür ist, daß die äußerst sensible Mikroporenstruktur von UF-Membranen durch unselektive UV- Anregung aufgrund der UV-Polymerdegradation sehr leicht zerstört werden kann. Dagegen sind erfindungsgemäß selektive Photofunktionalisierungen an UF-Membranen unter Erhalt der UF-Membranporenstruktur realisiert worden.

Zur Immobilisierung von Cytokinen liegen - abgesehen von ELISA-Anwendungen - nur vereinzelte Kenntnisse vor, so z. B. der Einschluß von IL-2 in eine Photopolymer-Matrix und die anschließende verzögerte (durch die Matrix "kontrollierte") Freisetzung [54].

Im erfindungsgemäßen Verfahren werden definierte Oberflächenfunktionalisierungen überraschenderweise an Polymermaterialien, besonders Membranen, realisiert, die neben einer allgemeinen "Biokompatibilität" (unter Gewebekulturbedingungen) nach Immobilisierung immunologisch wirksamer Liganden (Cytokine) eine Biospezifität (-aktivität) der Materialoberfläche bewirken. Weiterhin bleibt die (passive) Barrierefunktion der UF- Membran erhalten; und letztlich ist es möglich, via Funktionalisierung laterale Strukturierungen der Anordnung von Cytokinen im Reaktor vorzunehmen.

Das erfindungsgemäße Verfahren besteht in einer Primärfunktionalisierung von für die in vitro Zellkultivierung in Bioreaktoren etablierten Membranen mit Hilfe der photoinitiierten heterogenen Pfropfcopolymerisation auf der Grundlage kontrollierbarer radikalischer Reaktionen von radikalisch polymerisierbaren Monomeren, vorzugsweise Acrylsäure- Derivate, die entweder in gelöster Form oder in der Gasphase vorliegen.

Dabei erfolgt die Primärfunktionalisierung durch die Masken-vermittelte lokale, selektive photochemische Anregung eines adsorbierten Polymerisationsinitiators mit UVB- bzw. UVA-Licht, vorzugsweise zwischen 300-400 nm, mit anschließender kontrollierter Pfropfcopolymerisation von Acrylsäure-Derivaten an Wasserstoff-abstrahierbaren festen bzw. semisoliden Polymermaterialien unter Sauerstoffausschluß (Fig. 2).

Der erfindungsgemäße lokale Eintrag von geeigneten funktionellen Gruppen wird über die entsprechende Kopplungschemie zur anschließenden kovalenten Immobilisierung von Biomolekülen sowie zur Einstellung von Grenzflächeneigenschaften an der polymeren Matrix genutzt.

Die möglichen Anordnungen der gesamten Zellkulturvorrichtung sind in Fig. 3 dargestellt.

Überraschenderweise konnte die erfindungsgemäße ZKV erfolgreich für die Simulation der lokalen Aktivierung von IL-2-Rezeptor positiven T-Lymphozyten eingesetzt werden. Ein derartiger Prozeß modelliert die Situation im frisch transplantierten Spenderorgan. Auch dort läuft der Prozeß ausschließlich lokal in Aktivierungszentren innerhalb des Organs ab. Stärke und Charakter des Prozesses sind für die Überlebenschancen des Organs ausschlaggebend (vergleiche Beispiel 1). Damit kann die erfindungsgemäße ZKV für die in vivo ähnliche Modellierung lokal im Organismus ablaufender Differenzierungs- und Entwicklungsprozesse eingesetzt werden. Offensichtlich ist, daß mit der ZKV mindestens folgende strikt lokal ablaufende Vorgänge und Strukturen modelliert werden können:

• - Entwicklung von B-Zell-Keimzentren
• - Erythrozytenneogenese auf Stromazellen bzw. Knochenmarkbestandteilen
• - Prozesse der Reproduktionsbiologie wie Spermatogenese
• - Differenzierung Tumor-infiltrierender Zellen
• - Tumoröse Entartung
• - direktes Wirkstoffscreening an Zellen.

Des weiteren konnte die erfindungsgemäße ZKV überraschenderweise für die zelltypische lokale Immobilisierung von Zellbestandteilen wie Mitochondrien, die auf diese Art und Weise ein Bioreaktionskompartiment bilden, eingesetzt werden (vergleiche Beispiel 2). Daraus wird offensichtlich, daß die ZKV als ein Bioreaktionsraum bzw. Kombination mehrerer Bioreaktionsräume mindestens für die zellfreie Biosynthese von Proteinen, Erbinformation, Lipiden und Glycanen, für die Untersuchung lokaler Energieumwandlungen sowie zur Untersuchung der Funktionalität von Zytoskelettstrukturen der Zelle geeignet ist.

Unter Acrylsäure-Derivaten werden, einschließlich der Acrylsäure selbst, die Ester der Acrylsäure sowie der Methacrylsäure wie Acrylsäuremethylester, N-Acryloxysuccinimid, Methacrylsäureglycidylester, 2-Aminoethyl-methacrylat-hydrochlorid und Hydroxyethyl­ methacrylat verstanden, unter biologische Materialien Biomoleküle, die vorzugsweise Peptide wie RGD-Peptide, Proteine wie Enzyme oder Antikörper Lipide wie Prostaglandine, Oligosaccharide und Oligonucleotide enthalten.

Heterogene Zell- und Gewebeverbände sind unterschiedliche Zellen bzw. Gewebe derselben Spezies, unterschiedlicher Spezies und unterschiedlicher Arten.

Unter kontrollierter photoinitiierter heterogener Pfropfcopolymerisation wird verstanden: Die Pfropfcopolymerisation wird über Initiator und Belichtungszeit/-intensität (Initiierungsschritt), Monomerkonzentration (Kettenwachstum), Polymerisationsregulatoren wie Benzochinone (Kettentransfer) sowie Radikalquencher wie Thiole (Kettenabbruch) kontrolliert.

Polymermaterialien: Feste Polymermaterialien beinhalten Membranen als Flachmembranen und Hohlfasern, Filme und glatte, micro- und macroporöse Formkörper, die photochemisch über H-Abstraktion aktivierbar sind wie Polysulfon, Polycarbonat, Polyester, Polyacrylnitril, Polypropylen, Polyethylen, Nylon (Polyamid) und Cellulose - einschließlich ihrer Derivate, z. B. Methylcellulose, Nitrocellulose, Celluloseacetat.

Polymerisationsinitiator: Als Polymerisationsinitiatoren werden hier die Photoinitiatoren Benzophenon oder Benzophenon-4-carbonsäure verwendet.

Semisolide Medien: Semisolide Medien beinhalten Gele und hochviskose Polymerlösungen, die zum einen künstlicher Natur, vorzugsweise aus Polymeren wie Methylcellulose, oder biologischer Herkunft - wie Gelatine und durch Gerinnung bzw. durch biologische Prozesse der Bildung extrazellulärer Matrix hergestellte semisolide Medien - sind.

Unter Zellbestandteilen sind alle Bestandteile von Säuger-, Pflanzen - oder Insektenzellen sowie Protozoen in der in der jeweiligen Zelle vorliegenden Form, Art, Struktur oder Funktion, wie z. B. Organelle, Enzymkomplexe, Histon-DNA-Komplexe zu verstehen.

Die Erfindung soll anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert werden.

Ausführungsbeispiele Beispiel 1

Auf Membranen wurden Spots mit Polyacrylsäure erzeugt. An den Carboxygruppen wurden über chemische Aktivierung anti-CD25-Antikörper (anti-IL-2-Rezeptor-AK) sowie humanes y-Globulin immobilisiert. Durch Kultivierung von stimulierten (IL-2) T-Lymphozyten auf diesen Membranen in einer perfundierbaren, begasbaren und mikroskopierbaren Zellkulturvorrichtung wurden die Zell-AK-Wechselwirkungen durch Fluoreszenzmikroskopie und Färbung studiert. Dabei zeigt sich, daß stimulierte T-Lymphozyten mit den polymergebundenen anti-CD25-Antikörper im Gegensatz zu γ-Globulin wechselwirken und sich somit auf der Polymeroberfläche fixieren lassen.

Beispiel 2

Es erfolgte eine lokale Immobilisierung von Lipidstrukturen, unter anderem durch die Umsetzung von Cholesteryl-chloroformiat an aminierten Oberflächen, die zu lipophilen Wechselwirkungen zwischen Polymeroberfläche und der äußeren Membran von Mitochondrien führte. Die erfolgreiche Immobilisierung von Mitochondrien ist einerseits durch klassische Färbeverfahren der mitochondrialen DNA mit Acidinorange oder Ethidiumbromid bzw. durch den Mitochondrien-selektiven Vitalfarbstoff Rhodamin 123 und andererseits durch enzymatische Umsetzung Mitochondrien-eigener Alkalischer Phosphatase mit para-Nitrophenylphosphat oder Naphthol As-Bi Phosphate nachgewiesen worden.

Beispiel 3

Für die in Beispiel 1 und 2 beschriebenen Immobilisierungen wurde an Polysulfon-UF- Membranen Polyacrylsäure gepfropft. Durch die kontrollierte Polymerisation ließen sich unterschiedliche Kettenanzahl und Kettenlängen einstellen (siehe Tabelle).

Es ließ sich zeigen, daß verlängerte Belichtungszeiten zu einer Erhöhung der Kettenanzahl und eine Erhöhung der Monomerkonzentration zu längeren Polymerketten des Propfpolymers Polyacrylsäure führten.

Daran kovalent immobilisierte Alkalische Phosphatase wurde nach Waschen über ihre Aktivität (Substratreaktion von para-Nitrophenylphosphat zu Nitrophenol an der Membranoberfläche) bestimmt und der überraschende Einfluß von Kettenlänge und Kettenanzahl (summarisch als Pfropfgrad) festgestellt (siehe Abbildung).

Es ließ sich zeigen, daß sich mit dem Verfahren zur Erzeugung der Zellkulturvorrichtung offene tentakelartige Oberflächenstrukturen herstellen lassen, die zur effektiven Immobilisierung von Biomolekülen unter Erhalt ihrer biologischen Funktion geeignet sind.

Die Figuren zeigen:

Fig. 1 Prinzipieller Aufbau eines Zellkulturraumes (ZKR) der Zellkulturvorrichtung (ZKV),

Fig. 2 Aufbau des Belichtungsstandes der Zellkulturvorrichtung,

Fig. 3 Mögliche Anordnungen der Zellkulturvorrichtung.

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Claims (10)

1. Zellkulturvorrichtung (ZKV) zur 3D-Kultivierung bestehend aus einem Zellkulturraum (ZKR), Pumpen für die Nährstoffperfusion und aus der Begasung, Schlauchsystemen, Polymeren, semisoliden Medien, biologischen Materialien und einem Belichtungsstand, dadurch gekennzeichnet, daß der Zellkulturraum als Bioreaktionsraum für den funktionellen Erhalt von Zellbestandteilen ausgestaltet ist, die polymeren oder semisoliden Medien zur Kultivierung von heterogenen Zell- und Gewebeverbänden ausgebildet sind und die biologischen Materialien an die in die Vorrichtung integrierten polymeren bzw. semisoliden Membranen gebunden werden.

2. Zellkulturvorrichtung (ZKV) nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die polymeren oder semisoliden Medien zur Kultivierung von heterogenen Zell- und Gewebeverbänden unter zell- und gewebetypischen Lebensbedingungen ausgestaltet sind und die biologischen Materialien lokal, geordnet und kontrolliert an die in die Vorrichtung integrierten polymeren bzw. semisoliden Membranen gebunden und dadurch immobilisiert werden.

3. Zellkulturvorrichtung nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die lokale Bindung der biologischen Materialien - wie Eiweiße, Fette oder Glycane - durch spezifische Wechselwirkung zur Immobilisierung von lebensfähigen Zellsubpopulationen eines Gewebeverbandes auf den biologischen Materialien führt.

4. Zellkulturvorrichtung nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß in dem Bioreaktionsraum die Bindung von Zellbestandteilen - wie Organellen, Enzymkomplexen und DNS/RNS-Eiweis-Komplexen - an die immobilisierten biologischen Materialien durch spezifische Wechselwirkungen erfolgt.

5. Zellkulturvorrichtung nach Anspruch 1 bis 4, die dadurch gekennzeichnet, daß sie neben unterschiedlichen Polymeren und/oder anderen biokompatiblen Werkstoffen eine Anordnung zur kontinuierlichen Nährstoffdurchströmung und regulierten Begasung enthält und die Bindung der biologischen Materialien in der ZKV lokal und steril erfolgt.

6. Zellkulturvorrichtung nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Bindung biologischer Materialien chemisch an solchen primärfunktionalisierten polymeren bzw. semisoliden Membranen erfolgt, die durch kontrollierte photoinitiierte heterogene Pfropfcopolymerisation erzeugt werden.

7. Zellkulturvorrichtung nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß innerhalb eines Kulturraumes der ZKV durch lokale Immobilisierung simultan verschiedene Kulturen unter identischen Bedingungen gehalten werden.

8. Zellkulturvorrichtung nach Anspruch 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß diese Kulturen identische Zell- und Gewebeverbände enthalten.

9. Zellkulturvorrichtung nach Anspruch 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß diese Kulturen heterogene Zell- und Gewebeverbände enthalten.

10. Zellkulturvorrichtung nach Anspruch 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Materialien der ZKV unter Reinstraumbedingungen in einer inerten Atmosphäre, positionierbar, mikroskopierbar und UV-belichtbar erzeugt werden.