CN116121174A - 一种鸡胚胎成纤维细胞体外三维培养和分离的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种鸡胚胎成纤维细胞体外三维培养和分离的方法，属于细胞培养技术领域。本发明的培养方法包括以下步骤：(1)将鸡胚胎成纤维细胞复苏后至少传代培养一代，获得细胞悬液，离心，丢弃上清液，加入GelMA水凝胶溶液，重悬细胞，得到混合液；(2)将混合液用紫外光源照射，获得鸡胚胎成纤维细胞‑GelMA水凝胶复合物；(3)将鸡胚胎成纤维细胞‑GelMA水凝胶复合物转移至培养皿中，加入培养液，细胞培养7‑9d；(4)细胞培养结束后，弃去培养液，加入胶原蛋白II酶消化处理5‑10min，离心，收集细胞沉淀。本发明建立的鸡胚胎成纤维细胞三维培养体系更好的模拟了细胞体内生存环境，可以实现鸡胚胎成纤维细胞在体外立体培养介质中的快速增殖，更具有研究价值。

Description

一种鸡胚胎成纤维细胞体外三维培养和分离的方法
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，具体涉及一种鸡胚胎成纤维细胞体外三维培养和分离的方法。
背景技术
鸡胚胎成纤维细胞来源于胚胎中胚层，具有易分离、易培养、增殖能力强、适应能力强且性状稳定等优点，是一种优良的细胞实验模型，其应用非常广泛。比如由于具备病毒受体等特点，该细胞被广泛用于病毒学领域的研究，是一种疫苗生产的重要资源。常见的几种传染病如传染性法氏囊病、新城疫病和马立克病的疫苗都可通过鸡胚胎成纤维细胞生产。良好的耐受性让鸡胚胎成纤维细胞能够进行基因转染、微注射、表达基因工程产物等试验。在上世纪末，科学家驯化出一种可以连续传代的鸡胚胎成纤维细胞系DF-1，和原代鸡胚胎成纤维细胞相比，这种细胞具有更强的生长潜力且没有肿瘤基因。总之，鸡胚胎成纤维细胞由于诸多良好的特性，被广泛应用于动物病毒研究、疫苗研制、癌症研究等诸多领域，是生命科学领域重要的生物材料。
传统的鸡胚胎成纤维细胞培养方法是平面二维的培养，但这种方法培养的细胞贴附在塑料或玻璃平皿上，不能重现细胞在体内组织复杂环境的真实状态。为了解决这个问题，我们着力于体外立体培养鸡胚胎成纤维细胞。近年来，随着生物技术的进步，对于细胞三维培养的研究越来越多，它是将细胞置于人工创造的立体环境中，帮助细胞在体外构建的特定微环境中更好的生长，维持其立体形态和功能，并与周围环境和邻近细胞群相互作用，交流信息。目前细胞三维培养技术已经被用于药物筛选、类器官构建和人造肉等等研究方向。
三维培养的出现得益于细胞生物学、生物物理和生物化学工程之间的发展和新方法、新材料的应用，甲基丙烯酰胺基明胶(简称GelMa)是一种半合成水凝胶，由明胶与甲基丙烯酸酐反应获得，使得明胶侧链上大量的活跃氨基酸基团被甲基丙烯酸酐中的甲基丙烯酰基取代。被改性的明胶由于甲基丙烯酰基的存在获得了光交联的特性，在加入光引发剂并在紫外光照射的条件下可以发生交联反应进而形成立体的稳定的外形。GelMa水凝胶性质稳定、制备方法简单且安全无毒，在再生医学、组织工程和药物传输等领域被广泛应用。
目前已有利用GelMa进行三维细胞培养的报道，例如中国专利CN 113667147A、CN114058040A等。但是，由于不同类型细胞的大小不同、营养和环境需求也各不相同，在进行三维培养时对支架材料的性能要求也存在差异；此外，利用GelMa进行三维细胞培养，培养结束后如何将细胞与GelMa进行有效的分离，这也是细胞三维培养所面临的技术难点之一。
发明内容
针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种鸡胚胎成纤维细胞体外三维培养和分离的方法。本发明可以实现鸡胚胎成纤维细胞在体外立体培养介质中的快速增殖。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供一种鸡胚胎成纤维细胞体外三维培养和分离的方法，包括以下步骤：
(1)将鸡胚胎成纤维细胞复苏后至少传代培养一代，获得细胞悬液，离心，丢弃上清液，加入GelMA水凝胶溶液，重悬细胞，得到混合液，混合液中的细胞密度为5×105/mL～5×106/mL；
(2)将混合液用紫外光源照射，获得鸡胚胎成纤维细胞-GelMA水凝胶复合物；
(3)将鸡胚胎成纤维细胞-GelMA水凝胶复合物转移至培养皿中，加入培养液，细胞培养7-9d；
(4)细胞培养结束后，弃去培养液，加入胶原蛋白II酶消化处理5-10min，离心，收集细胞沉淀。
优选的，步骤(1)中，将复苏后的鸡胚胎成纤维细胞用含体积百分含量12％胎牛血清、体积百分含量1％青霉素-链霉素的RPMI-1640培养基重悬，放入39℃、含体积含量5％CO2的培养箱中培养，当培养密度达到70～80％时进行传代。
优选的，步骤(1)中，加入的GelMA水凝胶溶液的浓度为4～9wt％。不同浓度GelMA水凝胶的孔径大小不同，浓度越大孔径越小。
优选的，步骤(2)中，紫外光源照射的时间为10-20s。光固化时间影响水凝胶孔径大小，一般来说，固化时间越久，获得水凝胶孔径越小，又因为紫外照射时间太久会增加细胞变异的可能，故紫外照射时间10～20s为宜。
优选的，步骤(3)中，所述培养液为含有体积百分含量12％胎牛血清、体积百分含量1％青霉素-链霉素的RPMI-1640培养基。
优选的，步骤(3)中，细胞培养的条件为：39℃、含体积含量为5％CO2的培养箱中培养。
优选的，步骤(4)中，所加入的胶原蛋白II酶的浓度为2000U/ml。
优选的，步骤(4)中，消化处理的条件为：39℃、含体积含量为5％CO2的培养箱消化5～10分钟。
本发明的有益效果：
(1)本发明首次基于鸡胚胎成纤维细胞的特点，利用特定浓度的GelMa构建了体外三维培养体系；并且本发明还研究发现该水凝胶可以通过胶原蛋白II酶消化，这有利于从三维支架上分离培养后的细胞。
(2)相对于二维平面培养，本发明建立的鸡胚胎成纤维细胞三维培养体系更好的模拟了细胞体内生存环境，可以实现鸡胚胎成纤维细胞在体外立体培养介质中的快速增殖，更具有研究价值。
附图说明
图1.培养装置说明图。其中图A和图B为商用固化光源和固化环使用示意图，图C和图D为本方法所制备细胞水凝胶复合物。
图2.显微镜观察DF-1在不同浓度GelMA水凝胶培养状态。DF-1细胞分别在5wt％、7wt％和9wt％三种浓度的GelMA水凝胶三维培养1小时、1天、3天、5天、7天和9天，水凝胶制备光固化时间都为15s，初始细胞量都为2.5×106左右。标尺为200μm。
图3.三维培养的细胞分离。其中图A为DF-1细胞在5wt％浓度、固化15s的GelMA水凝胶上培养7天明场图，放大倍数为20×；图B为图A中细胞水凝胶复合物加入2000U/mL的胶原蛋白Ⅱ酶消化6分钟后明场图，放大倍数为20×；图C为图B中细胞水凝胶复合物中分离出的细胞接种在平面培养皿10分钟后的明场图，放大倍数为10×；图D为图C中的细胞培养4小时后的明场图，放大倍数为10×。标尺为200μm。
图4.PKH26着色的DF-1跟踪。2D组为PKH26着色后DF-1平面培养3天，3D组为使用PKH26着色后DF-1在5wt％浓度、光固化15s的GelMA水凝胶上三维培养3天。标尺为200μm。
图5.GelMA水凝胶三维培养DF-1细胞EDU染色。DF-1在5wt％浓度、光固化15s的GelMA水凝胶上三维培养1天、3天和5天后，对细胞水凝胶复合物EDU染色并统计增殖率。标尺为200μm。
图6.不同浓度GelMA水凝胶SEM表征。如图分别为冷场扫描电镜观察3wt％、5wt％、7wt％和9wt％浓度的GelMA水凝胶的表面图像，水凝胶制备光固化时间都为15s，放大倍数为2000×。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
如前所述，为了在体外获得大量的鸡细胞用于后续的研究，本发明的目的是提供一种鸡胚胎成纤维细胞体外立体培养和分离的方法及其应用，该方法可以实现鸡细胞在体外立体培养介质中快速增殖，为后续研究奠定基础。所述方法为：先利用GelMA水凝胶对鸡成纤维细胞重悬，所述GelMA水凝胶的浓度为4～9wt％，然后利用培养基培养，最后用胶原蛋白Ⅱ酶分离细胞。本发明实例使用的鸡胚胎成纤维细胞为DF-1细胞系。具体说明如下：
步骤一，细胞培养：复苏DF1细胞并用体积百分含量12％胎牛血清、1％青霉素-链霉素的1640培养基重悬，放入39℃含体积含量5％CO2的培养箱中培养，当培养密度达到70～80％时进行传代。第一次复苏后细胞至少再传代一次才能用于三维培养。
步骤二，GelMA水凝胶溶液制备：GelMA水凝胶由甲基丙烯酸酐与明胶制备获得，称量适量GelMA冻干粉加入1640基础培养基，70℃水浴加热溶解，使用0.22μm筛子过滤除菌，加入溶解液1/8体积的LAP光引发剂，最终得到GelMA水凝胶的浓度为4～9wt％，混匀后放入39℃温度下避光暂存，以上试剂可以通过商业购买获得。若其他条件相同，不同浓度GelMA水凝胶的孔径大小不同，浓度越大孔径越小。光固化15s条件下4～9wt％浓度的GelMA水凝胶微观表征见图6。对于鸡成纤维细胞，浓度在5wt％为最佳。
步骤三，细胞和GelMA水凝胶混合液制备：将步骤一传代后获得的细胞悬液放入离心机，室温下1000g离心5分钟，丢弃上清液，加入步骤二所得GelMA水凝胶溶液，重悬细胞混匀备用，细胞密度大约为5×105/mL～5×106/mL。其中细胞密度过稀，可能会导致细胞之间缺乏联系而凋亡，细胞密度过大则可能导致部分细胞没有足够的伸展空间，无法及时获取足够的营养和氧气而凋亡。
步骤四，光固化：将步骤三得到的混合液滴到光滑、干净的透明防粘膜上，使用405nm紫外光源照射15s，即可获得细胞和GelMA水凝胶复合物。需要注意的是，光固化时间影响水凝胶孔径大小，一般来说，其他条件相同时固化时间越久，获得水凝胶孔径越小，又因为紫外照射时间太久会增加细胞变异的可能，故紫外照射时间10～20s为宜。
步骤五，加培养基：用镊子或其他工具将步骤四细胞水凝胶复合物小心转移至24孔板培养皿中，每孔加入1mL体积百分含量12％胎牛血清、1％青霉素-链霉素的1640培养基，放入39℃含体积含量为5％CO2的培养箱中培养。
步骤六，更换培养基：实施步骤五12小时后，将细胞水凝胶复合物转移到新的24孔板培养皿中，每孔加入1mL体积百分含量12％胎牛血清、1％青霉素-链霉素的1640培养基，继续放入39℃含体积含量为5％CO2的培养箱中培养。
实施步骤六24～48小时后，待观察到大部分细胞在水凝胶支架上伸展开后，换液时用PBS缓冲液清洗，步骤为：更换培养基之前，丢弃废液，每孔加入1mL PBS缓冲液，轻微晃动培养皿1分钟，再丢弃废液，重复2次。
步骤七，三维培养的细胞分离：实施步骤六中的培养皿丢弃培养基，用PBS缓冲液清洗3遍，在培养皿中加入2000U/mL胶原蛋白Ⅱ酶没过胶体，放入39℃含体积含量为5％CO2的培养箱消化5～10分钟，取出培养皿，用1mL枪头吹打液体，检查水凝胶是否充分消化，加入体积百分含量12％胎牛血清的1640培养基终止消化，室温下1000g离心10分钟，丢弃废液，即可获得三维培养中分离出的细胞。
对分离出的细胞进行增殖能力测定，结果表明：采用上述方法分离的细胞能够很好的保持细胞增殖能力，与初始鸡胚胎成纤维细胞相比，其增殖能力与之相当甚至有所提高。
对于三维细胞的分离，发明人在研发过程中曾尝试多种不同的酶及其组合，一方面，要能实现对胶体支架的降解，另一方面，还要保证不会对三维培养的细胞的活性产生影响。最终发现，采用2000U/mL胶原蛋白Ⅱ酶进行处理的效果最优。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或者按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。
实施例1：以制备细胞培养肉为目的的鸡成纤维细胞三维培养流程
细胞培养肉是指利用多孔支架在体外三维培养细胞，应用本发明的体系可以获得快速增殖并能形成致密结构的细胞培养肉，不同于其他实验目的的参数，以制备五个DF-1细胞三维培养模型为例，其中初始细胞密度约2.5×106/mL，GelMA水凝胶浓度5wt％，光固化时间15s。具体步骤为：
1、将DF-1细胞传代至六厘米培养皿，密度达到95％～100％后，更换新鲜的含12％胎牛血清、1％青霉素-链霉素的1640培养基，放入39℃，5％CO2的培养箱中培养两个小时。取出后丢弃上清液，贴壁加入1mL PBS缓冲液，轻轻晃动培养皿让PBS充分清洗皿底，丢弃上清液，重复两次，加入1mL 0.25％胰酶消化液，放入培养箱中静置1分钟，消化充分后取出，加入1mL含12％胎牛血清1640培养基终止消化。
2、将细胞悬液转移到离心管中，混匀后取10μL悬液用细胞计数板进行细胞计数，按比例吸取含3×106左右细胞量的细胞悬液，转移到另一个干净离心管，室温下1000g离心5分钟，丢弃上清液，留取细胞沉淀备用。
3、取75mg GelMA冻干粉放入棕色避光玻璃瓶，加入RPMI-1640培养基，放入70℃水浴加热20分钟，期间摇晃瓶子使粉末充分溶解，配制浓度为5wt％的GelMA水凝胶。使用0.22μm筛子过滤，取1mL过滤后的液体转移到干净离心管，加入125μL光引发剂苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚磷酸锂(简称LAP)，混匀后避光放入39℃暂存备用。
4、提前准备超净台，紫外照射10分钟，防粘膜和塑料固化环在75％(体积分数)乙醇浸泡消毒，风干后备用，防粘膜放在紫外光源平面，取五个固化环倒置放在防粘膜上。取1mL步骤3得到的GelMA水凝胶溶液重悬步骤2得到的细胞沉淀，混匀后将混合液滴在固化环表面，每个环加入200μL混合液。液体浸润环表面，打开紫外光源开关，405nm紫外光照射15s。固化环以及紫外灯源如图1A和1B所示。
5、用镊子夹取固化环支架将细胞水凝胶复合物转移至24孔培养板，加入1mL含12％(体积百分含量)胎牛血清、1％(体积百分含量)青霉素-链霉素的RPMI-1640培养基，放入39℃，5％CO2的培养箱中培养。接下来每24小时换一次液，第一次换液不可用PBS缓冲液清洗。细胞在支架上三维培养宏观图如图1C和1D所示。
6、培养7日后，显微镜下观察可见水凝胶中细胞致密排列，如图2所示。
7、从水凝胶中分离细胞：取出24孔培养板，丢弃培养基，加入1mL PBS缓冲液，轻轻摇晃培养皿，丢弃废液，重复3次，每孔加入500μL的胶原蛋白Ⅱ酶(2000U/mL)，放入39℃，5％CO2的培养箱消化6分钟，取出用1mL枪头吹打均匀，检查是否消化充分，室温1000g离心10分钟，丢弃废液，用体积百分含量12％胎牛血清、1％青霉素-链霉素的1640培养基终止消化并重悬细胞，吹打混匀后接种在六厘米或其他规格培养皿中，4小时后换液，如图3所示。
实施例2：DF-1三维培养细胞跟踪
为观察细胞在三维培养的状态，使用PKH26试剂对在GelMA水凝胶中三维培养的细胞进行跟踪。PKH26染色剂是一种亲脂性的红色荧光染料，对细胞没有明显的毒副作用，可插入细胞膜脂质区域，在551～567nm波长下激发红色荧光，从而标记细胞的形态和位置。具体步骤为：
为观察细胞在三维培养的状态，使用PKH26试剂对在GelMA水凝胶中三维培养的细胞进行跟踪。PKH26染色剂是一种亲脂性的红色荧光染料，对细胞没有明显的毒副作用，可插入细胞膜脂质区域，在551～567nm波长下激发红色荧光，从而标记细胞的形态和位置。具体步骤为：
1、配制PKH26染色剂溶液，配制1mL＝1mL Diluent C+4μL PKH26 Dye。
2、将细胞传代至六厘米培养皿中，步骤同实施例1的步骤。在获得细胞沉淀后，加入1mL PKH26染色剂重悬，避光静置5分钟。再加入1mL培养基终止反应，室温下1000g离心5分钟，丢弃上清液。
3、二维平面培养：使用4mL体积百分含量12％胎牛血清和1％青霉素-链霉素的1640培养基重悬细胞，转移至六厘米培养皿或其他规格培养皿，使用“八字法”晃匀。
4、三维立体培养：步骤同实施例1，用GelMA水凝胶混合液重悬染色后的细胞沉淀，光固化后将细胞水凝胶复合物转移到24孔板培养皿，加入1mL培养基没过胶面，在倒置荧光显微镜下观察。一般的，培养三天后即可观察到细胞在水凝胶内部延伸生长，不同于二维清晰可见的只有细胞膜发光，三维培养下的视野细胞多为通体红色，具体见图4。
实施例3：DF-1三维培养增殖能力检测
为检测三维培养下DF-1细胞是否具备增殖能力，使用EDU检测法检测。EdU是一种能够在细胞增殖时期代替胸腺嘧啶渗入正在复制的DNA分子的胸腺嘧啶核苷类似物，在二价铜离子等物质催化下，它能与荧光叠氮化合物反应，然后在荧光显微镜下观察细胞。以实施例1中所制的细胞水凝胶复合物为例，检测DF-1在5wt％GelMA水凝胶中分别培养一天、三天和五天的增殖能力。具体步骤为：
1、配制EDU孵育液：5mL＝5mL含12％胎牛血清的1640培养基+1.25μL EDU(5mg/mL)，震荡混匀后备用。
2、配制EDU染色液：5mL＝50μL CUSO4+250μL Tris-HCl+0.085g抗坏血酸+5μLAlexa Fluor555染料+4.7mL纯水。
3、根据实施例1，在DF-1三维培养21小时后，取出24孔培养板，更换新鲜含12％胎牛血清、1％青霉素-链霉素的1640培养基，每孔1mL，放回39℃，5％CO2的培养箱培养2个小时。取出培养皿使用PBS缓冲液轻轻清洗一遍，丢弃废液，每孔加入步骤1制备的1mL EDU孵育液，放回培养箱孵育1小时。
4、取出培养板，丢弃废液，加入1mL PBS缓冲液，摇床5分钟，丢弃废液，重复3次，然后加入4％多聚甲醛固定细胞，每孔1mL，充分浸没细胞水凝胶复合物，放在4℃固定24小时。取出培养板，丢弃废液，加入PBS清洗三遍。加入步骤2制备的EDU染色液，每孔1mL充分浸没。室温下避光孵育1小时。孵育完成后，加入PBS清洗三遍，最后使用50ng/mL的DAPI染色液，室温下避光孵育20分钟。加入PBS清洗三遍，丢弃废液，每孔加入1mLPBS缓冲液，在倒置荧光显微镜下观察。细胞增殖三天和五天的染色步骤同上，加入EDU孵育液时间分别为三维培养后71小时和119小时。结果如图5所示。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种鸡胚胎成纤维细胞体外三维培养和分离的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将鸡胚胎成纤维细胞复苏后至少传代培养一代，获得细胞悬液，离心，丢弃上清液，加入GelMA水凝胶溶液，重悬细胞，得到混合液，混合液中的细胞密度为5×105/mL～5×106/mL；
(2)将混合液用紫外光源照射，获得鸡胚胎成纤维细胞-GelMA水凝胶复合物；
(3)将鸡胚胎成纤维细胞-GelMA水凝胶复合物转移至培养皿中，加入培养液，细胞培养7-9d；
(4)细胞培养结束后，弃去培养液，加入胶原蛋白II酶消化处理5-10min，离心，收集细胞沉淀。
2.根据权利要求1所述的鸡胚胎成纤维细胞体外三维培养和分离的方法，其特征在于，步骤(1)中，将复苏后的鸡胚胎成纤维细胞用含体积百分含量12％胎牛血清、体积百分含量1％青霉素-链霉素的RPMI-1640培养基重悬，放入39℃、含体积含量5％CO2的培养箱中培养，当培养密度达到70～80％时进行传代。
3.根据权利要求1所述的鸡胚胎成纤维细胞体外三维培养和分离的方法，其特征在于，步骤(1)中，加入的GelMA水凝胶溶液的浓度为4～9wt％。
4.根据权利要求1所述的鸡胚胎成纤维细胞体外三维培养和分离的方法，其特征在于，步骤(2)中，紫外光源照射的时间为10-20s。
5.根据权利要求1所述的鸡胚胎成纤维细胞体外三维培养和分离的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述培养液为含有体积百分含量12％胎牛血清、体积百分含量1％青霉素-链霉素的RPMI-1640培养基。
6.根据权利要求1所述的鸡胚胎成纤维细胞体外三维培养和分离的方法，其特征在于，步骤(3)中，细胞培养的条件为：39℃、含体积含量为5％CO2的培养箱中培养。
7.根据权利要求1所述的鸡胚胎成纤维细胞体外三维培养和分离的方法，其特征在于，步骤(4)中，所加入的胶原蛋白II酶的浓度为2000U/ml。
8.根据权利要求1所述的鸡胚胎成纤维细胞体外三维培养和分离的方法，其特征在于，步骤(4)中，消化处理的条件为：39℃、含体积含量为5％CO2的培养箱消化5～10分钟。
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