JP2015501640A - 細胞コロニーの体外培養装置及びその使用 - Google Patents
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Abstract
【課題】細胞コロニーの体外培養装置を提供する。【解決手段】当該細胞コロニーの体外培養装置は、細胞コロニーの成長空間を限定するマイクロパターンの空洞を備えるマイクロパターン基板と、当該マイクロパターン基板の下面に形成している粘着ヒドロゲルとを含み、上の基板を必要に応じて保持または除去して、単一層の細胞マイクロパターンまたは多層の細胞マイクロクラスターを形成することができる。
Description
本発明は、細胞コロニーの体外培養装置及びその使用に関する。具体的には、本発明は、細胞コロニーの体外培養装置及びそれが幹細胞の自己複製と指向性の分化とを調節する用途、幹細胞の自己複製の調節方法、指向性の分化の調節方法、細胞の単一層マイクロパターンの形成方法、並びに細胞の多層マイクロクラスター(集合体)の形成方法に関する。
全能性幹細胞(totipotent stem cell,TSC)とは、無限の分化能を有する、すべての組織及び器官に分化することができる幹細胞を指し、主に胚性幹細胞(embryonic stem cell,ESC)と人工多能性幹細胞(induced pluripotent stem cells,iPS)とを含む。胚性幹細胞は、哺乳動物の初期段階の胚より単離されて培養されることによって得られる胚性幹細胞であって、発達の全能性を有し、生命体の発達プロセス全体に関与し、人体の様々な組織や臓器を構成することを特徴とする。胚性幹細胞は、原腸胚期で胚盤胞から得られて、さらに、肝前駆細胞、骨髄造血幹細胞などの多能性幹細胞に分化する。治療型クローニングには、技術面から、「全能性」の胚性幹細胞が最適である。しかしながら、胚性幹細胞に関する研究は、倫理や道徳に触れるため、多くの国では法律で禁止されており、係る研究がジレンマにおちいる。2007年には、通常の皮膚細胞を幹細胞に変える方法を発見したことを日本とアメリカとの科学者がそれぞれ発表し、このように得られた幹細胞は、胚性幹細胞と類似の機能を有し、人工多能性幹細胞と呼ばれ、即ち、iPS細胞である。この発見は、当時、「ネイチャー」、「サイエンス」という権威の科学雑誌により、科学の大きな進歩と評価されてきた。
iPS細胞は、「初期化した」通常の体細胞であるが、胚性幹細胞と類似の機能を有し、様々な組織細胞に分化することができる。さらに重要なことには、胚性幹細胞に関する研究者が従来から直面する倫理、法律などの種々な障害を避けるようになる。従って、医療分野での応用が注目される。
アメリカ、日本及び他の国は熱意をもって、投資を追加したり、奨励政策を定めたりすることによって、この新興の幹細胞研究を推進する。中国における幹細胞の基礎研究及び応用研究は、早期に開始し、2001年以降、幹細胞に関する重要な研究プロジェクトは、20個以上ある。国はネットワーク構築と人材構築との研究開発、研究プラットフォームの構築などに、大きな支持を与え、中国の本研究分野における優位地位の基礎を築いた。周▲チ▼グループ(中国科学院動物学研究所)と高紹栄グループ(北京生物科学研究所)とは、それぞれ、iPS細胞でクローンマウスを作製した。これにより、iPS細胞の全能性が、世界で初めて証明された。胚性幹細胞と同様の分化能を有する細胞は、完全インビトロの操作によって得られることを表明する。この成果は、幹細胞の研究から、実際の医療処置への大きな飛躍であり、幹細胞全能性のメカニズムに関する研究、及び、臓器移植、薬物スクリーニング、遺伝子療法などの臨床応用研究に重要な価値がある。
全能性幹細胞のコロニーの増殖は、幹細胞全能性を維持する上で非常に重要な役割を果たす。ヒト胚性幹細胞(hESC)を例として、典型的な培養方法は、マウス胚性線維芽細胞(MEF)に代表される不活化されたフィーダー細胞(MEF)で実施されるのである。一方、ある研究に証明されるように、適切な化学因子により、マトリゲル、コラーゲン、ラミニン及びフィブロネクチンの一種またはそれらの混合物等の細胞外のマトリックスも、hESC細胞の自己複製を維持するための培養基質として用られる。単細胞の状態でのhESCの生存率が低いため、典型的な継代方法としては、そのコロニーを、約100個の細胞を有するクラスターに消化またはカットすることである。継代技術を問わず、細胞クラスターの状態でhESCを維持することは操作のポイントとなる。しかしながら、この方法は、操作者のスキル、経験に大きく依存し、最終に形成したhESCコロニーは、ランダムな形状、大きさ及び細胞密度を有する異質のものである。しかし、大きすぎるまたは小さすぎる細胞クラスターは、さらなる顕著な分化の傾向を持っている。全能性幹細胞の自己複製の特別な要求のため、現在の培養方法及び継代方法では、均質な全能性幹細胞のコロニーを作製することが困難である。
現在では、多くの研究に証明されるように、全能性幹細胞コロニーの均質性は自己複製及びその後の分化に重要な役割を果たす。hESCを例として、コロニーのサイズ及び細胞の組成が分化の誘導因子及び分化全能性の因子に対する調節効果を有し、特に、コロニーのサイズに直接関連するSmad1のシグナルは、胚性幹細胞とそれから得る胚性内胚葉細胞との拮抗作用により活性化され、胚性内胚葉細胞が分泌する骨形成タンパク質−2(BMP2)、及び胚性幹細胞が分泌する増殖分化因子−3(GDF3)を介して役割を果たす。Smad1の活性化を独立に調節することにより胚性幹細胞の自動分化を支配できることは、hESCのコロニーの大きさで胚性幹細胞の分化及び自己複製を独立に調節可能であることを示唆した。しかし、コロニーの大きさは、典型的な培養条件の下で調節することができず、ランダムなコロニーの大きさ、ランダムな細胞密度及び分子の微小環境の作用により、制御不能な自己分化の存在が必然なことであり、胚性幹細胞の増殖及び自己複製に影響を与える。
全能性幹細胞コロニーの異質性及び大きさの差は、幹細胞の分化に重要な影響を与える。初期の幹細胞の制御不能なコロニーは通常、一致しないまたは不安定な分化結果及び分化効率をもたらし、これは、全能性幹細胞の分化の研究者が直面する一般的な問題である。マイクロパターンニング(micropatterning)技術により判明したように、小さいサイズのコロニーが心筋細胞へ分化する傾向が顕著である。一方、大きいサイズのコロニーが神経細胞へ分化する傾向がより顕著である。全能性幹細胞の培養基質の機械的性質は、細胞の自己複製及び分化に対しても、重要な影響を与えた。研究から証明されたように、培養基質は、弾性率が0.6kPaであると、マウス胚性幹細胞の自己複製の維持に優れた効果を有し、この機械的強度は、生体内の組織と類似している。同様に、化学的シグナルの刺激を添加しない場合、高機械強度の培養基質は、間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化を誘導する効果を有するが、低機械強度の培養基質は、幹細胞の脂肪細胞への分化を誘導する効果を有する。研究から証明されたように、適切な機械的応力がhESCの自動分化を抑制し、それの自己複製を促進することができ、双方向循環の応力と化学シグナルとの相乗効果は、分化とhESCの自己複製を制御することができた。これは、幹細胞の分化及び細胞療法などの分野における研究に対して、重要な意義を有する。
2011年以降、笹井芳樹らが、「ネイチャー」、「セル幹細胞」などの雑誌に発表した研究成果によって証明されたように、三次元細胞クラスターの培養条件下で、hESC及びマウス胚性幹細胞などの全能性幹細胞を指向性に分化させることにより、インビトロで天然の多層構造を有する類網膜組織が得られ、かつ、その発逹のプロセスが、生体内天然組織と複数の方面で類似している。この研究方法と成果は、伝統的な2次元の研究を乗り越え、三次元細胞クラスターの培養条件下で全能性幹細胞を指向性に分化誘導させる可能性を示した。
従って、全能性幹細胞を培養するための最適なプラットフォームは、調節可能且つ安定な細胞の播種密度を実現させるため、幹細胞の正常な表現型及び核型を維持することを前提として、制御可能なコロニー形状及び大きさ、物理的及び化学的性質が調節可能な培養基質、単一層の細胞コロニー及び多層の細胞マイクロクラスターを達成できるなどの種々の培養態様、並びに適切な継代方法という4つの要件を備えなければならない。
本発明は、少なくとも先行技術に存在する技術課題の1つを解決しようとする。そのため、本発明は、制御可能なコロニー形状及び大きさ、物理的及び化学的性質が調節可能な培養基質を有し、単一層の細胞コロニー及び多層の細胞マイクロクラスターなどの培養態様を実現でき、適切な継代方法を実現できる細胞コロニーの体外培養装置を提供することを目的の1つとする。
本発明の一態様によれば、細胞コロニーの体外培養装置を提供するすることができる。本発明の実施形態によれば、細胞コロニーの体外培養装置は、細胞コロニーの成長空間を限定するマイクロパターンの空洞を備えるマイクロパターン基板と、該マイクロパターン基板の下面に形成されている粘着ヒドロゲルとを含む。本発明に係る細胞コロニーの体外培養装置によれば、細胞コロニーが均質に成長することを達成できる。具体的には、本発明の実施形態によれば、本発明に係る細胞コロニーの体外培養装置は、マイクロパターン基板と粘着ヒドロゲルとを合わせて利用し、コロニーの形状と大きさ、細胞の単一層または多層の成長形態、付着基質の機械的強度及び化学組成、成長因子及び化学シグナル、共培養細胞などの種々の要素を調節でき、且つ各要素に対する調節手段がお互いに独立するので干渉が生じない。インサイチュ(in situ)細胞の増殖培養及び分化誘導の培養を達成でき、作業が大幅に簡素化され,細胞への処理及び損傷を低減できる。調製プロセスが簡単で、市販のシャーレと一緒に利用でき、細胞培養の元の手順及び詳細を変更する必要がなく、優れた無菌環境を維持できる。マイクロパターンニング技術を十分に利用して、種々な細胞の共培養環境を簡単に構築でき、高品質のモデル構築及びスクリーニングなどの研究に便利かつ実用的な手段を提供可能である。
本発明の実施形態によれば、本発明に係る細胞コロニーの体外培養装置が下記のような付加的技術特徴を有してもよい。
本発明の一実施形態によれば、本発明に係る細胞コロニーの体外培養装置は前記粘着ヒドロゲルの下面に配置されている硬質基質をさらに含む。
本発明の一実施形態によれば、本発明に係る細胞コロニーの体外培養装置は、前記粘着ヒドロゲルの下に配置され、前記マイクロパターン基板を埋め込む多孔のシャーレをさらに含む。
本発明の一実施形態によれば、前記粘着ヒドロゲルは、天然の生体材料及び合成の生体材料から選ばれる少なくとも1種を架橋させることによって形成されている。
本発明の一実施形態によれば、前記天然の生体材料は、ゼラチン、ゼラチン誘導体、アルギン酸塩、アルギン酸塩誘導体、寒天、マトリゲル、コラーゲン、プロテオグリカン、糖蛋白質、ヒアルロン酸、ラミニン及びフィブロネクチンからなる群から選ばれる少なくとも1種である。
本発明の一実施形態によれば、前記合成の生体材料は、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリ乳酸、ポリヒドロキシ酸、ポリ乳酸アルコール酸共重合体、ポリジメチルシロキサン、ポリ酸無水物、ポリカルボン酸エステル、ポリアミド、ポリアミノ酸、ポリアセタール、ポリシアノアクリレート、ポリウレタン、ポリピロール、ポリエステル、ポリメタクリレート、ポリエチレン、ポリカーボネート及びポリエチレンオキサイドからなる群から選ばれる少なくとも1種である。
本発明の一実施形態によれば、前記マイクロパターン基板はポリメチルメタクリレートからなる。
本発明の一実施形態によれば、前記粘着ヒドロゲルはゼラチン−メチルメタクリレートと光開始剤である2−ヒドロキシ−4−(2−ヒドロキシエトキシ)−2−メチルプロピオフェノンとからなる。
本発明の一実施形態によれば、前記ゼラチン−メチルメタクリレートはゼラチンとメチルメタクリレートとのポリマーであり、使用量としては、メチルメタクリレート1mLに対して、1gのゼラチンが用いられている。
本発明の一実施形態によれば、前記粘着ヒドロゲルは、前記ゼラチン−メチルメタクリレートをDMEM培養液に溶かして、ゼラチン−メチルメタクリレートの溶液100mLに対して、ゼラチン−メチルメタクリレート5gを含有するゼラチン−メチルメタクリレートの溶液を調製するステップ、前記光開始剤をエタノールに溶かして、100mLの溶液に光開始剤10gを含有する光開始剤の溶液を調製するステップ、前記光開始剤の溶液と前記ゼラチン−メチルメタクリレートの溶液とを、体積比1:20で混合するステップ、及び前記粘着ヒドロゲルを形成するために紫外線で前記ゼラチン−メチルメタクリレートに架橋を形成させるステップにより調製される。
本発明の一実施形態によれば、前記粘着ヒドロゲルは細胞外のマトリックス成分、成長因子及び化学的シグナル分子から選ばれる少なくとも1種を含有する。
本発明の一実施形態によれば、前記細胞外マトリックスが前記粘着ヒドロゲルにコーティングされる。
本発明の一実施形態によれば、前記細胞外のマトリックス成分は、コラーゲン、ゼラチン、マトリゲル、プロテオグリカン、糖蛋白質、ヒアルロン酸、ラミニン及びフィブロネクチンから選ばれる少なくとも1種である。
本発明の一実施形態によれば、前記粘着ヒドロゲルには、成長因子と化学的シグナル分子とが埋め込まれている。
本発明の一実施形態によれば、前記粘着ヒドロゲルの厚さは1〜100μmである。
また、本発明の別の態様によれば、本発明は前記細胞コロニーの体外培養装置が幹細胞の自己複製を調節する応用を提供する。
また、本発明のさらに別の態様によれば、本発明は前述した細胞コロニーの体外培養装置が幹細胞の指向性の分化を調節する応用を提供する。
尚、上述した「幹細胞」は、全能性幹細胞及びそのほかの幹細胞を含む。
本発明のさらなる態様によれば、本発明は、細胞コロニーの体外培養装置を提供する。本発明の一実施形態によれば、本発明に係る細胞コロニーの体外培養装置は、複数のマイクロパターンの空洞を有するマイクロパターン基板と、該マイクロパターン基板の下に配置されている粘着ヒドロゲルとを含み、前記粘着ヒドロゲルと前記マイクロパターン基板とを架橋させることにより一体に接着され、前記粘着ヒドロゲルが前記マイクロパターンの空洞の底部を形成する。細胞コロニー成長の物理的空間における細胞播種密度が前記マイクロパターン基板の前記各マイクロパターンの空洞の形状及び体積によって決められ、細胞的成長形態(単一層または多層)が培養時間及び培養モードによって決められる。
本発明の一実施形態によれば、前記細胞コロニーの体外培養装置は、さらに、前記粘着ヒドロゲルの下に配置されている硬質基質、または前記粘着ヒドロゲルの下に配置され、前記マイクロパターン基板を埋め込む多孔のシャーレを含んでもよい。
本発明の一実施形態によれば、前記粘着ヒドロゲルは、架橋でヒドロゲルを形成可能な天然の生体材料及び/または合成の生体材料を用いて作成される。前記天然の生体材料は、ゼラチン、ゼラチン誘導体、アルギン酸塩、アルギン酸塩誘導体、寒天、マトリゲル、コラーゲン、プロテオグリカン、糖蛋白質、ヒアルロン酸、ラミニン及びフィブロネクチンからなる群から選ばれる1種であり、前記合成の生体材料は、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリ乳酸、ポリヒドロキシ酸、ポリ乳酸アルコール酸共重合体、ポリジメチルシロキサン、ポリ酸無水物、ポリカルボン酸エステル、ポリアミド、ポリアミノ酸、ポリアセタール、ポリシアノアクリレート、ポリウレタン、ポリピロール、ポリエステル、ポリメタクリレート、ポリエチレン、ポリカーボネート及びポリエチレンオキサイドからなる群から選ばれる1種である。
本発明の一実施形態によれば、前記マイクロパターン基板はポリメチルメタクリレートからなる。本発明の別の実施形態によれば、前記粘着ヒドロゲルは、ゼラチン−メチルメタクリレートと光開始剤であるIrgacure 2959(I2959、2−ヒドロキシ−4−(2−ヒドロキシエトキシ)−2−メチルプロピオフェノン)とからなる。本発明のさらなる実施形態によれば、前記ゼラチン−メチルメタクリレートはゼラチンとメチルメタクリレートとのポリマーであって、使用量としては、メチルメタクリレート1mLに対して、1gのゼラチンが用いられている。本発明のまたさらなる実施形態によれば、前記ゼラチン−メチルメタクリレートは、具体的に、DPBS溶液10mLにゼラチン1gを投入し、50℃で水浴に加熱して、十分に溶融されるまでよく攪拌した後、メチルメタクリレート1mLを0.5mL/分で徐々に加えて、2時間反応した後、反応系を外して、室温まで冷却し、DPBS溶液40mLを加えて希釈して、脱イオン化した水に、8000〜12000の分画分子量を有する透析バッグで、脱イオン水において60℃にて1週間透析した後、遠心分離して上澄み液をとって、1週間凍結乾燥してから、ふわふわした白色の泡状の固体になり、−80℃で保存する方法により調製される。
本発明の一実施形態によれば、前記粘着ヒドロゲルは、1)前記ゼラチン−メチルメタクリレートをDMEM培養液に溶かして、ゼラチン−メチルメタクリレートの溶液100mLに対して、ゼラチン−メチルメタクリレート5gを含有するゼラチン−メチルメタクリレートの溶液を調製するステップ、2)前記光開始剤である2−ヒドロキシ−4−(2−ヒドロキシエトキシ)−2−メチルプロピオフェノンをエタノールに溶かして、100mLの溶液に10gの2−ヒドロキシ−4−(2−ヒドロキシエトキシ)−2−メチルプロピオフェノンを含有する光開始剤の溶液を調製するステップ、及び3)前記光開始剤の溶液と前記ゼラチン−メチルメタクリレートの溶液とを、体積比1:20で混合するステップにより調製される。
本発明の一実施形態によれば、前記DMEM培養液が市販されているものである。一例としては、インビトロジェン社製、品番11965092の製品である。
本発明の一実施形態によれば、前記粘着ヒドロゲルを調製する場合に、前記粘着ヒドロゲルの上面に、必要に応じて細胞外のマトリックスをコーティングしてもよい。本発明のさらなる実施形態によれば、前記細胞外のマトリックス成分は、コラーゲン、ゼラチン、マトリゲル、プロテオグリカン、糖蛋白質、ヒアルロン酸、ラミニン、またはフィブロネクチンを含んでいる。本発明の別の実施形態によれば、前記粘着ヒドロゲルに、成長因子と化学的シグナル分子とが埋め込まれてもよい。本発明のさらなる実施形態によれば、前記粘着ヒドロゲルの厚さは約1〜100μmである。
本発明の実施形態によれば、前記細胞コロニーの体外培養装置は、下記の方法により構築される。上述のマイクロパターン基板を多孔のシャーレに配置して、前記多孔のシャーレに、マイクロパターン基板の底に沿って、架橋剤を含有する粘着ヒドロゲル基の溶液を注ぎ込み、前記架橋剤による架橋効果及び前記粘着ヒドロゲルによる粘着力効果により、前記多孔のシャーレと前記マイクロパターン基板とを一体的に連結して、下からはマイクロパターン基板、基質ヒドロゲル層、及びシャーレの上面が順に配置されている細胞コロニーの体外培養装置とする。
本発明の実施形態によれば、本発明に係る細胞コロニーの体外培養装置により、細胞コロニーが均質に成長することは実現される。
尚、本発明に係る細胞コロニーの体外培養装置が全能性幹細胞及び他の幹細胞の自己複製及び/または指向性の分化を調節する応用も、本発明の技術的範囲に包含される。
本発明の一実施形態によれば、前記全能性幹細胞がヒト胚性幹細胞であり、前記指向性の分化は、ヒト胚性幹細胞から肝細胞様細胞への分化である。
本発明のさらなる態様によれば、本発明は幹細胞の自己複製を調節する方法を提供する。本発明の方法は、前述した細胞コロニーの体外培養装置を利用して幹細胞を培養することを含む。
本発明のさらなる態様によれば、本発明は幹細胞の指向性の分化を調節する方法を提供する。本発明の方法は、前述した細胞コロニーの体外培養装置を利用して幹細胞を培養することを含む。
尚、前述した「幹細胞」は、全能性幹細胞及びそのほかの幹細胞を含む。
本発明のさらなる態様によれば、本発明は細胞の単一層マイクロパターンの形成方法を提供する。本発明の方法は、前述した細胞コロニーの体外培養装置を利用して幹細胞及び成体型細胞から選ばれる少なくとも1種の細胞を培養することにより、細胞の単一層マイクロパターンを形成することを含む。
本発明のさらなる態様によれば、本発明は細胞の多層マイクロクラスターの形成方法を提供する。本発明の方法は、前述した細胞コロニーの体外培養装置を利用して幹細胞及び成体型細胞から選ばれる少なくとも1種の細胞を培養することにより、細胞の多層マイクロパターンを形成することを含む。
従来技術と比べて、本発明は下記のような利点がある。
1.本発明に係る細胞コロニーの体外培養装置は、マイクロパターン基板と粘着ヒドロゲルとを合わせて利用し、コロニーの形状と大きさ、細胞の単一層または多層の成長形態、付着基質の機械的強度及び化学組成、成長因子及び化学シグナル、共培養細胞などの種々の要素を調節でき、且つ各要素に対する調節手段がお互いに独立するので干渉が生じない。
2.本発明に係る細胞コロニーの体外培養装置は、インサイチュ細胞の増殖培養及び分化誘導の培養を達成でき、作業が大幅に簡素化され,細胞への処理及び損傷を低減できる。
3.本発明に係る細胞コロニーの体外培養装置は、調製プロセスが簡単で、市販のシャーレと一緒に利用でき、細胞培養の元の手順及び詳細を変更する必要がなく、優れた無菌環境を維持できる。
4.本発明に係る細胞コロニーの体外培養装置は、マイクロパターンニング技術を十分に利用して、種々な細胞の共培養環境を簡単に構築でき、高品質のモデル構築及びスクリーニングなどの研究に便利かつ実用的な手段を提供可能である。
1.本発明に係る細胞コロニーの体外培養装置は、マイクロパターン基板と粘着ヒドロゲルとを合わせて利用し、コロニーの形状と大きさ、細胞の単一層または多層の成長形態、付着基質の機械的強度及び化学組成、成長因子及び化学シグナル、共培養細胞などの種々の要素を調節でき、且つ各要素に対する調節手段がお互いに独立するので干渉が生じない。
2.本発明に係る細胞コロニーの体外培養装置は、インサイチュ細胞の増殖培養及び分化誘導の培養を達成でき、作業が大幅に簡素化され,細胞への処理及び損傷を低減できる。
3.本発明に係る細胞コロニーの体外培養装置は、調製プロセスが簡単で、市販のシャーレと一緒に利用でき、細胞培養の元の手順及び詳細を変更する必要がなく、優れた無菌環境を維持できる。
4.本発明に係る細胞コロニーの体外培養装置は、マイクロパターンニング技術を十分に利用して、種々な細胞の共培養環境を簡単に構築でき、高品質のモデル構築及びスクリーニングなどの研究に便利かつ実用的な手段を提供可能である。
本発明の実施の形態のさらなる態様及び利点が、一部は以下の説明に提示され、一部は以下の説明から明らかになり、あるいは本発明の実施の形態を実施することによって習得される。
本発明の実施の形態のこれらの態様及び利点並びに他の態様及び利点が、添付の図面を参照しつつ行なわれる以下の説明から明らかになり、より容易に理解されるであろう。
本発明の実施の形態を詳しく参照する。図面を参照して本明細書において説明される実施の形態は、説明用であり、例示にすぎず、本発明の大まかな理解のために用いられる。これらの実施の形態を、本発明を限定するものとして解釈してはならない。同じまたは類似の構成要素並びに同じまたは類似の機能を有する構成要素は、説明の全体を通して、類似の参照番号によって指し示される。
説明において、「上」、「下」などの装置または構成要素の向きに関して本明細書において使用される用語は、本発明の説明を簡単にするためにそこで説明されており、それだけでは装置もしくは構成要素が特定の向きを有さなければならないまたは特定の向きにて構成もしくは動作しなければならないことを指示または意味しているわけではないことを、理解すべきである。
説明において、特に限定されない限り、「多数」、「複数」は二または二以上を示す。
本発明の一態様によれば、本発明は細胞コロニーの体外培養装置を提供する。本発明の実施形態によれば、本発明に係る細胞コロニーの体外培養装置は、マイクロパターン基板と、粘着ヒドロゲルとを含む。本発明の実施形態によれば、細胞コロニーの体外培養装置は、細胞コロニーの成長空間を限定するマイクロパターンの空洞を備えるマイクロパターン基板と、該マイクロパターン基板の下面に形成されている粘着ヒドロゲルとを含む。
本発明に係る細胞コロニーの体外培養装置によれば、細胞コロニーが均質に成長することを達成できる。具体的には、本発明の実施形態によれば、本発明に係る細胞コロニーの体外培養装置は、マイクロパターン基板と粘着ヒドロゲルとを合わせて利用し、コロニーの形状と大きさ、細胞の単一層または多層の成長形態、付着基質の機械的強度及び化学組成、成長因子及び化学シグナル、共培養細胞などの種々の要素を調節でき、且つ各要素に対する調節手段がお互いに独立するので干渉が生じない。インサイチュ細胞の増殖培養及び分化誘導の培養を達成でき、作業が大幅に簡素化され,細胞への処理及び損傷を低減できる。調製プロセスが簡単で、市販のシャーレと一緒に利用でき、細胞培養の元の手順及び詳細を変更する必要がなく、優れた無菌環境を維持できる。マイクロパターンニング技術を十分に利用して、種々な細胞の共培養環境を簡単に構築でき、高品質のモデル構築及びスクリーニングなどの研究に便利かつ実用的な手段を提供可能である。
以下、本発明に係る細胞コロニーの体外培養装置を、図1−5を参照して詳細に説明する。
本発明の実施形態によれば、該細胞コロニーの体外培養装置がマイクロパターン基板2と、粘着ヒドロゲル3とを含んでもよい。本発明の実施形態によれば、該マイクロパターン基板2は、細胞コロニーの成長空間4を限定するマイクロパターンの空洞6を備え、粘着ヒドロゲル3が当該マイクロパターン基板2の下面に形成される。
本発明の一実施形態によれば、本発明に係る細胞コロニーの体外培養装置は前記粘着ヒドロゲル3の下に配置される硬質基質5を含んでもよい。本発明の実施形態によれば、硬質基質5を構成する材料については特に制限がなく、ガラス、プラスチックなどが挙げられる。本発明の一実施形態によれば、本発明に係る細胞コロニーの体外培養装置がさらに前記粘着ヒドロゲル3の下に位置しているとともに、前記マイクロパターン基板2を埋め込む多孔のシャーレ1を含んでもよい。本発明の一実施形態によれば、粘着ヒドロゲル3は、天然の生体材料及び合成の生体材料から選ばれる少なくとも1種が架橋されることによって形成される。本発明の一実施形態によれば、前記天然の生体材料は、ゼラチン、ゼラチン誘導体、アルギン酸塩、アルギン酸塩誘導体、寒天、マトリゲル、コラーゲン、プロテオグリカン、糖蛋白質、ヒアルロン酸、ラミニン及びフィブロネクチンからなる群から選ばれる少なくとも1種でもよい。本発明の一実施形態によれば、前記合成の生体材料は、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリ乳酸、ポリヒドロキシ酸、ポリ乳酸アルコール酸共重合体、ポリジメチルシロキサン、ポリ酸無水物、ポリカルボン酸エステル、ポリアミド、ポリアミノ酸、ポリアセタール、ポリシアノアクリレート、ポリウレタン、ポリピロール、ポリエステル、ポリメタクリレート、ポリエチレン、ポリカーボネート、及びポリエチレンオキサイドからなる群から選ばれる少なくとも1種でもよい。
本発明の一実施形態によれば、前記マイクロパターン基板2はポリメチルメタクリレートから形成される。本発明の一実施形態によれば、前記粘着ヒドロゲル3はゼラチン−メチルメタクリレートと光開始剤である2−ヒドロキシ−4−(2−ヒドロキシエトキシ)−2−メチルプロピオフェノンとから形成される。本発明の一実施形態によれば、前記ゼラチン−メチルメタクリレートはゼラチンとメチルメタクリレートとのポリマーであってもよい。使用量としては、メチルメタクリレート1mLに対して、1gのゼラチンが用いられている。
本発明の一実施形態によれば、前記粘着ヒドロゲル3は、まず、前記ゼラチン−メチルメタクリレートをDMEM培養液に溶かして、ゼラチン−メチルメタクリレートの溶液100mLに対して、ゼラチン−メチルメタクリレート5gを含有するゼラチン−メチルメタクリレートの溶液を調製するステップ、次に、前記光開始剤をエタノールに溶かして、100mLの溶液に光開始剤10gを含有する光開始剤の溶液を調製するステップ、続いて、前記光開始剤の溶液と前記ゼラチン−メチルメタクリレートの溶液とを、体積比1:20で混合するステップ、及び、最後に、前記粘着ヒドロゲル3を形成するために紫外線で前記ゼラチン−メチルメタクリレートに架橋を形成させるステップにより調製される。
本発明の一実施形態によれば、前記粘着ヒドロゲル3が細胞外のマトリックス成分、成長因子及び化学的シグナル分子から選ばれる少なくとも1種を含有してもよい。本発明の一実施形態によれば、前記細胞外マトリックスが前記粘着ヒドロゲル3の上にコーティングさてもよい。本発明の一実施形態によれば、前記細胞外のマトリックス成分は、コラーゲン、ゼラチン、マトリゲル、プロテオグリカン、糖蛋白質、ヒアルロン酸、ラミニン及びフィブロネクチンから選ばれる少なくとも1種であってもよい。本発明の一実施形態によれば、粘着ヒドロゲル3には、成長因子と化学的シグナル分子とが埋め込まれていてもよい。
本発明の一実施形態によれば、粘着ヒドロゲル3の厚さは1〜100μmであってもよい。
本発明の実施形態によれば、粘着ヒドロゲル3は、培養細胞(例えば、全能性幹細胞)またはフィーダー細胞(例えば、マウスの胚性線維芽細胞)を支持する成長基質として利用される。
また、本発明の別の態様によれば、本発明は細胞コロニーの体外培養装置を提供する。尚、以下に説明する細胞コロニーの体外培養装置の特徴及び効果が、当然、前述した細胞コロニーの体外培養装置に適用される。
本発明の一実施形態によれば、本発明に係る細胞コロニーの体外培養装置は、複数のマイクロパターンの空洞6を有するマイクロパターン基板2及び当該マイクロパターン基板2の下に位置している粘着ヒドロゲル3を含む。粘着ヒドロゲル3とマイクロパターン基板2とを架橋させることにより一体に接着される。細胞コロニー4成長の物理的空間が、マイクロパターン基板2の各マイクロパターンの空洞6の形状及び体積によって決定される。
本発明の一実施形態によれば、本発明に係る細胞コロニーの体外培養装置は、必要に応じて、さらに、粘着ヒドロゲル3の下に配置されている硬質基質5、または前記粘着ヒドロゲル3の下に配置され、前記マイクロパターン基板2を埋め込む多孔のシャーレ1を含んでもよい。
本発明の一実施形態によれば、上層のマイクロパターン基板2は着脱自在に構成されている。これにより、その後に細胞の単一層成長、多層成長、細胞の共培養や、全能性幹細胞の分化などの用途に適する。
本発明の一実施形態によれば、マイクロパターン基板2は、当該技術分野で公知のマイクロパターンニングの形成方法によって得ることができ、例えば、レーザでのカッティング、型彫り、マイクロパターン成形などが挙げられる。コンピューター支援設計及び製造技術によって、細胞コロニー4の成長空間並びにマイクロパターン基板全体の形状及び大きさを調節できる。具体的には、本発明の実施形態によれば、コンピューター支援設計、及び製造技術により、多種なマイクロパターンの空洞6の形状及び大きさを実現でき、形状としては、例えば、円形、正方形、長方形、ひし形、台形及び種々な不規則な形状などが挙げられる。大きさが10μm〜2cmである。これにより、細胞コロニー4の成長した物理空間が決まる。一般的には、マイクロパターン基板2の全体での大きさ及び形状が、使用するシャーレ1の大きさに応じて決められ、形状としては、円形の方が多い。その径はシャーレ1に等しいか、またはそれよりもわずかに小さい。所望の大きさ及び形状を有するマイクロパターン基板2を、コンピューター支援設計、及び製造技術により製造される。材料の節約と使用の便利さとのため、マイクロパターン基板2の好ましい厚さは100μm〜2cmである。
本発明の一実施形態によれば、粘着ヒドロゲル3は、培養細胞(例えば、全能性幹細胞)や、フィーダー細胞(例えば、マウスの胚性線維芽細胞)を支持する成長基質である。本発明の一実施形態によれば、粘着ヒドロゲル3は、架橋でヒドロゲルを形成可能な天然の生体材料及び/または合成の生体材料を用いて作成される。前記天然の生体材料としては、ゼラチン、ゼラチン誘導体、アルギン酸塩、アルギン酸塩誘導体、寒天、マトリゲル、コラーゲン、プロテオグリカン、糖蛋白質、ヒアルロン酸、ラミニン及びフィブロネクチンなどが挙げられ、前記合成の生体材料としては、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリ乳酸、ポリヒドロキシ酸、ポリ乳酸アルコール酸共重合体、ポリジメチルシロキサン、ポリ酸無水物、ポリカルボン酸エステル、ポリアミド、ポリアミノ酸、ポリアセタール、ポリシアノアクリレート、ポリウレタン、ポリピロール、ポリエステル、ポリメタクリレート、ポリエチレン、ポリカーボネート及びポリエチレンオキサイドチンなどが挙げられる。本発明の一実施形態によれば、基質(下層の粘着ヒドロゲル3)を形成した材料は、前記材料のいずれか1種、または2種以上のものの混合物でもよい。架橋剤の種類及び使用量は、架橋を十分に発生させることを前提として、基質である生体材料の種類及び使用量に応じて決められる。
本発明の一実施形態によれば、前記マイクロパターン基板2に使用する材料が具体的にはポリメチルメタクリレートであり、前記粘着ヒドロゲル3に使用する材料が、具体的には、ゼラチン−メチルメタクリレートと光開始剤Irgacure 2959(I2959、2−ヒドロキシ−4−(2−ヒドロキシエトキシ)−2−メチルプロピオフェノン)とからなり、前記ゼラチン−メチルメタクリレートはゼラチンとメチルメタクリレートとのポリマーで、使用量としては、メチルメタクリレート1mLに対して、1gのゼラチンが用いられている。本発明の一実施形態によれば、前記ゼラチン−メチルメタクリレートは、具体的には、DPBS溶液10mLにゼラチン1gを投入し、50℃で水浴に加熱して、十分に溶融されるまでよく攪拌した後、メチルメタクリレート1mLを0.5mL/分で徐々に加えて、2時間反応した後、反応系を外して、室温まで冷却し、DPBS溶液40mLを加えて希釈して、脱イオン化した水に、8000−12000の分画分子量を有する透析バッグで、脱イオン水において60℃にて1週間透析した後、遠心分離して上澄み液をとって、1週間凍結乾燥してから、ふわふわした白色の泡状の固体になり、−80℃で保存する方法により調製される。
本発明の一実施形態によれば、前記粘着ヒドロゲル3は、具体的には、下記のステップにより調製される。
1)前記ゼラチン−メチルメタクリレートをDMEM培養液に溶かして、ゼラチン−メチルメタクリレートの溶液100mLに対して、ゼラチン−メチルメタクリレート5gを含有するゼラチン−メチルメタクリレートの溶液を調製するステップ、
2)前記光開始剤である2−ヒドロキシ−4−(2−ヒドロキシエトキシ)−2−メチルプロピオフェノンをエタノールに溶かして、100mLの溶液に10gの2−ヒドロキシ−4−(2−ヒドロキシエトキシ)−2−メチルプロピオフェノンを含有する光開始剤の溶液を調製するステップ、及び
3)前記光開始剤の溶液と前記ゼラチン−メチルメタクリレートの溶液とを、体積比1:20で混合するステップにより調製される。
1)前記ゼラチン−メチルメタクリレートをDMEM培養液に溶かして、ゼラチン−メチルメタクリレートの溶液100mLに対して、ゼラチン−メチルメタクリレート5gを含有するゼラチン−メチルメタクリレートの溶液を調製するステップ、
2)前記光開始剤である2−ヒドロキシ−4−(2−ヒドロキシエトキシ)−2−メチルプロピオフェノンをエタノールに溶かして、100mLの溶液に10gの2−ヒドロキシ−4−(2−ヒドロキシエトキシ)−2−メチルプロピオフェノンを含有する光開始剤の溶液を調製するステップ、及び
3)前記光開始剤の溶液と前記ゼラチン−メチルメタクリレートの溶液とを、体積比1:20で混合するステップにより調製される。
本発明の一実施形態によれば、前記DMEM培養液が、市販されているものである。一例としては、インビトロジェン社製、品番11965092の製品である。
本発明の一実施形態によれば、前記粘着ヒドロゲル3上には、必要に応じて細胞外のマトリックスをコーティングしてもよい。前記細胞外のマトリックス成分は、コラーゲン、ゼラチン、マトリゲル、プロテオグリカン、糖蛋白質、ヒアルロン酸、ラミニン、及びフィブロネクチンを含んでいる。また、前記粘着ヒドロゲル3には、成長因子と化学的シグナル分子とが埋め込まれてもよい。
本発明の一実施形態によれば、前記粘着ヒドロゲル3において、材料の使用量は、シャーレ1の使用可能な面積により決められ、シャーレ1または硬質基質5の表面が均一に覆われるように、一般的には、1μL〜10mLである。
本発明の一実施形態によれば、本発明に係る細胞コロニーの体外培養装置の構築方法は、以下の4つものを含むがこれらに限定されない。
1)所望の大きさ及び形状を有するマイクロパターン基板2を設計して調製した後、多孔のシャーレ1に配置し、多孔のシャーレ1に、基質を構成する生体材料を、プレートの底に沿って、注ぎ込んだ後、架橋を発生させ、架橋剤による架橋効果及び粘着ヒドロゲル3による粘着力効果により、多孔のシャーレ1とマイクロパターン基板2とを一体的に連結させ、十分に架橋させた後、余分な架橋剤や、気泡を取り除き、得られた装置は、直接に使用または低温で保存される。
2)多孔のシャーレ1に、基質を構成する生体材料を、均一に注ぎ込んで、架橋を発生させ、基質ヒドロゲル3を形成し、次に、プレスで基質ヒドロゲル3とマイクロパターン基板2とを一体的に連結させ、よく洗って余分な架橋剤や、気泡を取り除き、得られた装置は、直接に使用または低温で保存される。
3)ガラスシートや、プラスチックシートなどの硬質基質5を、全体大きさがマイクロパターン基板2と一致するように加工して、硬質基質5にマトリックスである基質ヒドロゲル3を形成させ、そして、プレスにより、基質ヒドロゲル3の表面とマイクロパターン基板2とを一体的に連結させて、下から上へは硬質基質、ヒドロゲル、基板が順に配置されている3層の構造とし、それをシャーレ1に埋め込んで、よく洗って余分な架橋剤や、気泡を取り除いき、得られた装置は、直接に使用または低温で保存される。
4)まず、シート状の硬質基質5をマイクロパターン基板2の下に位置決め、または粘着させ、そして、基質を構成する生体材料を、両方の間隙に沿って、均一にを注ぎ込んで、架橋を発生させて、下から上へは硬質基質、ヒドロゲル、基板が順に配置されている3層の構造とし、それをシャーレ1に埋め込んで、よく洗って余分な架橋剤や、気泡を取り除いき、得られた装置は、直接に使用または低温で保存される。
1)所望の大きさ及び形状を有するマイクロパターン基板2を設計して調製した後、多孔のシャーレ1に配置し、多孔のシャーレ1に、基質を構成する生体材料を、プレートの底に沿って、注ぎ込んだ後、架橋を発生させ、架橋剤による架橋効果及び粘着ヒドロゲル3による粘着力効果により、多孔のシャーレ1とマイクロパターン基板2とを一体的に連結させ、十分に架橋させた後、余分な架橋剤や、気泡を取り除き、得られた装置は、直接に使用または低温で保存される。
2)多孔のシャーレ1に、基質を構成する生体材料を、均一に注ぎ込んで、架橋を発生させ、基質ヒドロゲル3を形成し、次に、プレスで基質ヒドロゲル3とマイクロパターン基板2とを一体的に連結させ、よく洗って余分な架橋剤や、気泡を取り除き、得られた装置は、直接に使用または低温で保存される。
3)ガラスシートや、プラスチックシートなどの硬質基質5を、全体大きさがマイクロパターン基板2と一致するように加工して、硬質基質5にマトリックスである基質ヒドロゲル3を形成させ、そして、プレスにより、基質ヒドロゲル3の表面とマイクロパターン基板2とを一体的に連結させて、下から上へは硬質基質、ヒドロゲル、基板が順に配置されている3層の構造とし、それをシャーレ1に埋め込んで、よく洗って余分な架橋剤や、気泡を取り除いき、得られた装置は、直接に使用または低温で保存される。
4)まず、シート状の硬質基質5をマイクロパターン基板2の下に位置決め、または粘着させ、そして、基質を構成する生体材料を、両方の間隙に沿って、均一にを注ぎ込んで、架橋を発生させて、下から上へは硬質基質、ヒドロゲル、基板が順に配置されている3層の構造とし、それをシャーレ1に埋め込んで、よく洗って余分な架橋剤や、気泡を取り除いき、得られた装置は、直接に使用または低温で保存される。
本発明の一実施形態によれば、本発明に係る細胞コロニーの体外培養装置は、細胞コロニーが均質に成長することを実現でき、全能性幹細胞及び他の幹細胞の自己複製及び/または指向性の分化を調節できる。これにより、コロニーの形状及び大きさ、基質の機械的強度などの物理的な要因、基質の成分、成長因子及び化学シグナルなどの化学的な要因、共培養細胞などの生物的な要因を含む種々の要素を調節できる。
本発明の一実施形態によれば、本発明の形状及び大きさ、基質の機械的強度などの物理的要因を調節する方法は、次の通りである。基板の材料が切り離されて、マイクロパターンの空洞6が形成され、全能性幹細胞コロニー4が成長する物理的空間に形成されるため、コロニーの形状及び大きさがマイクロパターンの空洞6の形状及び大きさにより決められる。コンピューター支援設計及び製造技術により、多種なマイクロパターンの空洞6の形状及び大きさを便利に実現でき、同じ基板において物理的性質が異なる空洞6を切り出すことにより、同じ培養条件で、異なるコロニーの形状、大きさ及び分布の比較が可能となり、ハイスループットの検討及びスクリーニングに寄与する。上述した空洞6の形状としては、例えば、円形、正方形、長方形、ひし形、台形及び種々な不規則な形状などが挙げられる。サイズは10μm〜2cmである。
本発明の一実施形態によれば、基質の機械的強度は、主に、基質ヒドロゲル3を構成する材料(粘着ヒドロゲル3を構成する材料)の種類、使用量、及び架橋度によって決定される。一般的には、基質ヒドロゲル3を構成する材料は、使用量が多いほど、架橋度が高いと、機械的強度も高い。特に、本発明の一実施形態によれば、基質の機械的強度は、細胞コロニーの体外培養装置の使用過程に、人為による調節や、自己調節で干渉できる。人為的に基質の機械的強度を調節することは、主に基質ヒドロゲル3を構成する材料を2回または多数回にわたって架橋させることにより達成できる。例えば、基質ヒドロゲル3を構成する材料として、ゼラチン−メチルメタクリレートが用いられる場合は、それぞれの紫外線、ブルーレイなどの物理的架橋方法、ゲニピン、グルタルアルデヒドなどの化学的架橋方法により、インサイチュに所望の時点にて2回または多数回の架橋を実現できる。その結果、一般的に、基質ヒドロゲルを構成する材料の機械的強度が向上する。基質の機械的強度の自己調節は、主に細胞培養において、細胞と材料との相互作用及び材料の分解によって達成される。その結果、一般的に、基質ヒドロゲルを構成する材料の機械的強度が低下する。本発明の一実施形態によれば、人為での調節と自己調節との組み合わせにより、基質ヒドロゲルを構成する材料の機械的強度が、処理場所を変更することなくいつでも、何回も、調節・制御される。これにより、全能性幹細胞の自己複製及び指向性の分化の要求に応じるようになる。例えば、全能性幹細胞培養の初期においては、基質のより低い機械的強度が幹細胞の自己複製及び全能性の維持に寄与する。全能性幹細胞が増殖して均質にコロニーになった場合には、指向性に分化誘導されて培養されてもよい。例えば、肝細胞様細胞、心筋細胞、膵臓細胞に分化されるとき、基質のより高い機械的強度は、幹細胞が指向性に分化することに役立つ。本発明の一実施形態によれば、細胞コロニーの体外培養装置及びその調節方法により、インサイチュに、全能性幹細胞コロニーの自己複製及び指向性の分化誘導の培養を達成できる。本発明の一実施形態によれば、基質ヒドロゲルを構成する材料の使用量は、使用可能な面積により決められ、シャーレ1または硬質基質5の表面が均一に覆われるように、一般的には、1μL〜10mLである。架橋剤の種類及び使用量は、十分な架橋を発生させることを前提として、生体材料の種類及び使用量に応じて決められる。
本発明の一実施形態によれば、本発明の基質の成分、成長因子及び化学シグナルなどの化学的な要因を調節する方法は、次の通りである。
上層のマイクロパターン基板2と下層の粘着ヒドロゲル3の、生物的、物理的及び化学的性質、並びに鉛直高さの相違、及び吹き打ち、吸引などの後段の操作のため、一般的に、全能性幹細胞またはフィーダー細胞は基質ヒドロゲル3を構成する材料の表面に直接的に付着しているのであり、基質ヒドロゲルを構成する材料の表面に、生体材料をコーティングすることにより、基質の成分の変性及び調節が可能となる。例えば、コラーゲン、ゼラチン、マトリゲル、プロテオグリカン、糖蛋白質、ヒアルロン酸、ラミニン、フィブロネクチンなど各種細胞外のマトリックス成分がコーティングされることにより、細胞の粘着力が向上して、幹細胞の自己複製を適切に維持し、全能性幹細胞の指向性の分化を促進できる。本発明の一実施形態によれば、前記コーティング材料は、上述した材料に限定されるものではなく、具体的に使用可能な種類、使用量は、培養される細胞の種類、培養の目的により決められる。
本発明の一実施形態によれば、細胞コロニーの体外培養装置において、成長因子及び化学的シグナル分子が複合して持続放出することができる。本発明の実施形態によれば、要因が固定化された技術(immobilization)によって、成長因子及び化学的シグナル分子が基質ヒドロゲル層3に埋め込まれ、種々の要因がバイオニック、効率的、制御可能に持続放出することができる。これにより、要因の作動効率及び時間が向上し、体外で体内の発育をシミュレーションするのに便利で有用なモデルを与え、著しい経済効果がある。一方で、本発明の別の実施形態によれば、成長因子及び化学的シグナル分子も、溶解可能な分子で細胞培養のプロセスに関与し、手順の時間的に制御可能な要因を追加できる。これにより、分化培養を誘導する要件に応じるようになる。本発明の一実施形態によれば、ここに記載されている成長因子及び化学的シグナル分子の選択は、培養細胞の種類及び培養の目的により決められる。
本発明の実施形態によれば、本発明は、細胞の増殖培養及び分化誘導の培養などの用途で応用でき、細胞を便利に共培養する方法は、前記機能の実現を確保できる。本発明の実施形態によれば、本発明における共培養細胞などの生物的な要因を調節する方法は、具体的に以下の2つのものを含むがこれらに限定されない。
1)全能性幹細胞の自己複製を維持するためにフィーダー細胞と共培養する。本発明の一実施形態によれば、細胞コロニーの体外培養装置においては、まず、フィーダー細胞が選択的に播種されて、マイクロパターンの空洞6の基質ヒドロゲルの表面またはマイクロパターン基板2に付着させ、その後、細胞コロニーの体外培養装置に、全能性幹細胞が播種されて、フィーダー細胞との共培養である生理環境とされ、幹細胞の自己複製及び全能性の維持に寄与する。本発明の一実施形態において、フィーダー細胞の選択及び播種密度は、当業者にとって公知なものであり、具体的な選択は全能性幹細胞の種類により決められる。
2)全能性幹細胞指向性の分化を促進するために副細胞と共培養する。本発明の一実施形態によれば、細胞コロニーの体外培養装置においては、全能性幹細胞が均質にコロニーになった後に、インサイチュに指向性に分化誘導されて培養されてもよい。この場合、選択的に、副細胞と共培養されてもよい。共培養方法は、マイクロパターン基板の着脱の有無による2つの方法が含まれる。
1)全能性幹細胞の自己複製を維持するためにフィーダー細胞と共培養する。本発明の一実施形態によれば、細胞コロニーの体外培養装置においては、まず、フィーダー細胞が選択的に播種されて、マイクロパターンの空洞6の基質ヒドロゲルの表面またはマイクロパターン基板2に付着させ、その後、細胞コロニーの体外培養装置に、全能性幹細胞が播種されて、フィーダー細胞との共培養である生理環境とされ、幹細胞の自己複製及び全能性の維持に寄与する。本発明の一実施形態において、フィーダー細胞の選択及び播種密度は、当業者にとって公知なものであり、具体的な選択は全能性幹細胞の種類により決められる。
2)全能性幹細胞指向性の分化を促進するために副細胞と共培養する。本発明の一実施形態によれば、細胞コロニーの体外培養装置においては、全能性幹細胞が均質にコロニーになった後に、インサイチュに指向性に分化誘導されて培養されてもよい。この場合、選択的に、副細胞と共培養されてもよい。共培養方法は、マイクロパターン基板の着脱の有無による2つの方法が含まれる。
本発明の一実施形態によれば、基板が保留されている場合は、副細胞が、細胞コロニーの体外培養装置にインサイチュ播種されてもよい。この場合、副細胞が、マイクロパターン基板2の非空洞表面に付着して、副細胞と全能性幹細胞のコロニーとの非接触的共培養環境を構成することが好ましい。また、全能性幹細胞が均質にコロニーになった後に、マイクロパターン基板2が取り外されて、全能性幹細胞のコロニー、基質ヒドロゲル層3及び/または硬質基質5が保持されてもよい。この場合、播種される副細胞が、基質ヒドロゲル層3の全能性幹細胞のコロニーによって占めされていない表面に付着して、副細胞と全能性幹細胞のコロニーとの接触的共培養環境を構成することが好ましい。本発明の実施形態によれば、以上の方法は、基質ヒドロゲルを構成する材料の種類、全能性幹細胞の誘導される分化方向及び副細胞の種類などにより、選択されてもよい。副細胞の種類及び播種密度は、当業者にとって公知なものであり、全能性幹細胞の種類、細胞密度、及び全能性幹細胞の誘導される分化方向により決められる。
また、本発明の別の態様によれば、本発明は前述した細胞コロニーの体外培養装置の幹細胞の自己複製を調節することにおける応用を提供する。
また、本発明のさらに別の態様によれば、本発明は前述した細胞コロニーの体外培養装置の幹細胞の指向性の分化を調節することにおける応用を提供する。
本発明のまたさらなる態様によれば、本発明は幹細胞の自己複製を調節する方法を提供する。本発明の実施形態によれば、この方法は、前述した細胞コロニーの体外培養装置を利用して該幹細胞を培養することを含む。
本発明のもう1つの態様によれば、本発明は幹細胞の指向性の分化を調節する方法を提供する。本発明の実施形態によれば、この方法は、前述した細胞コロニーの体外培養装置を利用して幹細胞を培養することを含む。
尚、前記「幹細胞」は、全能性幹細胞及びその他の幹細胞を含む。
本発明のもう1つの態様によれば、本発明は細胞の単一層マイクロパターンの形成方法を提供する。本発明の実施形態によれば、この方法は、前述した細胞コロニーの体外培養装置を利用して幹細胞を培養することにより、幹細胞及び成体型細胞から選ばれる少なくとも1種の細胞の単一層マイクロパターンが形成されることを含む。
本発明のもう1つの態様によれば、本発明は細胞の多層マイクロクラスターの形成方法を提供する。本発明の実施形態によれば、この方法は、前述した細胞コロニーの体外培養装置を利用して幹細胞を培養することにより、幹細胞及び成体型細胞から選ばれる少なくとも1種の細胞の多層マイクロクラスターが形成されることを含む。
尚、本発明に記載されている細胞コロニーの体外培養装置は、特に全能性幹細胞の培養に好適であるとともに、他の種類の細胞の培養にも適用される。
(実施例)
以下、実施例に基づいて本発明を具体的に説明する。以下の実施例は本発明を限定するものとして解釈することはなされず、本発明を説明するためのものであることを、理解すべきである。以下の実施例に使用する実験方法は、特に限定されない限り、常用の方法である。以下の実施例に使用する材料、溶媒などは、特に限定されない限り、市販のものである。
以下、実施例に基づいて本発明を具体的に説明する。以下の実施例は本発明を限定するものとして解釈することはなされず、本発明を説明するためのものであることを、理解すべきである。以下の実施例に使用する実験方法は、特に限定されない限り、常用の方法である。以下の実施例に使用する材料、溶媒などは、特に限定されない限り、市販のものである。
実施例1 細胞コロニーの体外培養装置の製造
細胞コロニーの体外培養装置は、図1及び図4を参照して次のステップにより調製される。
細胞コロニーの体外培養装置は、図1及び図4を参照して次のステップにより調製される。
1.マイクロパターン基板の製造
レーザ切断法により、上層のマイクロパターン基板2を製造する。詳細は次の通りである。Rayjetレーザ彫刻機を用いて、0.5cmの厚さを有するポリメチルメタクリレートのシート(Zunbao Tech.)をカッティングして、上層のマイクロパターン基板2とする。図1に示すように、AutoCADのソフトウェアで作成されたマイクロパターン基板は、22.1mmの径を有する円形形状に構成されており、中央部は、300μm、500μm、1000μmまたは1500μmの径をそれぞれ有する空洞(8×8)が正方形を構成するように配置され、マイクロパターンされた細胞(例えば、全能性幹細胞)の培養空間として用いられて、隣り合っている空洞のピッチが1500μmである。レーザ彫刻機のパラメータは、切削動力100%、切削回数2、切削線速度10%である。
レーザ切断法により、上層のマイクロパターン基板2を製造する。詳細は次の通りである。Rayjetレーザ彫刻機を用いて、0.5cmの厚さを有するポリメチルメタクリレートのシート(Zunbao Tech.)をカッティングして、上層のマイクロパターン基板2とする。図1に示すように、AutoCADのソフトウェアで作成されたマイクロパターン基板は、22.1mmの径を有する円形形状に構成されており、中央部は、300μm、500μm、1000μmまたは1500μmの径をそれぞれ有する空洞(8×8)が正方形を構成するように配置され、マイクロパターンされた細胞(例えば、全能性幹細胞)の培養空間として用いられて、隣り合っている空洞のピッチが1500μmである。レーザ彫刻機のパラメータは、切削動力100%、切削回数2、切削線速度10%である。
脱イオン化した水を用いて、加工成形されたポリメチルメタクリレートのシートを2回水洗して、超音波で30分間洗う。そして、平坦性を改善するために熱処理を行う。熱処理は、スムーズでクリーンな加熱板を90℃にセットし、ポリメチルメタクリレート基板に圧力をかける状態で、45分間行う。
熱処理したポリメチルメタクリレート基板を、滅菌蒸留水に30分間浸漬して水洗し、無菌紙で拭いた後、安全キャビネットで両面からUVを45分間照射して殺菌し、マイクロパターン基板2を得る。
2.細胞コロニーの体外培養装置の製造
無水エタノールを用いて、光開始剤(I2959、2−ヒドロキシ−4−(2−ヒドロキシエトキシ)−2−メチルプロピオフェノン、106797−53−9、英力、中国)を、濃度0.1g/mLの光開始剤の溶液に調製する。細菌を取り除くために0.2μmのフィルター膜で濾過して、低温で保存する。
無水エタノールを用いて、光開始剤(I2959、2−ヒドロキシ−4−(2−ヒドロキシエトキシ)−2−メチルプロピオフェノン、106797−53−9、英力、中国)を、濃度0.1g/mLの光開始剤の溶液に調製する。細菌を取り除くために0.2μmのフィルター膜で濾過して、低温で保存する。
ゼラチン−メチルメタクリレートは、具体的には、DPBS溶液10mLにゼラチン(G6144、シグマ、アメリカ)1gを投入して、50℃で水浴に加熱して、十分に溶融されるまでよく攪拌した後、メチルメタクリレート(276685、シグマ、アメリカ)1mLを0.5mL/分で徐々に加えて、2時間反応した後、反応系を外して、室温まで冷却し、DPBS溶液40mLを加えて希釈して、脱イオン化した水に、8000〜12000の分画分子量を有する透析バッグで、60℃にて1週間透析をした後、遠心分離して上澄み液をとって、1週間凍結乾燥してから、ふわふわした白色の泡状の固体になり、−80℃で保存する方法により調製される。
調製されたゼラチン−メチルメタクリレートをDMEM培養液(11965092、インビトロジェン、アメリカ合衆国)に溶かして、60℃にて3時間ヒドロトロープして、濃度0.05g/mLのゼラチン−メチルメタクリレートの溶液に調製する。そして、0.2μmのフィルター膜で濾過した後、1mLチューブに保存する。
使用する場合、上述のように調製された濃度が0.1g/mLである光開始剤溶液を、濃度が0.05g/mLであるゼラチン−メチルメタクリレート溶液と、1:20の比でよく混合した後、暗所で保存する。しかも、後段の操作は、全て暗所にて行う。
製造したマイクロパターン基板2は、安全キャビネットにおいて、無菌操作の基準にしたがって、1:1の比でシャーレ1(Corning社)の培養ウェルに埋め込まれる。暗所にて、マイクロパターン基板2の底に沿って、無菌のゼラチン−メチルメタクリレート/光開始剤の溶液70μLを注ぎ込む。基板の底面とシャーレの上面との間には、均一な基質の生体物質層が形成される。5.4mW/cm2 でUVを40秒間照射することによってゼラチン−メチルメタクリレートの溶液を架橋させ、厚さが1〜100μmである基質ヒドロゲル3(下層の粘着ヒドロゲル3)を形成する。架橋剤による架橋効果及びゼラチン−メチルメタクリレートの粘着ヒドロゲルによる粘着力効果により、上から下へはマイクロパターン基板、基質ヒドロゲル層、シャーレの表面が順に配置されている細胞コロニーの体外培養装置とする(図4に示す)。そして、1mL/ウェルのDMEM溶液を用いて、細胞コロニーの体外培養装置を2回水洗する。得られた装置は、直接に使用または低温で保存される。
実施例2 実施例1の細胞コロニー培養装置による多層マイクロクラスターの形成(NIH/3T3細胞を例とする)
本実施例は、NIH/3T3細胞を例として、実施例1で製造された細胞コロニーの体外培養装置を用いて、次の手順により、多層マイクロクラスターを製造する。
本実施例は、NIH/3T3細胞を例として、実施例1で製造された細胞コロニーの体外培養装置を用いて、次の手順により、多層マイクロクラスターを製造する。
75cm2 の培養瓶において通常に培養されたNIH/3T3細胞を、トリプシン0.25%で、消化して、遠心分離して、集めた後、実施例1で製造された細胞コロニー培養装置に密度4×106 個/mLで播種し、ウェル当たりの細胞浮遊液は1mLである。24時間後、マイクロパターン基板の上層フィルムを鉗子で引き裂く。結果を図6に示す。図6より見れば、細胞層を約三層有するマイクロパターンされた均質な細胞クラスターが形成されている。ヘキスト核染色によりマイクロクラスターの均質性及び多層細胞の分布を示した。
実施例3 実施例1の細胞コロニーの体外培養装置によるヒト胚性幹細胞の培養
1.ヒト胚性幹細胞の増殖培養
MEF培養液:MEF培養液250mLに、DMEM(11965092、インビトロジェン)225mL、ウシ胎仔血清(10099141、インビトロジェン)25mL、グルタマックス(Glutamax I)(35050061、インビトロジェン)2.5mL、MEM非必須アミノ酸(MEM NEAA)(11140050、インビトロジェン)2.5mL、及びペニシリン/ストレプトマイシン(Pen/strep)(100X(15140122、インビトロジェン))2.5mLを含んでいる。
ヒト胚性幹細胞培養液:培養液250mLに、不活性化されたDMEM(10829018、インビトロジェン)200mL、不活性化された血清代替物(10828028、インビトロジェン)50mL、グルタマックス(Glutamax I)(35050061、インビトロジェン)2.5mL、MEM非必須アミノ酸(MEM NEAA)(11140050、インビトロジェン)2.5mL、ペニシリン/ストレプトマイシン(Pen/strep)(15140122、インビトロジェン)2.5mL、及びヒト塩基性線維芽細胞成長因子(hbFGF)(25μg/mL)(233−FB−025,R&D)0.08mLを含んでいる。
1.ヒト胚性幹細胞の増殖培養
MEF培養液:MEF培養液250mLに、DMEM(11965092、インビトロジェン)225mL、ウシ胎仔血清(10099141、インビトロジェン)25mL、グルタマックス(Glutamax I)(35050061、インビトロジェン)2.5mL、MEM非必須アミノ酸(MEM NEAA)(11140050、インビトロジェン)2.5mL、及びペニシリン/ストレプトマイシン(Pen/strep)(100X(15140122、インビトロジェン))2.5mLを含んでいる。
ヒト胚性幹細胞培養液:培養液250mLに、不活性化されたDMEM(10829018、インビトロジェン)200mL、不活性化された血清代替物(10828028、インビトロジェン)50mL、グルタマックス(Glutamax I)(35050061、インビトロジェン)2.5mL、MEM非必須アミノ酸(MEM NEAA)(11140050、インビトロジェン)2.5mL、ペニシリン/ストレプトマイシン(Pen/strep)(15140122、インビトロジェン)2.5mL、及びヒト塩基性線維芽細胞成長因子(hbFGF)(25μg/mL)(233−FB−025,R&D)0.08mLを含んでいる。
1.1 マウスの胚性線維芽細胞(MEF)の採取
マウスの胚性線維芽細胞(MEF)を採取する具体な手順は次の通りである。
(1)マウスを、妊馬血清性性腺刺激ホルモン(HOR−272、上海ガオチャンメディカルテクノロジー株式会社)で処理して、同期に発情させて、過剰排卵させる。
(2)雌マウスと雄マウスとを、2:1の比で交配させる。
(3)次の日、ペッサリー(即ち、乳白色または薄黄色のゼリー状もの)を有している雌マウスが取り出された。このときのマウスの妊娠期間が半日と記録される。
(4)妊娠期間が12.5〜14.5日である雌マウスが取り出され、次の実験材料とされる。
(5)(4)に記載された妊娠マウスが、頸椎脱臼法で殺され、75%のアルコールを入れたビーカーに滅菌され、超清浄なベンチで解剖される。まず、腹部の皮膚を切り開いて、子宮を露出させる。そして、別の手術器具を用いて、子宮頸部近端を、眼科用鉗子で持ち上げ、子宮間膜を分離し、子宮角をカットし、子宮を取り出し、PBSを入れたシャーレに置く。
(6)マウス胎児を取り出して、PBSで数回洗った後、その頭、尾、内臓及び手足を取り除いて、胴体を残して、PBSでよく洗って、赤血球を取り除く。
(7)別のシャーレにPBSを少し加えて、上述した胴体を入れて、それを、眼科用鉗子で、1mm3 より小さい組織片に切断する。
(8)上述した組織片に0.25%トリプシンを2〜4mL加えて、インキュベータで10〜15分間消化させて、消化時間が満了したら、等体積でMEF培養液を加えて、消化反応を終了させる。細胞浮遊液になるように、細胞をピペット操作で分散させる。
(9)上述したように得られた細胞浮遊液を、1500rpm、4分間で遠心分離した後、上澄みを捨て、赤血球溶血溶液(3〜5倍の体積である細胞体積)を加え、1分間ピペットし、上澄みを遠心分離して取り除く。赤血球が残っていると、赤血球を溶解する前記工程が繰り返される必要がある。
(10)遠心分離して、上澄みを捨て、細胞ペレットを再懸濁し、濾過して(200メッシュ)、ろ液を集め、遠心分離し、上澄みを捨る。
(11)MEF培養液を用いて、沈殿物を洗浄し、遠心分離して、上澄みを捨て、細胞ペレットを再懸濁して、培養プレートに播種した後、飽和湿度、恒温、37℃、5%CO2 の条件で、インキュベータにて培養させる。
(12)培養の次の日に培養用培地を換える。その後、培養培地を2日毎に換える。2〜4日培養してMEFの合流に近づいてから、1:3の比で継代培養をしてもよい。
(13)細胞を集めて、X線で不活化させるた。吸収量が70Gyである。
これにより、マウス胚性線維芽細胞(MEF)を得た。
マウスの胚性線維芽細胞(MEF)を採取する具体な手順は次の通りである。
(1)マウスを、妊馬血清性性腺刺激ホルモン(HOR−272、上海ガオチャンメディカルテクノロジー株式会社)で処理して、同期に発情させて、過剰排卵させる。
(2)雌マウスと雄マウスとを、2:1の比で交配させる。
(3)次の日、ペッサリー(即ち、乳白色または薄黄色のゼリー状もの)を有している雌マウスが取り出された。このときのマウスの妊娠期間が半日と記録される。
(4)妊娠期間が12.5〜14.5日である雌マウスが取り出され、次の実験材料とされる。
(5)(4)に記載された妊娠マウスが、頸椎脱臼法で殺され、75%のアルコールを入れたビーカーに滅菌され、超清浄なベンチで解剖される。まず、腹部の皮膚を切り開いて、子宮を露出させる。そして、別の手術器具を用いて、子宮頸部近端を、眼科用鉗子で持ち上げ、子宮間膜を分離し、子宮角をカットし、子宮を取り出し、PBSを入れたシャーレに置く。
(6)マウス胎児を取り出して、PBSで数回洗った後、その頭、尾、内臓及び手足を取り除いて、胴体を残して、PBSでよく洗って、赤血球を取り除く。
(7)別のシャーレにPBSを少し加えて、上述した胴体を入れて、それを、眼科用鉗子で、1mm3 より小さい組織片に切断する。
(8)上述した組織片に0.25%トリプシンを2〜4mL加えて、インキュベータで10〜15分間消化させて、消化時間が満了したら、等体積でMEF培養液を加えて、消化反応を終了させる。細胞浮遊液になるように、細胞をピペット操作で分散させる。
(9)上述したように得られた細胞浮遊液を、1500rpm、4分間で遠心分離した後、上澄みを捨て、赤血球溶血溶液(3〜5倍の体積である細胞体積)を加え、1分間ピペットし、上澄みを遠心分離して取り除く。赤血球が残っていると、赤血球を溶解する前記工程が繰り返される必要がある。
(10)遠心分離して、上澄みを捨て、細胞ペレットを再懸濁し、濾過して(200メッシュ)、ろ液を集め、遠心分離し、上澄みを捨る。
(11)MEF培養液を用いて、沈殿物を洗浄し、遠心分離して、上澄みを捨て、細胞ペレットを再懸濁して、培養プレートに播種した後、飽和湿度、恒温、37℃、5%CO2 の条件で、インキュベータにて培養させる。
(12)培養の次の日に培養用培地を換える。その後、培養培地を2日毎に換える。2〜4日培養してMEFの合流に近づいてから、1:3の比で継代培養をしてもよい。
(13)細胞を集めて、X線で不活化させるた。吸収量が70Gyである。
これにより、マウス胚性線維芽細胞(MEF)を得た。
1.2 培養装置により単一層のMEF細胞マイクロパターンの形成
上述したように不活化させたMEF(以下、単にIn−MEFと言う)を、実施例1で製造された細胞コロニーの体外培養装置に、2.5×104 個/cm2 の細胞密度で均一に播種する。低温で無菌保存された細胞コロニーの体外培養装置を利用するとき、PBSで2回洗浄して、37℃、10分間で培養してから使用する。細胞コロニーの体外培養装置にIn−MEFを播種してインキュベータに24時間置いた後、マイクロパターン基板の上層フィルムを鉗子で引き裂く。MEF培養液を、基板の表面にある細胞が取り除かれるように、シャーレのウェル壁に沿って、1mL/ウェルで2回加えて洗浄を行う。マイクロパターンニングされた空洞にあるIn−MEF細胞が残った。MEF培養液を、シャーレのウェル壁に沿って、1.5mL/ウェルで加えて、インキュベータでIn−MEF細胞を培養する。結果を図7に示す。図7からわかるように、単一層のMEF細胞マイクロパターンが形成された。live/dead蛍光で染色することにより、細胞の良い生存度がわかった。
上述したように不活化させたMEF(以下、単にIn−MEFと言う)を、実施例1で製造された細胞コロニーの体外培養装置に、2.5×104 個/cm2 の細胞密度で均一に播種する。低温で無菌保存された細胞コロニーの体外培養装置を利用するとき、PBSで2回洗浄して、37℃、10分間で培養してから使用する。細胞コロニーの体外培養装置にIn−MEFを播種してインキュベータに24時間置いた後、マイクロパターン基板の上層フィルムを鉗子で引き裂く。MEF培養液を、基板の表面にある細胞が取り除かれるように、シャーレのウェル壁に沿って、1mL/ウェルで2回加えて洗浄を行う。マイクロパターンニングされた空洞にあるIn−MEF細胞が残った。MEF培養液を、シャーレのウェル壁に沿って、1.5mL/ウェルで加えて、インキュベータでIn−MEF細胞を培養する。結果を図7に示す。図7からわかるように、単一層のMEF細胞マイクロパターンが形成された。live/dead蛍光で染色することにより、細胞の良い生存度がわかった。
1.3 培養装置によりMEF−hESC共培養マイクロパターンの形成
24時間後、細胞コロニーの体外培養装置におけるMEF培養液を取り除く。6ウェルの培養プレートで一般的に培養された合流程度が約60〜70%であるヒト胚性幹細胞H9(Wicell)を、コロニーの体外培養装置で、均一に継代培養する。6ウェルの一つに含まれている胚性幹細胞H9を、In−MEFを含有する上記の細胞コロニーの体外培養装置の12ウェルの一つに継代培養し、即ち、ヒト胚性幹細胞H9を、3:1の比で播種する。その後、37℃で、インキュベータにて10分間置いて、装置を少し傾けて上澄みを吸引する。これにより、基板の表面にあるヒト胚性幹細胞H9が取り除かれる一方、マイクロパターンニングされた空洞にあるヒト胚性幹細胞H9が残った。そして、ヒト胚性幹細胞H9培養液を、シャーレのウェル壁に沿って、1.5mL/ウェルで加えて、37℃、5%CO2 の条件で、インキュベータでMEFとヒト胚性幹細胞H9との共培養を行う。毎日、培養用培地を換えて、観察して、ヒト胚性幹細胞H9の生物学的特性を、アルカリホスファターゼの活性測定、特異的表面抗原の発現試験(例えば、SSEA−3、SSEA−4、TRA−1−60)、核転写因子の検出(例えば、OCT4)などの方法によって、同定する。
24時間後、細胞コロニーの体外培養装置におけるMEF培養液を取り除く。6ウェルの培養プレートで一般的に培養された合流程度が約60〜70%であるヒト胚性幹細胞H9(Wicell)を、コロニーの体外培養装置で、均一に継代培養する。6ウェルの一つに含まれている胚性幹細胞H9を、In−MEFを含有する上記の細胞コロニーの体外培養装置の12ウェルの一つに継代培養し、即ち、ヒト胚性幹細胞H9を、3:1の比で播種する。その後、37℃で、インキュベータにて10分間置いて、装置を少し傾けて上澄みを吸引する。これにより、基板の表面にあるヒト胚性幹細胞H9が取り除かれる一方、マイクロパターンニングされた空洞にあるヒト胚性幹細胞H9が残った。そして、ヒト胚性幹細胞H9培養液を、シャーレのウェル壁に沿って、1.5mL/ウェルで加えて、37℃、5%CO2 の条件で、インキュベータでMEFとヒト胚性幹細胞H9との共培養を行う。毎日、培養用培地を換えて、観察して、ヒト胚性幹細胞H9の生物学的特性を、アルカリホスファターゼの活性測定、特異的表面抗原の発現試験(例えば、SSEA−3、SSEA−4、TRA−1−60)、核転写因子の検出(例えば、OCT4)などの方法によって、同定する。
同定の結果、In−MEFとヒト胚性幹細胞H9とを、実施例1で得た細胞コロニーの体外培養装置で3〜4日共培養した後、ヒト胚性幹細胞H9は、マイクロパターン基板にある空洞の形状と一致している、径が300μm、500μm、1000μmまたは1500μmである均一なコロニーを8×8個形成したとともに、細胞コロニーの生物学的特性に優れた。
ここで、MEF細胞の培養及び継代培養、ヒト胚性幹細胞H9の汎用培養、継代培養及び検出は、当業者にとって公知なものであって、現在典型的な操作に準じて実施することが好ましい。
2.インサイチュヒト胚性幹細胞指向性の分化誘導
1)インサイチュヒト胚性幹細胞のプログラム式指向性の分化誘導
1.に記載されている手順により、3〜4日共培養した後、ヒト胚性幹細胞H9は、マイクロパターンニングされた空洞に、径が300μm、500μm、1000μmまたは1500μmである均質なヒト胚性幹細胞コロニーを8×8個形成したと見える(上述した生物学的特性の同定により、生物学的特性に優れた)。そして、得たヒト胚性幹細胞H9を用いて、実施例1で製造した細胞コロニーの体外培養装置にて、インサイチュヒト胚性幹細胞を分化誘導して培養する。細胞は、増殖するとともに分化しつつあり、多層の細胞マイクロクラスターを形成した。ここで、肝細胞様細胞のプログラム式指向性の分化誘導を例として、具体的なステップを説明する。
1)インサイチュヒト胚性幹細胞のプログラム式指向性の分化誘導
1.に記載されている手順により、3〜4日共培養した後、ヒト胚性幹細胞H9は、マイクロパターンニングされた空洞に、径が300μm、500μm、1000μmまたは1500μmである均質なヒト胚性幹細胞コロニーを8×8個形成したと見える(上述した生物学的特性の同定により、生物学的特性に優れた)。そして、得たヒト胚性幹細胞H9を用いて、実施例1で製造した細胞コロニーの体外培養装置にて、インサイチュヒト胚性幹細胞を分化誘導して培養する。細胞は、増殖するとともに分化しつつあり、多層の細胞マイクロクラスターを形成した。ここで、肝細胞様細胞のプログラム式指向性の分化誘導を例として、具体的なステップを説明する。
プログラム式指向性の分化誘導は、肝臓増殖を基準にして、限定的内胚葉誘導、肝前駆細胞の特殊誘導、肝細胞熟成誘導などの段階に分けられた。各段階の誘導培地は、成分により調製したのであり、処方は、50%IMDM培地(Iscove’s modified Dulbecco’s medium)、50%F12 NUT−MIX、インスリン7μg/mL、トランスフェリン15μg/mL、チオグリセロール450μmol/L及びウシ血清アルブミン5mg/mLである。誘導の開始時間は、第1日と記された。分化誘導する方法は、次の通りである。第1〜2日は、アクチビン(activin)10ng/mL、ヒト線維芽細胞成長因子2(FGF2)12ng/mLを加えた培養液で、幹細胞を培養し、毎日、培地を換える。第3〜5日は、アクチビン(activin)100ng/mL、FGF2 20ng/mL、骨形成タンパク質(BMP4)10ng/mL及び LY294003(PI3K阻害剤)10μmol/Lを加えた培養液で、ヒト胚性幹細胞H9が内胚葉細胞への分化を誘導し、毎日、培地を換える。第6〜8日は、ヒト線維芽細胞成長因子10(FGF10)50ng/mLを加えた培養液で、前の限定的内胚葉細胞への指向性の分化を誘導し、毎日、培地を換える。第9〜10日は、FGF10 50ng/mL、レチノイン酸10-7mol/L、SB431542(TGF−Smadsシグナル経路の阻害剤)10μmol/Lを加えた培養液で、肝前駆細胞への指向性の分化を誘導し、毎日、培地を換える。第11〜20日は、ヒト線維芽細胞成長因子4(FGF4)30ng/mL、肝細胞成長因子(HGF)50ng/mL、及び上皮成長因子(EGF)50ng/mLを加えた培養液で、肝細胞様細胞への指向性の分化を誘導し、2〜3日ごとに培地を換える。前述した培養工程は、全て、細胞コロニーの体外培養装置を、飽和湿度、37℃、5%CO2 の条件でインキュベータに配置することによって実施された。培地の添加は、毎回、1.5mL/ウェルである。
前述した誘導により、ヒト胚性幹細胞H9が分化した細胞は、肝臓に特異的な遺伝子AFPを発現して、アルブミンを分泌することができる。これにより、ヒト胚性幹細胞H9が指向性に肝細胞様細胞に分化したと判定された。
2)インサイチュヒト胚性幹細胞との共培養での指向性の分化誘導
前述した1)で培養されたヒト胚性幹細胞H9が、マイクロパターンニングされた空洞に、径が1000μmである均質なヒト胚性幹細胞H9コロニーを8×8個形成したと観察された場合、細胞コロニーの体外培養装置において、インサイチュ共培養して、分化培養を誘導する。ここで、肝細胞様細胞との共培養を例とする。以下、前述した1)で得たヒト胚性幹細胞H9を、実施例1で製造した細胞コロニーの体外培養装置において、インサイチュ共培養して、分化培養を誘導する。
前述した1)で培養されたヒト胚性幹細胞H9が、マイクロパターンニングされた空洞に、径が1000μmである均質なヒト胚性幹細胞H9コロニーを8×8個形成したと観察された場合、細胞コロニーの体外培養装置において、インサイチュ共培養して、分化培養を誘導する。ここで、肝細胞様細胞との共培養を例とする。以下、前述した1)で得たヒト胚性幹細胞H9を、実施例1で製造した細胞コロニーの体外培養装置において、インサイチュ共培養して、分化培養を誘導する。
具体的には、ヒトからの肝星細胞(Human Hepatic Stellate Cells、cat#5300、Sciencell)を、10%FBS、ペニシリン/ストレプトマイシン200U/mLを加えたDMEM培養液で、飽和湿度、37℃、5%CO2 のインキュベータにて、培養する。
肝星細胞の共培養を開始する前に、上層のマイクロパターン基板を鉗子で、引き裂いた。シャーレを、ヒト胚性幹細胞H9用の完全培地で2回洗った。このとき、シャーレには、基質ヒドロゲル層及びマイクロパターンニングされたヒト胚性幹細胞H9のコロニーが残っていた。肝星細胞を、ヒト胚性幹細胞H9用の完全培地に再懸濁して、細胞密度2.5×104 個/cm2 で、シャーレに均一に播種する。翌日、培地を換える。この際、肝星細胞が基質ヒドロゲル層に付着し、ヒト胚性幹細胞H9のコロニーを取り囲むように、両細胞の共培養環境とすることが好ましい。
6日後、誘導培地により、ヒト胚性幹細胞H9が肝細胞様細胞へ指向性に分化することを誘導する。誘導培地の処方は、50%IMDM培地、50%F12 NUT−MIX、インスリン7μg/mL、トランスフェリン15μg/mL、チオグリセロール450μmol/L及びウシ血清アルブミン5mg/mL、FGF4 50ng/mL,HGF 50ng/mL及びEGF 50ng/mLである。2〜3日ごとに、培地を換える。前記の培養工程は、全て、細胞コロニーの体外培養装置を、飽和湿度、37℃、5%CO2 の条件でインキュベータに配置することによって実施された。培地の添加は、毎回、1.5mL/ウェルである。
前述した誘導により、ヒト胚性幹細胞H9が分化した細胞は、肝臓に特異的な遺伝子AFPを発現して、アルブミンを分泌することができる。これにより、ヒト胚性幹細胞H9が肝細胞様細胞に指向性に分化したと判定された。
実施例4 実施例1の細胞コロニーの体外培養装置によりhESC多層の細胞マイクロクラスターの形成
実施例3に係る説明の通りhESCを培養する。6ウェルのシャーレに通常の通り培養した交流程度が60−70%であるヒト胚性幹細胞H9(Wicell)は、従来のように、消化、カット、遠心分離されて集められ、さらに、Accutase(シグマ)などの消化酵素で、単細胞に消化された。細胞を収集して、密度2×106 個/mLで、培養装置に播種させるとともに、hESC単細胞の生存率を向上させるために、培養液にROCK阻害剤Y27632を10μg/mL加えた。24時間後、高全能性、均質的な多層hESCマイクロクラスターが形成される。結果は図8に示した通りであり、アルカリホスファターゼで染色された陽性の細胞は、優れた全能性を示す。
実施例3に係る説明の通りhESCを培養する。6ウェルのシャーレに通常の通り培養した交流程度が60−70%であるヒト胚性幹細胞H9(Wicell)は、従来のように、消化、カット、遠心分離されて集められ、さらに、Accutase(シグマ)などの消化酵素で、単細胞に消化された。細胞を収集して、密度2×106 個/mLで、培養装置に播種させるとともに、hESC単細胞の生存率を向上させるために、培養液にROCK阻害剤Y27632を10μg/mL加えた。24時間後、高全能性、均質的な多層hESCマイクロクラスターが形成される。結果は図8に示した通りであり、アルカリホスファターゼで染色された陽性の細胞は、優れた全能性を示す。
本発明に係る細胞コロニーの体外培養装置は、制御可能なコロニー形状及び大きさ、並びに物理的及び化学的性質が調節可能な培養基質を有し、単一層の細胞コロニー、多層の細胞マイクロクラスター、及び共培養などの種々の培養態様を効果的に達成でき、全能性幹細胞及び他の幹細胞の自己複製、指向性分化を調節することに効果的に適用される。
本発明の具体的な実施態様を図示及び説明したが、前記開示により、種々の変形及び改変をすることができ、これらの変形及び改変は、すべて、添付の請求の範囲に含まれていることは、当業者によって認識される。本発明の範囲は、添付の請求の範囲及びその均等構成を基準にする。
本明細書において、「一実施形態」、「いくつかの実施形態」、「概略の実施形態」、「例示」、「具体的な例示」または「いくつかの例示」という用語は、この実施形態または例示に関連して説明した特徴、構造、材料、または特性が、少なくとも本開示の実施形態または例示の一つに含まれることを意味する。本明細書において、前記の概略の用語は、必ずしも同じ実施形態または例示に言及していない。さらに、特徴、構造、材料、または特性は、いずれかの実施形態または例示に、適切な方法で組み合わせることができる。
本出願は、2011年12月7日に、中華人民共和国の国家知識産権局に出願された中国特許出願第201110403987.8号の優先権及びその利益を主張し、参照によりその全内容を本明細書に援用する。
Claims (28)
- 細胞コロニーの成長空間を限定するマイクロパターンの空洞を備え、ポリメチルメタクリレートからなるマイクロパターン基板と、該マイクロパターン基板の下面に形成されている粘着ヒドロゲルとを含むことを特徴とする細胞コロニーの体外培養装置。
- 前記粘着ヒドロゲルの下面に配置されている硬質基質をさらに含むことを特徴とする請求項1に記載の細胞コロニーの体外培養装置。
- 前記粘着ヒドロゲルの下に配置され、前記マイクロパターン基板を埋め込む多孔のシャーレをさらに含むことを特徴とする請求項1に記載の細胞コロニーの体外培養装置。
- 前記粘着ヒドロゲルは、天然の生体材料及び合成の生体材料から選ばれる少なくとも1種を架橋させることによって形成されていることを特徴とする請求項1に記載の細胞コロニーの体外培養装置。
- 前記天然の生体材料は、ゼラチン、ゼラチン誘導体、アルギン酸塩、アルギン酸塩誘導体、寒天、マトリゲル、コラーゲン、プロテオグリカン、糖蛋白質、ヒアルロン酸、ラミニン及びフィブロネクチンからなる群から選ばれる少なくとも1種であることを特徴とする請求項4に記載の細胞コロニーの体外培養装置。
- 前記合成の生体材料は、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリ乳酸、ポリヒドロキシ酸、ポリ乳酸アルコール酸共重合体、ポリジメチルシロキサン、ポリ酸無水物、ポリカルボン酸エステル、ポリアミド、ポリアミノ酸、ポリアセタール、ポリシアノアクリレート、ポリウレタン、ポリピロール、ポリエステル、ポリメタクリレート、ポリエチレン、ポリカーボネート及びポリエチレンオキサイドからなる群から選ばれる少なくとも1種であることを特徴とする請求項4に記載の細胞コロニーの体外培養装置。
- 前記粘着ヒドロゲルはゼラチン−メチルメタクリレートと光開始剤である2−ヒドロキシ−4−(2−ヒドロキシエトキシ)−2−メチルプロピオフェノンとからなることを特徴とする請求項1に記載の細胞コロニーの体外培養装置。
- 前記ゼラチン−メチルメタクリレートはゼラチンとメチルメタクリレートとのポリマーであり、使用量としては、メチルメタクリレート1mLに対して、1gのゼラチンが用いられていることを特徴とする請求項7に記載の細胞コロニーの体外培養装置。
- 前記粘着ヒドロゲルは、
前記ゼラチン−メチルメタクリレートをDMEM培養液に溶かして、ゼラチン−メチルメタクリレートの溶液100mLに対して、ゼラチン−メチルメタクリレート5gを含有するゼラチン−メチルメタクリレートの溶液を調製するステップ、
前記光開始剤をエタノールに溶かして、100mLの溶液に光開始剤10gを含有する光開始剤の溶液を調製するステップ、
前記光開始剤の溶液と前記ゼラチン−メチルメタクリレートの溶液とを、体積比1:20で混合するステップ、及び
前記粘着ヒドロゲルを形成するために紫外線で前記ゼラチン−メチルメタクリレートに架橋を形成させるステップ
により調製されることを特徴とする請求項7に記載の細胞コロニーの体外培養装置。 - 前記粘着ヒドロゲルは細胞外のマトリックス成分、成長因子及び化学的シグナル分子から選ばれる少なくとも1種を含有することを特徴とする請求項1に記載の細胞コロニーの体外培養装置。
- 前記細胞外マトリックスが前記粘着ヒドロゲルにコーティングされることを特徴とする請求項1に記載の細胞コロニーの体外培養装置。
- 前記細胞外のマトリックス成分は、コラーゲン、ゼラチン、マトリゲル、プロテオグリカン、糖蛋白質、ヒアルロン酸、ラミニン及びフィブロネクチンから選ばれる少なくとも1種であることを特徴とする請求項10に記載の細胞コロニーの体外培養装置。
- 前記粘着ヒドロゲルには、成長因子と化学的シグナル分子とが埋め込まれていることを特徴とする請求項10に記載の細胞コロニーの体外培養装置。
- 前記粘着ヒドロゲルの厚さは1〜100μmであることを特徴とする請求項1に記載の細胞コロニーの体外培養装置。
- 幹細胞の自己複製を調節することを特徴とする請求項1〜14のいずれか一項に記載の細胞コロニーの体外培養装置の応用。
- 幹細胞の指向性の分化を調節することを特徴とする請求項1〜14のいずれか一項に記載の細胞コロニーの体外培養装置の応用。
- 複数のマイクロパターンの空洞を有し、ポリメチルメタクリレートからなるマイクロパターン基板と、該マイクロパターン基板の下に配置されている粘着ヒドロゲルとを含み、前記粘着ヒドロゲルと前記マイクロパターン基板とを架橋させることにより一体に接着され、細胞コロニー成長の物理的空間が前記マイクロパターン基板の前記各マイクロパターンの空洞の形状及び体積によって決められることを特徴とする細胞コロニーの体外培養装置。
- 前記粘着ヒドロゲルの下に配置されている硬質基質をさらに含むことを特徴とする請求項17に記載の細胞コロニーの体外培養装置。
- 前記粘着ヒドロゲルの下に配置され、前記マイクロパターン基板を埋め込む多孔のシャーレをさらに含むことを特徴とする請求項17に記載の細胞コロニーの体外培養装置。
- 前記粘着ヒドロゲルは、架橋でヒドロゲルを形成可能な天然の生体材料及び/または合成の生体材料を用いて作成され、前記天然の生体材料は、ゼラチン、ゼラチン誘導体、アルギン酸塩、アルギン酸塩誘導体、寒天、マトリゲル、コラーゲン、プロテオグリカン、糖蛋白質、ヒアルロン酸、ラミニン及びフィブロネクチンからなる群から選ばれる少なくとも1種であり、前記合成の生体材料は、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリ乳酸、ポリヒドロキシ酸、ポリ乳酸アルコール酸共重合体、ポリジメチルシロキサン、ポリ酸無水物、ポリカルボン酸エステル、ポリアミド、ポリアミノ酸、ポリアセタール、ポリシアノアクリレート、ポリウレタン、ポリピロール、ポリエステル、ポリメタクリレート、ポリエチレン、ポリカーボネート及びポリエチレンオキサイドからなる群から選ばれる少なくとも1種であることを特徴とする請求項17〜19のいずれか一項に記載の細胞コロニーの体外培養装置。
- 前記粘着ヒドロゲルは、ゼラチン−メチルメタクリレートと光開始剤である2−ヒドロキシ−4−(2−ヒドロキシエトキシ)−2−メチルプロピオフェノンとからなり、前記ゼラチン−メチルメタクリレートはゼラチンとメチルメタクリレートとのポリマーであって、使用量としては、メチルメタクリレート1mLに対して、1gのゼラチンが用いられていることを特徴とする請求項17〜20のいずれか一項に記載の細胞コロニーの体外培養装置。
- 前記粘着ヒドロゲルは、
1)前記ゼラチン−メチルメタクリレートをDMEM培養液に溶かして、ゼラチン−メチルメタクリレートの溶液100mLに対して、ゼラチン−メチルメタクリレート5gを含有するゼラチン−メチルメタクリレートの溶液を調製するステップ、
2)前記光開始剤である2−ヒドロキシ−4−(2−ヒドロキシエトキシ)−2−メチルプロピオフェノンをエタノールに溶かして、100mLの溶液に10gの2−ヒドロキシ−4−(2−ヒドロキシエトキシ)−2−メチルプロピオフェノンを含有する光開始剤の溶液を調製するステップ、及び
3)前記光開始剤の溶液と前記ゼラチン−メチルメタクリレートの溶液とを、体積比1:20で混合するステップ
により調製されることを特徴とする請求項21に記載の細胞コロニーの体外培養装置。 - 前記粘着ヒドロゲルの上面に、細胞外のマトリックスがコーティングされており、
前記細胞外のマトリックス成分が、コラーゲン、ゼラチン、マトリゲル、プロテオグリカン、糖蛋白質、ヒアルロン酸、ラミニン、もしくはフィブロネクチンを含んでいる、及び/または
前記粘着ヒドロゲルに、成長因子と化学的シグナル分子とが埋め込まれていることを特徴とする請求項17〜22のいずれか一項に記載の細胞コロニーの体外培養装置。 - 前記粘着ヒドロゲルの厚さは1〜100μmであることを特徴とする請求項17〜23のいずれか一項に記載の細胞コロニーの体外培養装置。
- 請求項17〜24のいずれか一項に記載の細胞コロニーの体外培養装置を利用して幹細胞を培養することを特徴とする幹細胞の自己複製を調節する方法。
- 請求項17〜24のいずれか一項に記載の細胞コロニーの体外培養装置を利用して幹細胞を培養することを含むことを特徴とする幹細胞の指向性の分化を調節する方法。
- 請求項17〜24のいずれか一項に記載の細胞コロニーの体外培養装置を利用して幹細胞及び成体型細胞から選ばれる少なくとも1種の細胞を培養することにより、細胞の単一層マイクロパターンを形成することを特徴とする細胞の単一層マイクロパターンの形成方法。
- 請求項17〜24のいずれか一項に記載の細胞コロニーの体外培養装置を利用して幹細胞及び成体型細胞から選ばれる少なくとも1種の細胞を培養することにより、細胞の多層マイクロパターンを形成することを特徴とする細胞の多層マイクロパターンの形成方法。
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