DE3938632C1

DE3938632C1 - Culturing living animal cells - using natural or synthetic polymer substrate vacuum deposition coated with e.g. nitride of Gp=III element

Info

Publication number: DE3938632C1
Application number: DE19893938632
Authority: DE
Inventors: Adelbert Prof. Dr.Dr. 8046 Garching De Bacher; Harald Dr.Dr. 8000 Muenchen De Mueckter
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1989-11-21
Filing date: 1989-11-21
Publication date: 1991-03-14
Anticipated expiration: 2009-11-22

Abstract

A natural or synthetic polymer substrate is dry coated by vacuum deposition of C, Si(O2), oxides, nitrides, carbides of or pure elements of main gp 3 elements, pref. to a thickness of 5-500 nm. The deposited layer is pref. modified by a plasma treatment i.e. a glow discharge under reduced gas pressure. The substrate can be ceramic, glass or other inorganic materials, a Petri dish, a synthetic or natural material, esp. tensioned in a frame of a sterilisable plastic. A predetermined area of the substrate is coated using a suitable mask. USE/ADVANTAGE - For culturing living animal cells; a cheap material which can be produced fully automatically in small quantities.

Description

2.1. Technical problem of the invention

Die Erfindung betrifft das im Anspruch 1 angegebene Verfahren zur Kultur von lebenden tierischen Zellen auf natürlichen und synthetischen Polymersubstraten. Die Ansprüche 2 bis 11 betreffen Ausgestaltungen dieses Verfahrens. Die Ansprüche 12 und 13 betreffen eine Vorrichtung zur Durchführung dieses Verfahrens.The invention relates to the method specified in claim 1 for the culture of living animal cells on natural and synthetic polymer substrates. Claims 2 to 11 concern configurations of this method. Claims 12 and 13 relate to an apparatus for performing this Procedure.

Methoden zur Kultivierung tierischer Zellen werden in der zell- und molekularbiologischen Forschung sowie zur Stoffproduktion, z. B. von Pharmaka, eingesetzt. Von Ausnahmen abgesehen, wachsen tierische Zellen in Kultur nur in engem Kontakt mit geeigneten Oberflächen, an die sie sich anheften können. Historisch erfolgte die Kultivierung zunächst auf hochgereinigten Glasoberflächen und später auf chemisch oder physikalisch behandelten Kunststoffoberflächen. Als Haftungsvermittler bei der chemischen Modifikation (Naßverfahren), wie sie vor allem zur Anzucht von Primärkulturen eingesetzt wird, dienen z. B. Bestandteile der extrazellulären Matrix (Liao NS, St John J, Du ZJ, Cheung HT; Exp. Cell Res. 171: 306-20 [1987] Yavin E, Yavin Z; J. Cell Biol. 62: 540-6 [1974]), fein-disperse Fällungen (Bergstrom AE; Ger. Offen. DE 23 50 050 v. 18. Apr. 1974) oder synthetische Polymere (Minora N, Aiba S, Fujiwara Y; Jpn. Kokai Tokkyo Koho JP 63/283 A2 v. 5. Jan. 1988) und -kondensate (Schmidt H, Scholze H; Ger. Offen. DE 27 58 414 v. 12. Jul. 1979), die auf das Substrat aufgebracht werden. Diese Stoffe sind kostspielig und können bei bestimmten biochemischen Fragestellungen (z. B. Proteinisolierung) störend wirken. Anorganische Materialien für Zellkulturen sind bislang weniger beachtet worden, obwohl Verfahren zur Aufbringung dünner Schichten seit langem bekannt sind (vgl. Neumüller O-A, Römpps Chemie-Lexikon, 8. Aufl., Bd. 1, S. 325, Franckh′sche Verlagsbuchhandlung, Stuttgart, 1979). Zur physikalischen Modifikation gehört die Aktivierung durch Hochfrequenz (rf)-Plasma (Chilkoti A, Ratner BD; Polym. Mater. Sci. Eng. 59: 258-62 [1988]). Ein besonderes Interesse besteht an der Züchtung von Zellen auf mikroporösen Folien für Cokulturexperimente und Stoffproduktion. Dafür eignen sich z. B. Folien aus (modifizierter) Cellulose oder synthetischen Polymeren und Polykondensaten. Auch hier erfolgt eine Anheftung der Zellen ohne Vorbehandlung nur in Ausnahmefällen.Methods for cultivating animal cells are used in cell and molecular biological research and for fabric production, e.g. B. of pharmaceuticals used. With some exceptions, animal cells grow in culture only in close contact with suitable surfaces that you can attach. Historically, cultivation initially took place on highly purified Glass surfaces and later on chemically or physically treated plastic surfaces. As an agent in the chemical modification (wet process), especially as is used for the cultivation of primary cultures, z. B. Components of the extracellular Matrix (Liao NS, St John J, Du ZJ, Cheung HT; Exp. Cell Res. 171: 306-20 [1987] Yavin E, Yavin Z; J. Cell Biol. 62: 540-6 [1974]), finely dispersed precipitations (Bergstrom AE; Ger. Offen. DE 23 50 050 from Apr. 18, 1974) or synthetic polymers (Minora N, Aiba S, Fujiwara Y; Jpn.Kokai Tokkyo Koho JP 63/283 A2 of Jan. 5, 1988) and condensates (Schmidt H, Scholze H; Ger. Offen. DE 27 58 414 of Jul. 12, 1979) referring to the Substrate are applied. These substances are expensive and can be used in certain biochemical Issues (e.g. protein isolation) are disruptive. Inorganic materials less attention has been paid to cell cultures, although methods of application are thinner Layers have been known for a long time (see Neumüller O-A, Römpps Chemie-Lexikon, 8th ed., Vol. 1, p. 325, Franckh'sche Publishing house, Stuttgart, 1979). Activation is part of the physical modification by radio frequency (rf) plasma (Chilkoti A, Ratner BD; Polym. Mater. Sci. Eng. 59: 258-62 [1988]). There is a particular interest in the breeding of Cells on microporous foils for culinary experiments and fabric production. Suitable for that z. B. films of (modified) cellulose or synthetic polymers and polycondensates. Here too, cells are only attached without pretreatment in exceptional cases.

2.2. the solution of the problem

Für die Erzeugung von Oberflächen, die sich zur Anheftung und Züchtung von tierischen Zellen eignen, werden bei dem hier zugrunde liegenden Verfahren dünne Schichten anorganischer Materialien (z. B. Kohle, Silizium, Siliziumdioxid) durch Verdampfung unter reduziertem Druck auf handelsübliche Polymerträger aufgebracht (Trockenverfahren). Als Polymerträger können z. B. beliebig geformte Artikel aus Plexiglas oder anderen Kunststoffen verwendet werden, insbesondere Petrischalen. Weiterhin kann die Beschaffenheit des Trägers vielfältig variiert werden. Dazu geeignet sind Polymere, z. B. Teflon, Polyvinylchlorid, Polyacrylnitril, Polyurethan, Polystyrol, Polycarbonat, etc. Auch natürliche Polymere, z. B. Cellulose und ihre chemischen Derivate, können verwendet werden. Als Substrate können aber auch anorganische Feststoffe, z. B. Gläser, sowie Materialien aus Keramik und anderen Verbundwerkstoffen benutzt werden.For the creation of surfaces that are suitable for the attachment and cultivation of animal cells are suitable, thin layers of inorganic become in the process on which this is based Materials (e.g. coal, silicon, silicon dioxide) through evaporation under reduced Pressure applied to commercially available polymer substrates (dry process). As a polymer carrier can e.g. B. any shaped article made of plexiglass or other plastics used especially petri dishes. Furthermore, the nature of the carrier can be varied can be varied. Polymers, e.g. B. Teflon, polyvinyl chloride, polyacrylonitrile, polyurethane, Polystyrene, polycarbonate, etc. Also natural polymers, e.g. B. cellulose and its chemical Derivatives can be used. However, inorganic substrates can also be used Solids, e.g. B. glasses, as well as materials made of ceramics and other composite materials will.

Als Träger ebenfalls geeignet sind Folien, insbesondere auch solche mit mikroporösen Eigenschaften, z. B. Dialysefolien aus modifizierter Cellulose oder aus synthetischen Polymeren in Analogie zu den vorstehend genannten Materialien. Dabei kann die Porengröße in weiten Bereichen variiert werden, um speziellen Anforderungen zu genügen. Dadurch erhält man die Möglichkeit, den Zellrasen durch die Folie hindurch mit Nährstoffen zu versorgen oder Zellprodukte durch die Membran hindurch zu gewinnen und auf einfache Weise abzutrennen. Die Permeabilitätseigenschaften der verwendeten Membran werden durch die o. g. Behandlung nicht beeinträchtigt.Films are also suitable as supports, especially those with microporous properties, e.g. B. dialysis films made of modified cellulose or synthetic polymers in Analogy to the materials mentioned above. The pore size can vary widely Areas can be varied to meet special requirements. This gives you the Possibility to supply the cell lawn with nutrients through the film or cell products to win through the membrane and to separate easily. The Permeability properties of the membrane used are determined by the above. treatment not affected.

Für die Konstruktion von Reaktoren zur Zellzüchtung oder zur Stoffproduktion mit Hilfe gezüchteter Zellen können große Oberflächen platzsparend durch gewickelte Membranschichten unter Einhaltung eines ausreichenden Abstandes zwischen den Schichten realisiert werden. Die Ausnutzung der verfügbaren Oberfläche kann weiter gesteigert werden durch Züchtung der Zellen auf beiden Seiten einer doppelseitig beschichteten Membran. Es besteht ferner die Möglichkeit, durch Verwendung semipermeabler Träger Nährstoffe an die Zellen heranzuführen oder (Stoffwechsel-)Produkte aus dem Medium durch die Membran hindurch abzuziehen.For the construction of reactors for cell cultivation or for material production with the help of cultivated ones Cells can save large surfaces with space-saving membrane layers can be realized with a sufficient distance between the layers. The utilization of the available surface can be increased further by breeding of the cells on both sides of a double-sided coated membrane. There is also the Possibility to introduce nutrients to the cells by using semi-permeable carriers or to withdraw (metabolic) products from the medium through the membrane.

Nach dem Aufbringen der Aufdampfschicht im Hochvakuum kann das Material in üblicher Weise sterilisiert werden durch Behandlung mit Gas, Strahlung, Wärme, Heißdampf oder anderen geeigneten Verfahren. Die Aufdampfschicht ist unlöslich in Wasser und allen gebräuchlichen Lösungsmitteln. Eine Kontamination der Zellkulturansätze durch Bestandteile der aufgebrachten Schicht(en) ist deshalb nicht zu erwarten.After the application of the vapor deposition layer in a high vacuum, the material can be applied in the usual way are sterilized by treatment with gas, radiation, heat, superheated steam or other suitable Method. The vapor deposition layer is insoluble in water and all common ones Solvents. Contamination of the cell culture batches by components of the applied Layer (s) is therefore not to be expected.

Die Dicke der Aufdampfschicht kann in weiten Bereichen variiert werden. Eine Schichtdicke von wenigen nm ist für die Anheftung der Zellen bereits ausreichend. Es können aber auch wesentlich dickere Schichten aufgedampft werden. Zwischen der aufgebrachten Schichtdicke und der Haftfestigkeit der Zellen besteht eine direkte Beziehung, d. g. d. die Zellen mit zunehmender Schichtdicke fester und besser haften. Dadurch ergibt sich die Möglichkeit zu einer abgestuften Steuerung der Zelladhäsion. Bei Verwendung dünner Schichten lassen sich die Zellen sehr leicht wieder von der Unterlage ablösen. Dies ermöglicht, intakte und unbeschädigte Zellen ohne die übliche chemische Vorbehandlung mit Enzymen oder Chelatoren durch einfaches Abwaschen mit Medium oder Pufferlösungen schonend zu ernten. Auf diese Weise können Suspensionen abgelöster Zellen mit unveränderter Zelloberfläche erhalten werden. The thickness of the vapor deposition layer can be varied within a wide range. A layer thickness A few nm is sufficient for cell attachment. But it can also much thicker layers are evaporated. Between the applied layer thickness and the adhesive strength of the cells is directly related, i.e. G. d. the cells with increasing Layer thickness is stronger and adheres better. This creates the possibility of one graded control of cell adhesion. When using thin layers, the Detach cells very easily from the surface. This enables intact and undamaged Cells without the usual chemical pretreatment with enzymes or chelators Easy washing with medium or buffer solutions to harvest gently. In this way suspensions of detached cells with unchanged cell surface can be obtained.

Die Eigenschaften der Aufdampfschicht können zusätzlich verändert werden durch eine Plasmabehandlung, z. B. durch elektrische Glimmentladung bei niedrigem Druck, wodurch ebenfalls die Haftfestigkeit der Zellen für die Kultivierung verändert werden kann.The properties of the vapor deposition layer can also be changed using a Plasma treatment, e.g. B. by electrical glow discharge at low pressure, whereby the adhesive strength of the cells for cultivation can also be changed.

Die Verwendung geeigneter Masken bei der Bedampfung ermöglicht die Erzeugung von Mustern beliebiger Gestalt und Komplexität, d. g. d. die Zellen nur auf den bedampften und nicht auf den angrenzenden unbehandelten Arealen wachsen können. Damit können Zellanordnungen mit genau vorgegebener Topologie hergestellt werden. Es besteht weiterhin die Möglichkeit, mehrere Schichten, z. B. metallische und nichtmetallische, übereinander und/oder nebeneinander aufzubringen. Durch mehrfache Bedampfung mit unterschiedlichen Materialien und Masken lassen sich dadurch auch komplexe Anordnungen von Arealen mit alternierenden, elektrisch leitenden bzw. isolierenden Eigenschaften erzeugen, wie sie beim Aufbau gedruckter Schaltungen in der Elektronik üblich sind. Durch entsprechende Wahl der Masken kann die Topologie und Größe der unterschiedlich behandelten Areale beliebig variiert werden. Inbesondere können definierte Anordnungen im Mikrometer-Maßstab erzeugt werden. Auf diese Weise können die Zellen in genau definierten Bezirken gezüchtet werden, die die Möglichkeit zu gerichtetem Wachstum und modifizierbarer elektrischer oder chemischer Kopplung benachbarter Zellen oder Zellgruppen bieten. Ferner können zelluläre Netzwerke aufgebaut werden, die in definierter räumlicher Beziehung stehen und elektrisch gekoppelt sind. Damit ergibt sich eine neuartige Möglichkeit zur Steuerung und Analyse der Signalverarbeitung in zellulären Systemen oder Netzwerken.The use of suitable masks during the vapor deposition enables the generation of Patterns of any shape and complexity, i. G. d. the cells only on the steamed and cannot grow on the adjacent untreated areas. This allows cell arrangements with a precisely specified topology. The persists Possibility of multiple layers, e.g. B. metallic and non-metallic, one above the other and / or to apply side by side. Through multiple steaming with different materials and masks can be used to create complex arrangements of areas with alternating, generate electrically conductive or insulating properties, such as when building printed Circuits in electronics are common. By choosing the appropriate mask, the Topology and size of the differently treated areas can be varied as desired. In particular Defined arrangements can be created on a micrometer scale. To this Ways the cells can be grown in well-defined areas, which is the possibility for directed growth and modifiable electrical or chemical coupling of neighboring Offer cells or cell groups. Cellular networks can also be built that have a defined spatial relationship and are electrically coupled. This results in a new way to control and analyze signal processing in cellular Systems or networks.

Durch Aufdampfen unterschiedlicher Materialien mit verschiedenen Schichtdicken auf benachbarten Arealen lassen sich Bezirke mit unterschiedlichen zytophilen Eigenschaften herstellen. Damit lassen sich Mischpopulationen von Zelltypen kultivieren, die unterschiedliche Ansprüche an die zytophilen Eigenschaften des Substrates stellen, z. B. Epithelzellen und Fibroblasten. In einem ersten Schritt wird dazu zunächst die anspruchsvollere Population angezüchtet, die auf dem heterogen beschichteten Substrat nur auf den maximal zytophilen Arealen wächst. In weiteren Schritten werden dann weniger zytophile Bezirke sukzessive mit weniger anspruchsvollen Zelltypen besetzt. Mit dieser Art von Mischpopulationen lassen sich "zweidimensionale Gewebe" darstellen.By vapor deposition of different materials with different layer thicknesses on neighboring ones Areas can be created with different cytophilic properties. This allows mixed populations of cell types to be cultivated that have different requirements to the cytophilic properties of the substrate, e.g. B. epithelial cells and fibroblasts. In In a first step, the more demanding population is raised, which is based on the heterogeneously coated substrate only grows on the maximally cytophilic areas. In others Steps will then gradually become less cytophilic districts with less demanding ones Cell types occupied. With this type of mixed populations, "two-dimensional Tissue ".

advantages

Im Gegensatz zu herkömmlichen Techniken zur Oberflächenbehandlung für die Zellkultur sind die verwendeten Materialien bei dem hier beschriebenen Verfahren preiswert und in geringen Mengen erforderlich. Die Herstellung kann in einem vollständig automatisierten Arbeitsgang erfolgen (Trockenverfahren). Es ist möglich, vollständig transparente Folien mit minimalen Lichtstreu-Eigenschaften und beliebig wählbaren Permeabilitätseigenschaften für die Zellkultur einzusetzen. Für die Konstruktion von Durchflußreaktoren bietet die Verwendung von dünnen beschichteten Folien den Vorteil einer platzsparenden, kompakten Anordnung in Wickeltechnik, insbesondere wenn die Beschichtung doppelseitig erfolgt. Die Unlöslichkeit der verwendeten Bedampfungsmaterialien erleichtert die Abtrennung und Isolierung der gewünschten Produkte. Das Wachstum der Zellen kann durch den Einsatz geeigneter Masken bei der Bedampfung auf genau vorgegebene Bezirke beschränkt werden, die sich durch die zytophilen Eigenschaften der aufgedampften Schicht vom unbehandelten Substrat abgrenzen. Auf diese Weise lassen sich zweidimensionale Netzwerke mit vorgegebenen topologischen Eigenschaften erzeugen.Contrary to conventional surface treatment techniques for cell culture the materials used in the process described here are inexpensive and low Quantities required. Manufacturing can be done in a fully automated process (Dry process). It is possible to have completely transparent films with minimal light scattering properties and selectable permeability properties for cell culture. For the construction of flow reactors the use of thin offers coated films have the advantage of a space-saving, compact arrangement using winding technology, especially if the coating is double-sided. The insolubility of the used Vaporization materials facilitate the separation and isolation of the desired ones Products. The growth of the cells can be achieved by using suitable masks during the vaporization be restricted to precisely specified districts, which are characterized by the cytophils Distinguish the properties of the vapor-deposited layer from the untreated substrate. To this Two-dimensional networks with predetermined topological properties can be created in this way produce.

2.3. application areas

Die Anwendung der vorstehend beschriebenen Techniken umfaßt zahlreiche Einsatzmöglichkeiten in Biotechnologie, pharmazeutischer Produktion und wissenschaftlicher Grundlagenforschung:There are numerous possible uses for the techniques described above in biotechnology, pharmaceutical production and basic scientific research:

⚫ Cultivation of animal cells that contribute to their multiplication and growth on attachment are dependent on suitable surfaces, with the possibility of adherence to control and harvest these cells gently,
⚫ Production of substances by animal cells in membrane reactors with completely permeable, semi-permeable or impermeable membranes,
⚫ generation of cell ensembles with precisely specified topological properties, especially networks with the ability to conduct excitation and compartments of cells for the directed mass transfer.

3rd embodiment

Um epitheliale Zellen auf einer semipermeablen Unterlage anzuzüchten, wird auf eine Celluloseacetatfolie durch einen Lichtbogen unter reduziertem Druck eine dünne Kohleschicht von ca. 50 nm aufgebracht. Die beschichtete Folie wird in Phosphatpuffer (PBS) gelegt und zusammen mit einem passenden zweiteiligen Kunststoffrahmen (vgl. Zeichnung in Abschn. 5) autoklaviert. Die sterile Folie wird durch Ineinanderfügen der beiden Rahmenteile gespannt, mit Kulturmedium beschickt (DMEM mit 10% fötalem Kälberserum) und in eine Petrischale gesetzt. Unter sterilen Bedingungen werden nun Zellen der menschlichen Adenocarcinomzellinie HT29 in einer Dichte von ca. 70 000 Zellen/cm² auf die Folie ausgesät. Die Zellen wachsen in den nächsten 96 h zu einem dichten Rasen (Quasi-Monolayer) aus. Die Ausbildung der dichten Zellschicht kann durch Messung eines elektrischen Widerstands ("transepithelialer Widerstand") über die Folie verfolgt werden. Bei geeigneter Wahl von Porosität und Ausschlußgrenze der semipermeablen Trägerfolie kann ein Stofftransport über die Folie gemessen werden.In order to grow epithelial cells on a semipermeable surface, a Cellulose acetate film through an arc under reduced pressure a thin layer of carbon 50 nm applied. The coated film is placed in phosphate buffer (PBS) and together with a suitable two-part plastic frame (see drawing in section 5) autoclaved. The sterile film is stretched by joining the two frame parts together Culture medium loaded (DMEM with 10% fetal calf serum) and placed in a petri dish. The cells of the human adenocarcinoma cell line are now under sterile conditions HT29 sown onto the film in a density of approx. 70,000 cells / cm². The cells grow in the next 96 h to a dense lawn (quasi monolayer). The formation of the dense Cell layer can be measured by measuring an electrical resistance ("transepithelial resistance") are tracked across the slide. With a suitable choice of porosity and exclusion limit In the semipermeable carrier film, mass transport over the film can be measured will.

Claims

1. A method for the culture of living animal cells on natural and synthetic polymer substrates, characterized in that the substrate by evaporating coal, silicon (dioxide) or oxides, nitrides, carbides or pure substances of elements of III. Main group of the periodic table dry coated under reduced pressure.

2. The method according to claim 1, d. G. d. a layer of material from 5 to 500 nm thick manufactures.

3. The method according to claim 1, d. G. d. the evaporated layers through a Modified plasma treatment (electrical glow discharge at reduced gas pressure).

4. The method according to any one of claims 1 to 3, d. G. d. with the help of suitable masks exactly defined areas are steamed, which allows an exact definition of the growth areas allow.

5. The method according to any one of claims 1 to 4, d. G. d. the dimensions of the coated and uncoated areas can be varied down to the micrometer scale.

6. The method according to any one of claims 1 to 4, d. G. d. with changing masks Multiple vapor deposition alternating between electrically conductive and insulating layers are generated, with metallic and non-metallic layers one above the other and and / or applied side by side.

7. The method according to any one of claims 1 to 6, d. G. d. with suitable masks Multiple vapor deposition zones can be created with different layer thicknesses.

8. The method according to any one of claims 1 to 7, d. G. d. a polymer carrier as the substrate used, especially thin films and commercially available culture vessels.

9. The method according to claim 8, d. G. d. a semipermeable membrane is used as the film.

10. The method according to any one of claims 1 to 7, d. G. d. components as a substrate Ceramic, made of glasses or other inorganic materials used.

11. The method according to claim 8, d. G. d. one as polymers synthetic substances or natural Fabrics used.

12. Device for performing the method according to at least one of the claims 1 to 11, i.e. G. d. it consists of a coated polymer film that intertwines joined frames that fit exactly into each other, is clamped.

13. The apparatus of claim 12, d. G. d. the frames are made of sterilizable plastic.