JPWO2019078278A1 - 心筋細胞に分化させるための多能性幹細胞の製造方法 - Google Patents
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Abstract
心筋細胞に分化させるための多能性幹細胞の製造方法であって、(1)弱い細胞接着性を有する基板上で多能性幹細胞を培養し、ドーム状のコロニーを形成させること、(2)ドーム状のコロニーから細胞を得ること、の各段階を含む方法を提供する。また、当該方法により得られる多能性幹細胞の集団を心筋細胞分化誘導することを含む、心筋細胞集団の製造方法を提供する。
Description
本特許出願は、日本国特許出願第2017−202029号について優先権を主張するものであり、ここに参照することによって、その全体が本明細書中へ組み込まれるものとする。
本願は、心筋細胞に分化させるための多能性幹細胞の製造方法、そのような細胞から心筋細胞を製造する方法、並びに、これらの方法により製造される多能性幹細胞または心筋細胞に関する。
本願は、心筋細胞に分化させるための多能性幹細胞の製造方法、そのような細胞から心筋細胞を製造する方法、並びに、これらの方法により製造される多能性幹細胞または心筋細胞に関する。
近年、多能性幹細胞(例えば、胚性多能性幹細胞(ES細胞)、人工多能性幹細胞(iPS細胞))の研究が進められており、再生医療、創薬研究、薬物安全性試験等の様々な用途への応用が期待されている。例えば、iPS細胞のような多能性幹細胞からヒトの心筋細胞を誘導し、これを培養して得られる心筋組織片を、移植または薬物の毒性評価や動態評価に使用することが期待されている。
このような応用には、多能性および分化能が高い均一な多能性幹細胞株を使用することが求められる。しかしながら、ES細胞の株によって、多能性と分化能が異なることが報告されている(非特許文献1〜3)。一方、iPS細胞を誘導する際には、大量に採取した細胞に初期化遺伝子を導入して初期化を行うため、得られる細胞集団は性質の異なるヘテロな細胞の混合物である。また、細胞株として樹立されたiPS細胞株の特性は各々異なる。
既存のiPS細胞株の分化誘導法の効率は、目的の細胞によって異なり、例えば、肝臓細胞、肺胞上皮細胞等への分化誘導率は低く、誘導された細胞の機能は不十分である。一方、心筋細胞の分化誘導法は開発が進んでおり(特許文献1および2、非特許文献4および5)、純度の問題はほぼ解決されている。しかしながら、多能性幹細胞から分化誘導された心筋細胞の成熟度は低く、生体内の心筋細胞とは異なるため、薬剤評価や再生医療への応用は達成されていない。
このように、多能性幹細胞から分化細胞、特に分化心筋細胞を得る技術は開発途上である。これに関連して、多能性幹細胞の培養方法を改良するために、繊維径がナノメートルのオーダーであるナノファイバーを培養基板として使用することが提唱されている(特許文献3、非特許文献6)。
Osafune, K. et al., Nat. Biotechnol. 26, 2007-2009 (2008).
Sung-Eun Kim et. al., Comparative analysis of the developmental competence of three human embryonic stem cell lines in vitro.
The International Stem Cell Initiative, Nat. Biotechnol. 25, 803-816 (2007)
Minami I, et al., Cell Rep. 2012 Nov 29; 2(5): 1448-60
Lian, X. et al. Nat. Protoc. 8, 162-175 (2013)
L. Liu et al., Biomaterials 35 (2014) 6259-67
本願の目的は、心筋細胞に分化させるための多能性幹細胞の製造方法を提供することである。本願の別の目的は、そのような細胞から心筋細胞を製造する方法を提供することである。本願のまた別の目的は、これらの方法により製造される多能性幹細胞または心筋細胞を提供することである。
本願発明者らは、弱い細胞接着性を有する基板上で多能性幹細胞を培養すると、ドーム状コロニーと単層状コロニーの2種類のコロニーが形成されることを見出した。実施例により立証される通り、ドーム状コロニーを形成する細胞は、単層状コロニーを形成する細胞よりも心筋分化能が高い。従って、本願は以下の態様を提供する。
ある態様では、本願は、心筋細胞に分化させるための多能性幹細胞の製造方法であって、
(1)弱い細胞接着性を有する基板上で多能性幹細胞を培養し、ドーム状のコロニーを形成させること、
(2)ドーム状のコロニーから細胞を得ること、
の各段階を含む方法を提供する。
(1)弱い細胞接着性を有する基板上で多能性幹細胞を培養し、ドーム状のコロニーを形成させること、
(2)ドーム状のコロニーから細胞を得ること、
の各段階を含む方法を提供する。
ある態様では、本願は、上記の方法により得られる多能性幹細胞を含む、心筋細胞を製造するための組成物を提供する。
ある態様では、本願は、上記の方法により得られる多能性幹細胞の集団を心筋細胞分化誘導することを含む、心筋細胞集団の製造方法を提供する。
ある態様では、本願は、上記の方法により製造される心筋細胞集団を提供する。
心筋細胞に分化させるための多能性幹細胞の製造方法が提供される。かくして製造された多能性幹細胞から心筋分化誘導すると、成熟度が高い心筋細胞が得られる。
特に具体的な定めのない限り、本明細書で使用される用語は、有機化学、医学、薬学、分子生物学、微生物学等の分野における当業者に一般に理解されるとおりの意味を有する。以下にいくつかの本明細書で使用される用語についての定義を記載するが、これらの定義は、本明細書において、一般的な理解に優先する。
本明細書では、数値が「約」の用語を伴う場合、その値の±10%の範囲を含むことを意図する。例えば、「約20」は、「18〜22」を含むものとする。数値の範囲は、両端点の間の全ての数値および両端点の数値を含む。範囲に関する「約」は、その範囲の両端点に適用される。従って、例えば、「約20〜30」は、「18〜33」を含むものとする。
「多能性幹細胞」とは、成体を構成する全ての細胞に分化することができる多分化能(pluripotency)と、細胞分裂を経てもその多分化能を維持することができる自己複製能を有する細胞を意味する。多能性幹細胞は、新たに樹立したものでもよく、株化されたものであってもよい。「多能性幹細胞」には、胚性多能性幹細胞(ES細胞)、胚性生殖細胞(EG細胞)、人工多能性幹細胞(iPS細胞)が含まれる。「多能性幹細胞」の生物種は特に限定はされないが、好ましくは哺乳類であり、より好ましくは齧歯類または霊長類、さらにより好ましくは霊長類である。サルまたはヒト多能性幹細胞、特にサルまたはヒトES細胞およびiPS細胞を好適に用い得る。ある実施態様では、多能性幹細胞はヒトiPS細胞である。
「弱い細胞接着性を有する基板」とは、その上で多能性幹細胞を培養したときに、少なくとも1個のドーム状コロニーが形成される基板を意味する。細胞接着性を有する物質を適当な条件で使用して常套の培養容器やカバースライド等のシートの表面を被覆することにより、弱い細胞接着性を有する基板を得ることができる。
基板の細胞接着性は、公知の方法により測定できる。例えば、予め計数した任意の接着性細胞を基板上に播種し、所定の時間(例えば、数分間〜数時間、例えば、10、20、30または40分間)インキュベートした後に細胞を洗い流し、基板に接着している細胞を計数し、下式に従い細胞接着率を算出し得る。
細胞接着率(%)=(接着細胞の数/播種細胞の数)x100%
細胞接着率は、基板の細胞接着性と細胞の接着能によって決まるので、一定の接着能の細胞(例えば、同じ組織から採取した細胞または同じ細胞株の細胞)を使用して算出した細胞接着率は、基板の細胞接着性の指標となる。
細胞接着率(%)=(接着細胞の数/播種細胞の数)x100%
細胞接着率は、基板の細胞接着性と細胞の接着能によって決まるので、一定の接着能の細胞(例えば、同じ組織から採取した細胞または同じ細胞株の細胞)を使用して算出した細胞接着率は、基板の細胞接着性の指標となる。
あるいは、細胞接着性は、Yoshikawa, H. Y. et al., J. Am. Chem. Soc. 133, 1367-1374 (2011) に記載の方法により測定できる。この方法では、基板に接着している細胞集団に対して、1点でレーザーパルスによる衝撃波を与え、その点の周囲で剥離した細胞の面積を測定し、基板と細胞の間の接着力を算出する。異なる基板と一定の接着能の細胞(例えば、同じ組織から採取した細胞または同じ細胞株の細胞)との間の接着力を測定すれば、基板の細胞接着性を比較することができる。
培養容器は、一般的に細胞培養に使用される容器であればよく、特に限定されない。本体部分の形状は、シャーレ、プレート、ボトル、チャンバー、マルチウェルプレート(例えば、6、12、24、48、96、または384ウェルプレート)等であり得る。カバースライド等のシートに細胞接着性を有する物質を被覆し、それを他の培養容器内に置いてもよい。あるいは、カバースライド等のシートに細胞接着性を有する物質を被覆し、それに孔の開いた別のシートを重ねることにより、培養容器を作製することもできる。培養容器またはシートの材質は、特に限定されない。具体的には、金属、ガラス、およびシリコーン等の無機材料、プラスチック等の有機材料を挙げることができる。
細胞接着性を有する物質としては、マトリゲル、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン等のヒドロゲル、ゼラチン、コラーゲン、ポリグリコール酸(PGA)、ポリ乳酸(PLA)およびその共重合体(PLGA)、ポリカプロラクトン(PCL)、ポリスチレン(PS)等の高分子を含むナノファイバー等が挙げられる。これらの物質は市販されている。
ヒドロゲルは、基板に所望の弱い細胞接着性を与える密度で使用する。製造業者により推奨される通常の使用密度より低い密度で使用してもよい。例えば、マトリゲル、フィブロネクチンまたはビトロネクチンは、約0.01〜1.0μg/cm2または約0.05〜0.3μg/cm2、例えば、約0.1μg/cm2の密度で培養容器を被覆するように使用し得る。例えば、ラミニンは、約0.01〜0.1μg/cm2、例えば、約0.05μg/cm2の密度で培養容器を被覆するように使用し得る。他の材料を使用する場合には、上記のヒドロゲルを上記の密度で用いて被覆した場合と同等の細胞接着性が得られるように、例えば、約0.01〜1.0μg/cm2または約0.05〜0.3μg/cm2、好ましくは約0.1μg/cm2のマトリゲルで被覆した場合と同程度の細胞接着性が得られるように、密度を調整し得る。ある実施態様では、弱い細胞接着性を有する基板は、約0.01〜1.0μg/cm2または約0.05〜0.3μg/cm2、好ましくは約0.1μg/cm2のマトリゲルで被覆したガラス表面と同程度の細胞接着性を有する基板である。
高分子を含むナノファイバーの材料としては、例えば、ゼラチン、コラーゲン、PGA、PLA、PLGA、PCL、PS等が挙げられる。ゼラチンは、主として牛骨および牛皮、豚皮を原料として製造されるが、鮭等の魚の皮や鱗を原料とする場合もあり、その由来については特に限定されない。これらの原料からゼラチンを抽出・精製する方法は周知である。また、市販のゼラチンを用いることもできる。コラーゲンは、ゼラチン製造の過程で酸・アルカリによる変性前のコラーゲン原料から精製することができる。コラーゲンの由来にも特に限定はない。また、市販のコラーゲン、例えば、細胞培養用のコーティング基質として市販されているもの等を用いることもできる。PGA、PLA、PLGA、PCL、PS等の非生体高分子は、当業者に周知の方法に従って合成したものを用いてもよく、市販のものを用いてもよい。高分子の分子量は特に限定されないが、例えば、ゼラチンの場合、約10kDa以上、好ましくは約20〜70kDa、より好ましくは約30〜40kDaの範囲で適宜選択することができる。
これらの高分子からナノファイバーを作製する方法は特に限定されず、例えばエレクトロスピニング法、コンジュゲート溶融紡糸法、メルトブロー法等が挙げられるが、エレクトロスピニング法が好ましく用いられる。エレクトロスピニング法による場合、まず高分子を適当な溶媒に溶解する。ここで用いられる溶媒としては、高分子を溶解し得る溶媒であれば、無機溶媒、有機溶媒を問わずいかなるものも使用可能であるが、例えば、ゼラチンナノファイバーの作製においては、酢酸やギ酸等が好ましく用いられ得る。コラーゲンナノファイバーの作製においては、例えば、1,1,1,2,2,2−ヘキサフルオロ−2−プロパノール等が用いられ得る。高分子溶液の濃度は特に限定されないが、好ましい繊維径および均一性を得るためには、例えば、ゼラチンの酢酸溶液を用いる場合には、約5〜15w/v%、好ましくは約8〜12w/v%の濃度範囲で使用することが望ましい。
エレクトロスピニング法は自体公知の手法に従って実施することができる。エレクトロスピニング法の原理は、電気の力で材料をスプレーし、ナノサイズの繊維にすることである。高分子溶液をシリンジに充填し、先端に注射針のようなノズルを設置したものに、シリンジポンプを接続して流速を与えるようにする。ノズルから適当な距離の位置にナノファイバーが収集するコレクタ(平板でもよいし、巻き取り式とすることもできる。平板なコレクタ上に基板、例えばガラス等を設置して、基板上にナノファイバーを形成させてもよい)を設置し、ノズル側に電源の+極、コレクタ側に−極を接続する。シリンジポンプに電圧をかけることにより、コレクタ上に高分子が噴射され、ナノファイバーが形成される。ここで、電圧、ノズルからコレクタまでの距離、ノズルの内径等により、繊維形態や繊維径が変動するが、当業者であれば、これらを適宜選択して所望の繊維径を有し、かつ均一なナノファイバーを作製することができる。例えば、後述の実施例で用いた各種条件を採用することもできるし、Advanced Drug Delivery Reviews, 61(12): 1084-1096 (2009) または Journal of Cellular and Molecular Medicine, 13(9B): 3475-3484 (2009) に記載の条件を適宜用いることもできる。
ナノファイバーは、約1〜1000nm、好ましくは約10〜800nm、より好ましくは約50〜500nmの繊維径を有し得る。ナノファイバーで被覆された培養容器上の高分子の密度は、約0.1〜10μg/cm2、好ましくは約1〜8μg/cm2、より好ましくは約3〜5μg/cm2であり得る。
ナノファイバーに好適な三次元特性を与え、かつ継代時の細胞の解離を容易にするために、生成したナノファイバーは適当な架橋剤を用いて架橋処理することが好ましい。架橋剤の種類は特に制限はないが、好ましい架橋剤として、N−エチル−N'−(ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドなどの水溶性カルボジイミド(WSC)、N−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)等が挙げられる。2種類以上の架橋剤を混合して用いてもよい。架橋処理は、例えば、架橋剤を適当な溶媒に溶解し、該架橋剤溶液中に得られたナノファイバーを浸漬することにより行うことができる。当業者であれば、架橋剤の種類に応じて、溶液濃度、架橋処理時間を適宜設定することができる。
ある態様では、ゼラチンナノファイバーを使用する。ゼラチンナノファイバーは、上記の通りに、または、例えば、特許文献3および非特許文献6等に記載の通りに製造し得る。ある実施態様では、酢酸、酢酸エチルおよび蒸留水(酢酸:酢酸エチル=3:2)の混合物にゼラチンを溶解することにより、ゼラチン(11wt%、タイプB、ブタ皮膚由来)溶液を調製し、培養カバーガラススライド上にエレクトロスピニングし(電圧:11kV、流速:0.2mL/h、時間:8分間)、次いで、0.2M N−エチル−N'−(ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドおよび0.2M N−ヒドロキシスクシンイミド(エタノール中)でゼラチンナノファイバーを4時間架橋することにより、ゼラチンナノファイバーを作成する。高分子を含むナノファイバーを使用する場合には、上記の条件で製造したゼラチンナノファイバーで培養容器を被覆した場合と同程度の細胞接着性となるように、製造条件を調整し得る。ある実施態様では、弱い細胞接着性を有する基板は、上記の条件で製造したゼラチンナノファイバーで被覆したガラス表面と同程度の細胞接着性を有する基板である。ある実施態様では、弱い細胞接着性を有する基板は、約3〜5μg/cm2のゼラチンナノファイバーで被覆したガラス表面と同程度の細胞接着性を有する基板である。
多能性幹細胞の培養は、当業者に周知の従来の方法により実施し得る。例えば、特許文献3または非特許文献6に記載の方法を用いる。例えば、多能性幹細胞を、好ましくはROCK阻害剤(例えば、Y27632)を添加した培地に懸濁し、弱い細胞接着性を有する基板上に、細胞約1×102〜1×105個/cm2、好ましくは約0.5×104〜1×105個/cm2、より好ましくは約2〜6×104個/cm2の細胞密度となるように播種する。好ましくは、1個の多能性幹細胞に由来するコロニーを取得できる密度で多能性幹細胞を播種する。より好ましくは、1つの培養容器または培養容器の1つのウェルに1個の多能性幹細胞を播種する。
培養には、多能性幹細胞の維持に適する任意の培地を使用し得る。例えば、0.1mM2−メルカプトエタノール、0.1mM非必須アミノ酸、2mM L−グルタミン酸、20%KSRおよび4ng/ml bFGFを補充したDMEM/F−12培養液(もしくは、合成培地:mTeSR、Stem Proなど)、10〜15%FBSを含有するDMEM、DMEM/F−12またはDME培養液(これらの培養液にはさらに、LIF、ペニシリン/ストレプトマイシン、ピューロマイシン、L−グルタミン、非必須アミノ酸類、β−メルカプトエタノールなどを適宜添加してもよい)または市販の培養液(例えば、マウスES細胞培養用培養液(TX−WES培養液、トロンボX社)、霊長類ES細胞培養用培養液(霊長類ES/iPS細胞用培養液、リプロセル社)を使用し得る。組換え動物タンパク質を含むmTeSR培地などの無血清培地、ヒト血清アルブミン、ヒトbFGFを含むTeSR2培地などのxenoフリー培地、E8培地などのタンパク質不含培地も使用し得る。培地はROCK阻害剤(例えば、Y27632)を含んでもよい。
培養は、例えば、CO2インキュベーター中、約1〜約10%、好ましくは約2〜約5%のCO2濃度の雰囲気下、約30〜約40℃、好ましくは約37℃で行われる。好ましくは、多能性幹細胞を播種の約2日後に、ROCK阻害剤を含まない培地と交換し、以後は1〜2日毎に新鮮な培地と交換する。
多能性幹細胞は、適当な時期に継代してもよい。多能性幹細胞を継代する際には、基板から多能性幹細胞を解離させ、単一の細胞または細胞集団を別の基板上に再播種する。例えば、酵素を含まない解離液を用いて容易に基板から細胞を解離させることができ、さらにわずかなピペッティング操作により単一の細胞まで分散させることができる。酵素を含まない解離液としては、機械的に細胞を解離する方法において従来使用されている解離液を同様に用いることができ、例えば、ハンクス液やクエン酸とEDTAを組み合わせた溶液等が挙げられる。あるいは、酵素(例えば、トリプシン、TryoLE TM Express、コラゲナーゼ、ディスパーゼ)処理により細胞を分散させてもよい。多能性幹細胞は実質的に何回でも継代することができる。
多能性幹細胞を細胞接着性の弱い基板上で適当な期間にわたって培養することにより、多能性幹細胞のコロニーが形成される。例えば、1個の細胞から、少なくとも約1〜2日間でコロニーが形成され、その後、その培養条件下で可能な限り、コロニーは成長する。かくして形成されるコロニーは、光学顕微鏡下で明確に見分けられる、ドーム状または単層状の形態を有する。「ドーム状のコロニー」とは、複数の細胞の層からなるコロニー(多層状のコロニー)である。ドーム状のコロニーは、コロニーに含まれる細胞が上下に重なり、従って最下層の細胞のみが基板と接着し、その他の細胞は基板と接着していないことを特徴とする。「単層状のコロニー」とは、1つの細胞層からなるコロニーであり、コロニーに含まれる実質的にすべての細胞が基板と接着していることを特徴とする。単層状のコロニーの高さは細胞1個分(例えば、50μm)を超えることはないのに対し、ドーム状のコロニーの高さはコロニーの成長に伴って増大する。ある実施態様では、ドーム状のコロニーは、50μm以上、60μm以上、70μm以上、80μm以上、90μm以上、100μm以上の高さのコロニーである。ある実施態様では、ドーム状のコロニーは、50μm以上の高さのコロニーである。
本願に関して、ドーム状のコロニーを構成する細胞を、DCoG細胞と称する。単層状のコロニーを構成する細胞を、MCoG細胞と称する。実施例により立証される通り、DCoG細胞の多能性および分裂能は、MCoG細胞より高い。DCoG細胞は、MCoG細胞よりも、NANOG、KLF4およびKLF5の発現レベルが高い傾向にあり、例えば、1.2倍、1.5倍、2倍、2.5倍または3倍以上高い。個々の細胞を単独で観察すると、MCoG細胞は、平坦に伸展し、長い糸状仮足を形成し得る。DCoG細胞は、あまり伸展せず、少数の短い糸状仮足を形成し、半球状であり得る。
ドーム状のコロニーから細胞を得るには、コロニー全体を回収してもよく、上記の継代操作と同様の酵素処理または機械的処理により細胞を分離させて回収してもよい。得られた細胞は、当業者に公知の方法で冷凍して保存されてもよい。得られた細胞を、継続して弱い細胞接着性を有する基板上で培養してもよく、多能性幹細胞の培養に適する他のいかなる基板上で培養してもよい。
本願の方法によれば、心筋細胞分化能が高い多能性幹細胞が得られる。「心筋細胞分化能が高い」とは、多能性幹細胞を心筋細胞に分化誘導することにより得られる細胞集団が、誘導処理の完了後に、以下の特徴の少なくとも1つを有することを意味する;(1)好ましくは約70%以上、より好ましくは約75%以上、さらに好ましくは約80%以上の、高い拍動率(全細胞クラスター中の、拍動のあるクラスターの割合)を示すこと、(2)各拍動が強いこと、好ましくは、ストレイン率(1/s)が約0.02、約0.03、約0.04または約0.05以上である、(3)好ましくは約35%、約40%、約45%または約50%以上の、高いcTnT陽性率を示すこと、および(4)心筋細胞特異的マーカーの発現レベルが高いこと。
心筋細胞特異的マーカーとしては、例えば、α−MHC、β−MHC、ACTN2、MYH7、SLC8A1、MYL2、TNNI3、CKM、MYL3、TNNT2、DES、MYL7、NAT1、GATA4、NKX2−5、HAND2、NPPA、KCNQ1、PLN、MB、RYR2およびPPCが例示される。心筋細胞特異的マーカーの発現は、従来の生化学法または免疫化学法(例えば酵素結合免疫吸着測定法、免疫組織化学的アッセイ等)により検出され得る。あるいは、心筋細胞特異的マーカーをコードする核酸の発現が評価され得る。ある実施態様では、DCoG細胞から心筋分化誘導された心筋細胞集団におけるMYH7遺伝子(β−MHCをコードする)の発現レベルは、MCoG群から心筋分化誘導された心筋細胞集団と比較して、約4倍高い。
ある態様では、上記の方法により得られる多能性幹細胞を含む、心筋細胞を製造するための組成物が提供される。当該組成物は、上記の方法により得られる多能性幹細胞を、その生存、増殖または保存に適する培地または溶液中に含む。そのような培地または溶液は、当業者に公知であり、容易に調製できるか、または、購入できる。多能性幹細胞は冷凍されていても、いなくてもよい。
ある態様では、上記方法で得られる多能性幹細胞の集団を心筋細胞分化誘導することを含む、心筋細胞集団の製造方法が提供される。実施例(特に、結果(2))により立証される通り、DCoG細胞は、心筋分化誘導されると、MCoG細胞よりも高い効率で心筋細胞に分化し、かつ、MCoG細胞よりも成熟度の高い心筋細胞に分化する。従来の心筋細胞分化誘導法では、DCoG細胞とMCoG細胞は区別されず、これらの混合物が心筋分化誘導されるため、得られる心筋細胞集団内には様々な成熟度の心筋細胞が含まれる。DCoG細胞から心筋分化誘導された心筋細胞集団は、従来の方法で得られた心筋細胞集団と比較して成熟度が高く、集団内の細胞の均一性が高い。
心筋細胞集団に関して「成熟度が高い」とは、以下の特徴の少なくとも1つを有することを意味する:(1)好ましくは約70%以上、より好ましくは約75%以上、さらに好ましくは約80%以上の、高い拍動率(全細胞クラスター中の、拍動のあるクラスターの割合)を示すこと、(2)各拍動が強いこと、好ましくは、ストレイン率(1/s)が約0.02、約0.03、約0.04または約0.05以上である、(3)好ましくは約35%、約40%、約45%または約50%以上の、高いcTnT陽性率を示すこと、および(4)心筋細胞特異的マーカーの発現レベルが高いこと。
多能性幹細胞から心筋細胞を誘導する方法は種々知られており、いかなる方法を用いてもよい。例えば特許文献1および2、並びに非特許文献4および5に記載の方法が例示される。心筋分化誘導には、RPMI/B27、IMDMなどの心筋分化誘導に適する培地を使用し得る。心筋分化誘導は、弱い細胞接着性を有する基板上で行ってもよく、心筋分化誘導に適する他のいかなる基板上で行ってもよい。
ある実施態様では、非特許文献5に記載の方法により多能性幹細胞から心筋細胞を誘導する。簡潔に述べると、(1)多能性幹細胞をGSK3阻害剤またはWNTシグナル活性化剤(例えば、CHIR99021)を含み、インシュリンを含まず、場合によりROCK阻害剤(例えば、y27632)を含む培地中で培養する工程、(2)工程(1)で得られた細胞をWNTシグナル阻害剤(例えば、IWP2またはIWP4などのポルクピン(porcupine)阻害剤、β−カテニンshRNAなどのβ−カテニン阻害剤、SO3042(2−(4−(3,4−ジメトキシフェニル)ブタンアミド)−6−ヨードベンゾチアゾール、KY03−I)、または、XAV939)を含み、インシュリンを含まない培地中で培養する工程、および、(3)工程(2)で得られた細胞を、インシュリンを含む培地中で培養する工程を含む方法により、多能性幹細胞から心筋細胞を分化誘導することができる。
ある実施態様では、特許文献2に記載の方法により多能性幹細胞から心筋細胞を誘導する。簡潔に述べると、(1)多能性幹細胞をGSK3阻害剤またはWNTシグナル活性化剤(例えば、CHIR99021)およびPKC活性化剤(例えば、ホルボール12−ミリスタート13−アセタート)を含む培地中で培養する工程、および;(2)工程(1)で得られた細胞をWNTシグナル阻害剤(例えば、SO3042およびXAV939)、Src阻害剤(例えば、A419259)、およびEGF受容体阻害剤(例えば、AG1478)を含む培地中で培養する工程を含む方法により、多能性幹細胞から心筋細胞を分化誘導することができる。
ある態様では、上記の方法により得られる心筋細胞集団が提供される。別の態様では、上記の方法により得られる心筋細胞集団を含む組成物が提供される。当該組成物は、心筋細胞集団を、その生存または保存に適する培地または溶液中に含む。そのような培地または溶液は、当業者に公知であり、容易に調製できるか、または、購入できる。心筋細胞集団は冷凍されていても、いなくてもよい。
例えば、本願は下記の実施態様を提供する。
[1]心筋細胞に分化させるための多能性幹細胞の製造方法であって、
(1)弱い細胞接着性を有する基板上で多能性幹細胞を培養し、ドーム状のコロニーを形成させること、
(2)ドーム状のコロニーから細胞を得ること、
の各段階を含む方法。
[2]基板が、ヒドロゲルまたはナノファイバーを含む、第1項に記載の方法。
[3]心筋細胞に分化させるための多能性幹細胞の製造方法であって、
(1)ヒドロゲルまたはナノファイバーを含む基板上で、多能性幹細胞を培養し、ドーム状のコロニーを形成させること、
(2)ドーム状のコロニーから細胞を得ること、
の各段階を含む方法。
[4]基板がヒドロゲルを含む、第2項または第3項に記載の方法。
[5]ヒドロゲルが、マトリゲル、フィブロネクチン、ビトロネクチンまたはラミニンである、第5項に記載の方法。
[6]ヒドロゲルが、マトリゲル、フィブロネクチンまたはビトロネクチンを含む、第4項または第5項に記載の方法。
[7]マトリゲル、フィブロネクチンまたはビトロネクチンの密度が、約0.01〜1.0μg/cm2である、第6項に記載の方法。
[8]マトリゲル、フィブロネクチンまたはビトロネクチンの密度が、約0.05〜0.3μg/cm2である、第6項または第7項に記載の方法。
[9]マトリゲル、フィブロネクチンまたはビトロネクチンの密度が、約0.1μg/cm2である、第6項ないし第8項のいずれかに記載の方法。
[10]ヒドロゲルがマトリゲルである、第5項ないし第9項のいずれかに記載の方法。
[11]ヒドロゲルがラミニンである、第5項に記載の方法。
[12]ラミニンの密度が、約0.01〜0.1μg/cm2である、第11項に記載の方法。
[13]ラミニンの密度が、約0.05μg/cm2である、第11項または第12項に記載の方法。
[14]基板がナノファイバーを含む、第2項または第3項に記載の方法。[15]ナノファイバーが、ゼラチン、コラーゲン、ポリグリコール酸(PGA)、ポリ乳酸(PLA)もしくはその共重合体(PLGA)、ポリカプロラクトン(PCL)またはポリスチレン(PS)を含む、第14項に記載の方法。
[16]ナノファイバーがゼラチンナノファイバーである、第14項または第15項に記載の方法。
[17]ゼラチンナノファイバーの密度が約3〜5μg/cm2である、第16項に記載の方法。
[18]ゼラチンナノファイバーの直径が約50〜500nmである、第16項または第17項に記載の方法。
[19]ゼラチンナノファイバーが分子量約30〜40kDaのゼラチンを含む、第16項ないし第18項のいずれかに記載の方法。
[20]ゼラチンナノファイバーが架橋されている、第16項ないし第19項のいずれかに記載の方法。
[21]ドーム状のコロニーが、50μm以上、60μm以上、70μm以上、80μm以上、90μm以上または約100μm以上の高さのコロニーである、第1項〜第20項のいずれかに記載の方法。
[22]ドーム状のコロニーが、50μm以上の高さのコロニーである、第1項〜第21項のいずれかに記載の方法。
[23]段階(1)において、1個の多能性幹細胞に由来するコロニーを形成させる、第1項〜第22項のいずれかに記載の方法。
[24]第1項ないし第23項のいずれかに記載の方法により得られる多能性幹細胞を含む、心筋細胞を製造するための組成物。
[25]第1項ないし第23項のいずれかに記載の方法を含む、第22項に記載の組成物の製造方法。
[26]第1項ないし第23項のいずれかに記載の方法により得られる多能性幹細胞の集団を心筋細胞分化誘導することを含む、心筋細胞集団の製造方法。
[27]心筋細胞集団の製造方法であって、
(1)第1項ないし第23項のいずれかに記載の方法により多能性幹細胞を得ること、
(2)(1)で得られた細胞の集団を心筋細胞分化誘導すること、
の各段階を含む方法。
[26]第26項または第27項に記載の方法により製造される心筋細胞集団。
[1]心筋細胞に分化させるための多能性幹細胞の製造方法であって、
(1)弱い細胞接着性を有する基板上で多能性幹細胞を培養し、ドーム状のコロニーを形成させること、
(2)ドーム状のコロニーから細胞を得ること、
の各段階を含む方法。
[2]基板が、ヒドロゲルまたはナノファイバーを含む、第1項に記載の方法。
[3]心筋細胞に分化させるための多能性幹細胞の製造方法であって、
(1)ヒドロゲルまたはナノファイバーを含む基板上で、多能性幹細胞を培養し、ドーム状のコロニーを形成させること、
(2)ドーム状のコロニーから細胞を得ること、
の各段階を含む方法。
[4]基板がヒドロゲルを含む、第2項または第3項に記載の方法。
[5]ヒドロゲルが、マトリゲル、フィブロネクチン、ビトロネクチンまたはラミニンである、第5項に記載の方法。
[6]ヒドロゲルが、マトリゲル、フィブロネクチンまたはビトロネクチンを含む、第4項または第5項に記載の方法。
[7]マトリゲル、フィブロネクチンまたはビトロネクチンの密度が、約0.01〜1.0μg/cm2である、第6項に記載の方法。
[8]マトリゲル、フィブロネクチンまたはビトロネクチンの密度が、約0.05〜0.3μg/cm2である、第6項または第7項に記載の方法。
[9]マトリゲル、フィブロネクチンまたはビトロネクチンの密度が、約0.1μg/cm2である、第6項ないし第8項のいずれかに記載の方法。
[10]ヒドロゲルがマトリゲルである、第5項ないし第9項のいずれかに記載の方法。
[11]ヒドロゲルがラミニンである、第5項に記載の方法。
[12]ラミニンの密度が、約0.01〜0.1μg/cm2である、第11項に記載の方法。
[13]ラミニンの密度が、約0.05μg/cm2である、第11項または第12項に記載の方法。
[14]基板がナノファイバーを含む、第2項または第3項に記載の方法。[15]ナノファイバーが、ゼラチン、コラーゲン、ポリグリコール酸(PGA)、ポリ乳酸(PLA)もしくはその共重合体(PLGA)、ポリカプロラクトン(PCL)またはポリスチレン(PS)を含む、第14項に記載の方法。
[16]ナノファイバーがゼラチンナノファイバーである、第14項または第15項に記載の方法。
[17]ゼラチンナノファイバーの密度が約3〜5μg/cm2である、第16項に記載の方法。
[18]ゼラチンナノファイバーの直径が約50〜500nmである、第16項または第17項に記載の方法。
[19]ゼラチンナノファイバーが分子量約30〜40kDaのゼラチンを含む、第16項ないし第18項のいずれかに記載の方法。
[20]ゼラチンナノファイバーが架橋されている、第16項ないし第19項のいずれかに記載の方法。
[21]ドーム状のコロニーが、50μm以上、60μm以上、70μm以上、80μm以上、90μm以上または約100μm以上の高さのコロニーである、第1項〜第20項のいずれかに記載の方法。
[22]ドーム状のコロニーが、50μm以上の高さのコロニーである、第1項〜第21項のいずれかに記載の方法。
[23]段階(1)において、1個の多能性幹細胞に由来するコロニーを形成させる、第1項〜第22項のいずれかに記載の方法。
[24]第1項ないし第23項のいずれかに記載の方法により得られる多能性幹細胞を含む、心筋細胞を製造するための組成物。
[25]第1項ないし第23項のいずれかに記載の方法を含む、第22項に記載の組成物の製造方法。
[26]第1項ないし第23項のいずれかに記載の方法により得られる多能性幹細胞の集団を心筋細胞分化誘導することを含む、心筋細胞集団の製造方法。
[27]心筋細胞集団の製造方法であって、
(1)第1項ないし第23項のいずれかに記載の方法により多能性幹細胞を得ること、
(2)(1)で得られた細胞の集団を心筋細胞分化誘導すること、
の各段階を含む方法。
[26]第26項または第27項に記載の方法により製造される心筋細胞集団。
本明細書で引用するすべての文献は、出典明示により本明細書の一部とする。
上記の説明は、すべて非限定的なものであり、添付の特許請求の範囲において定義される本発明の範囲から逸脱せずに、変更することができる。さらに、下記の実施例は、すべて非限定的な実施例であり、本発明を説明するためだけに供されるものである。
上記の説明は、すべて非限定的なものであり、添付の特許請求の範囲において定義される本発明の範囲から逸脱せずに、変更することができる。さらに、下記の実施例は、すべて非限定的な実施例であり、本発明を説明するためだけに供されるものである。
材料と方法
単細胞培養デバイスの作製
ゼラチンナノファイバー(GNF)をエレクトロスピニング法により培養カバーガラススライド上に作製した(ノズルからコレクタ(カバーガラススライド)までの距離:11cm、シリンジ針:23G、電圧:11kV、流速:0.2mL/h)。
エレクトロスピニングの16時間前に、酢酸(42wt%)、酢酸エチル(28wt%)および蒸留水(20wt%)の混合物にゼラチンを溶解し、ゼラチン(11wt%、タイプB、ブタ皮膚由来;Sigma-Aldrich、米国)溶液を調製した。異なる密度のGNFサンプルを得るために、サンプルを8分間エレクトロスピニングした。エレクトロスピニングの後、エタノール中の0.2M N−エチル−N'−(ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドおよび0.2M N−ヒドロキシスクシンイミドでGNFを4時間架橋した。使用前にGNFを70%エタノールで3回すすぎ、乾燥させた。
単細胞培養デバイスの作製
ゼラチンナノファイバー(GNF)をエレクトロスピニング法により培養カバーガラススライド上に作製した(ノズルからコレクタ(カバーガラススライド)までの距離:11cm、シリンジ針:23G、電圧:11kV、流速:0.2mL/h)。
エレクトロスピニングの16時間前に、酢酸(42wt%)、酢酸エチル(28wt%)および蒸留水(20wt%)の混合物にゼラチンを溶解し、ゼラチン(11wt%、タイプB、ブタ皮膚由来;Sigma-Aldrich、米国)溶液を調製した。異なる密度のGNFサンプルを得るために、サンプルを8分間エレクトロスピニングした。エレクトロスピニングの後、エタノール中の0.2M N−エチル−N'−(ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドおよび0.2M N−ヒドロキシスクシンイミドでGNFを4時間架橋した。使用前にGNFを70%エタノールで3回すすぎ、乾燥させた。
ポリジメチルシロキサン(PDMS、Sylgard 184、Dow Corning Toray、日本)を、1:10の割合で、高さ100μmのピラーの列を含むシリコンウェハーにスピンコーティングすることにより、マルチウェルメンブレンを作製した。この型は、SU8−100(Microchem、日本)による標準的なフォトリソグラフィーにより得られた。70℃で10分間硬化させた後、PDMSメンブレンを型から剥がした。エタノールですすぎ、乾燥させた後、このマイクロウェルをGNFサンプル上に置いた。これにより、直径1000μmのウェルを400個有する単細胞培養デバイスが得られた。
単一のhPSCの単離と培養
細胞をGNF基板から回収し、計数し、希釈し、細胞2x103個/mLの密度の培養物とした。細胞浮遊液(200mL)を単細胞培養デバイスに播いた。2時間後、2mLの培養上清(同じ細胞を、mTeSR1培地中、ゼラチンナノファイバー上で1〜3日間培養した培養上清)を添加し、1〜2日毎に交換した。単一の細胞に由来するコロニーが形成されたら、酵素を含まない溶液により解離させ、再度新しいGNF基板に播いて増殖させた。
細胞をGNF基板から回収し、計数し、希釈し、細胞2x103個/mLの密度の培養物とした。細胞浮遊液(200mL)を単細胞培養デバイスに播いた。2時間後、2mLの培養上清(同じ細胞を、mTeSR1培地中、ゼラチンナノファイバー上で1〜3日間培養した培養上清)を添加し、1〜2日毎に交換した。単一の細胞に由来するコロニーが形成されたら、酵素を含まない溶液により解離させ、再度新しいGNF基板に播いて増殖させた。
多能性幹細胞の培養
ヒトiPSC株253G1(IMR)およびヒトESC細胞株H1およびH9を研究に使用した。hESCは、京都大学のガイドラインに従って使用した。細胞を、4x104個/cm2で、10μMのROCK阻害剤Y27632(Wako Chemicals、日本)を添加したmTeSR−1細胞培養培地(Stem Cell Technologies、米国)中、GNFまたはマトリゲル(MG)被覆基板(BD Biosciences、米国)上に播いた。48時間後、培地をY27632を含まないものに交換した。培養培地を毎日交換した。細胞を単一の細胞に解離させ、3〜4日毎に植え継いだ。非酵素的細胞解離のために、エチレンジアミンテトラ酢酸をベースとする溶液(Thermo Fisher Scientific、米国)を使用してGNF基板上で培養された細胞を回収し、TrypLE Express (GIBCO, USA) を使用してMG被覆基板上で培養された細胞を回収した。2種類の細胞を比較する場合、全く同じ培養条件で培養した。20分間隔で48時間にわたり、顕微鏡(IX81, Olympus Co., Japan)下で、37℃、5%CO2下で、種々の領域の画像をスキャンし、継続的に取得した。
ヒトiPSC株253G1(IMR)およびヒトESC細胞株H1およびH9を研究に使用した。hESCは、京都大学のガイドラインに従って使用した。細胞を、4x104個/cm2で、10μMのROCK阻害剤Y27632(Wako Chemicals、日本)を添加したmTeSR−1細胞培養培地(Stem Cell Technologies、米国)中、GNFまたはマトリゲル(MG)被覆基板(BD Biosciences、米国)上に播いた。48時間後、培地をY27632を含まないものに交換した。培養培地を毎日交換した。細胞を単一の細胞に解離させ、3〜4日毎に植え継いだ。非酵素的細胞解離のために、エチレンジアミンテトラ酢酸をベースとする溶液(Thermo Fisher Scientific、米国)を使用してGNF基板上で培養された細胞を回収し、TrypLE Express (GIBCO, USA) を使用してMG被覆基板上で培養された細胞を回収した。2種類の細胞を比較する場合、全く同じ培養条件で培養した。20分間隔で48時間にわたり、顕微鏡(IX81, Olympus Co., Japan)下で、37℃、5%CO2下で、種々の領域の画像をスキャンし、継続的に取得した。
結果
(1)GNF基板上で培養された多能性幹細胞の特徴解析
ヒトiPS細胞(hiPSC)を従来のマトリゲル(MG)被覆基板ではなく、GNF基板上で培養すると、同じhiPSC培養条件で形態の異なる2種類のコロニーが観察された。この現象をさらに調べるために、ポリジメチルシロキサンマルチウェルメンブレンおよびGNF基板を含む単細胞培養デバイスを開発した(図1)。単一のヒト多能性幹細胞(hPSC)を単離し、条件培地を使用して培養すると、形態により識別可能な2種類のコロニーを形成した(図2)。
(1)GNF基板上で培養された多能性幹細胞の特徴解析
ヒトiPS細胞(hiPSC)を従来のマトリゲル(MG)被覆基板ではなく、GNF基板上で培養すると、同じhiPSC培養条件で形態の異なる2種類のコロニーが観察された。この現象をさらに調べるために、ポリジメチルシロキサンマルチウェルメンブレンおよびGNF基板を含む単細胞培養デバイスを開発した(図1)。単一のヒト多能性幹細胞(hPSC)を単離し、条件培地を使用して培養すると、形態により識別可能な2種類のコロニーを形成した(図2)。
種々のhPSC株(hiPSC株:253G1およびIMR、hESC(ヒトES細胞)株:H1およびH9)において、これらの2つのサブタイプの存在が確認された。GNF基板上で増殖させると、単細胞由来コロニーの大部分は平坦な単層状のコロニー(Monolayer Colony on Gelatin(MCoG)と称する)の形態を示し、他方のサブタイプは密集したドーム状のコロニー(Domo-like Colony on Gelatin(DCoG)と称する)の形態を示した(図3)。細胞の三次元イメージングにより動画を作成したところ、MCoGの単層構造と、DCoGの多層構造が確認された。コロニーの高さも大きく異なっていた(図4)。MCoGおよびDCoG細胞のリアルタイム観察は、2種類の細胞が接着時から異なる形態を示し、増殖中に差異が顕著になっていくことを明らかにした。さらに、これらの単一細胞由来クローンの自己新生特性および形態は、GNF基板上で、27回を超えて継代しても、安定して維持された。これらの2種類の細胞からさらに単一の細胞を単離すると、それから得られたコロニーは、それぞれの形態を維持した。加えて、ショートタンデムリピート分析により、細胞株間での相互の混入はないことが示された。
DCoG細胞の平均倍加時間は、22±0.7時間であり、MCoG細胞の26.5±1.5hより短かった。細胞周期をフローサイトメトリーにより分析した結果、MCoG細胞ではG0/G1期:38.53%、S期:28.26%、M/G2期:30.17%、DCoG細胞では、G0/G1期:27.53%、S期:25.46%、M/G2期:46.09%であり、MCoG細胞(58.43%)と比較して高い割合のDCoG細胞(71.55%)がM/G2期およびS期にあることが示された。
26回継代した後のこれらの2種類の細胞の多能性を評価した。両サブタイプは、OCT4、NANOGおよびアルカリホスファターゼ等の多能性マーカー陽性であり、分化系列決定マーカー(PAX6、ブラキュリおよびAFP)のレベルは最小限であった。フローサイトメトリー分析により、99.6%以上の細胞がSSEA4およびTRA−1−60を発現することが示された。次いで、2種類のクローンのインビトロおよびインビボでの分化能力を調べた。MCoGおよびDCoG細胞は、胚様体および奇形腫を形成し、それらは三胚葉すべての細胞に分化できた。さらに、これらのクローンは27回を超えて継代しても正常な核型を維持した。これらの結果は、単一のhPSCに由来する両方のサブタイプが、GNF上での長期培養後に適切な多能性を維持することを示す。
(2)DCoG細胞の心筋細胞分化能
生物学的な差異を調べるために、非特許文献5に記載の方法に従ってWntシグナル伝達を調節することにより、2種類の細胞を心筋細胞(CM)への分化誘導に付した(図5)。簡単に説明すると、MCoGおよびDCoG細胞を、CHIR99021(12μM)およびy27632(10μM)を含むRPMI/B27(インシュリン不含)中で2日間培養し、RPMI/B27(インシュリン不含)中で2日間培養し、IWP2(5μM)を含むRPMI/B27(インシュリン不含)中で2日間培養し、RPMI/B27(インシュリン不含)中で3日間培養し、その後、細胞をRPMI/B27(インシュリン含有)中で維持した。
生物学的な差異を調べるために、非特許文献5に記載の方法に従ってWntシグナル伝達を調節することにより、2種類の細胞を心筋細胞(CM)への分化誘導に付した(図5)。簡単に説明すると、MCoGおよびDCoG細胞を、CHIR99021(12μM)およびy27632(10μM)を含むRPMI/B27(インシュリン不含)中で2日間培養し、RPMI/B27(インシュリン不含)中で2日間培養し、IWP2(5μM)を含むRPMI/B27(インシュリン不含)中で2日間培養し、RPMI/B27(インシュリン不含)中で3日間培養し、その後、細胞をRPMI/B27(インシュリン含有)中で維持した。
分化誘導開始後9日目に、拍動率(全細胞クラスター中の、拍動のあるクラスターの割合)は、MCoG群で69%、DCoG群で84%であった。フローサイトメトリーの結果、10日目に、cTnT(心筋細胞特異的マーカー)陽性細胞がMCoG群の31.9±9.3%、DCoG群の56.4±14.6%に見られた。この分化効率の有意な差異に加えて、分化した心筋細胞組織構造は、MCoG群とDCoG群で異なり、DCoG群には生体内の心筋構造に類似する細長い構造が見られたが、MCoG群ではそのような構造は見られなかった(図6)。心筋細胞の運動を画像で記録し、フレーム対フレームの相関解析(frame to frame cross correlation)アルゴリズム(Eng, G. et al., Nat. Commun. 7, 1-10 (2016))においてピクセルの動きを追跡することにより、心筋細胞の収縮機能を示すストレインマップ(Strain map)を生成した。DCoG群は、拍動毎にMCoG群より高いストレイン率(ひずみ速度;一定時間内での細胞の変形量を示す)を示し(図7a)、DCoG群は、MCoG群の6倍のストレイン/拍動を示した(図7b)。
次いで、2種類の細胞におけるCM関連遺伝子の発現を調べた。MCoG群と比較して、DCoG群において、心室構造(MYL2、HAND2、MYL3)、心臓のナトリウム/カリウムチャネル(SLC8A1、KCNQ1)、初期の心臓の転写因子(GATA4およびNKX2−5)、ER−Ca2+機能(PLN)、β1−アドレナリン受容体(ADRB1)、心房性ナトリウム利尿ペプチド(NPPA)およびATP活性(CKM)を含む多数の遺伝子が上方調節されていた(図8)。さらに、DCoG群におけるMYH7遺伝子(心筋細胞成熟の重要なマーカーであるβ−MHCをコードする)の発現レベルは、MCoG群よりも4倍高かった。
これらの結果は、DCoG細胞は、MCoG細胞より高い分化効率で、MCoG細胞より成熟度と機能が高い心筋細胞に分化することを示す。異なる幹細胞株間で分化効率が異なることはこれまでに報告されているが、本実施例の結果は、同じ細胞株内のサブタイプ間に差異があることを示し、多能性幹細胞をベースとする分化方法のために、より適切な前駆細胞が必要であることを示唆する。
(3)MCoGおよびDCoG細胞に対する基板の影響
2種類の細胞サブタイプに対する基板の影響を調べるために、10回継代する間、GNF基板をMG基板(マトリゲル密度:10μg/cm2)で置き換えた。DCoG細胞をMG基板に播くと、ドーム状から平坦な単層状に形態が変化した。興味深いことに、これらの細胞をGNF基板に播き直すと、再度ドーム状のコロニーを形成した。対照的に、MCoG細胞のコロニー形態は、GNF基板でもMG基板でも変化しなかった(図9)。DCoG細胞は基板の変化に感受性であり、MCoG細胞はそうではないと考えられ、このことは、2種類の細胞間に、従来の基板で培養しても見出せなかった何らかの内在的な差異があることを示唆する。典型的には、DCoG細胞は基板感受性であり、MCoG細胞は基板非感受性である。標準的な多能性幹細胞の大部分は基板非感受性細胞であり(本実施例では、単離された単一細胞由来クローンの>90%が基板非感受性細胞である)、基板の特性の変化に感受性ではない。
2種類の細胞サブタイプに対する基板の影響を調べるために、10回継代する間、GNF基板をMG基板(マトリゲル密度:10μg/cm2)で置き換えた。DCoG細胞をMG基板に播くと、ドーム状から平坦な単層状に形態が変化した。興味深いことに、これらの細胞をGNF基板に播き直すと、再度ドーム状のコロニーを形成した。対照的に、MCoG細胞のコロニー形態は、GNF基板でもMG基板でも変化しなかった(図9)。DCoG細胞は基板の変化に感受性であり、MCoG細胞はそうではないと考えられ、このことは、2種類の細胞間に、従来の基板で培養しても見出せなかった何らかの内在的な差異があることを示唆する。典型的には、DCoG細胞は基板感受性であり、MCoG細胞は基板非感受性である。標準的な多能性幹細胞の大部分は基板非感受性細胞であり(本実施例では、単離された単一細胞由来クローンの>90%が基板非感受性細胞である)、基板の特性の変化に感受性ではない。
次いで、単細胞レベルでのMCoG細胞およびDCoG細胞に対する基板の影響を観察した(図10)。GNF基板上で培養したDCoG細胞は、伸展せず、非常に少数の短い糸状仮足を形成し、半球状であった。対照的に、MCoG細胞は、GNFおよびMG基板の両方で平坦に伸展し、長い糸状仮足を形成した。DCoG細胞はMG基板上ではMCoG細胞に似た形態を示し、よく伸展して長い糸状仮足を形成した。
MCoG細胞およびDCoG細胞に関して、RNA分析の結果は、3092個の遺伝子の発現における差異を示し、遺伝子オントロジー(GO)による機能的アノテーション解析は、DCoG細胞で下方調節されている遺伝子の殆どが細胞接着に関連することを示した。これらのデータは、DCoG細胞はMCoG細胞よりも接着能が低いことを示唆し、このことは、細胞接着試験により確認された(図11)。一方、GNF基板の接着性は従来の基板(例えば、推奨密度で使用されるMGまたはラミニン(LA))よりも低いことが、以前の研究で示されている(非特許文献5)。さらに、細胞と基板の接着の強さを衝撃波による方法(Yoshikawa, H. Y. et al., J. Am. Chem. Soc. 133, 1367-1374 (2011))を用いて定量した。試験した4つすべての条件で(MCoG細胞およびDCoG細胞を、それぞれGNFおよびMG基板上で)、GNF基板上のDCoG細胞は、最も低い細胞−マトリックス接着を示した(図12)。GNF基板上のDCoG細胞のみがドーム状コロニーを形成することに留意すべきである。これらの4条件で多能性遺伝子の発現を調べたところ、GNF上で培養されたDCoG細胞は、他の条件と比較して高いNANOGおよびKLF4/KLF5の発現レベルを示した(図13)。
これらの現象をもたらすメカニズムを調べるために、細胞接着、運動性、形態および運命決定を制御する転写因子である、血清応答因子(SRF)に注目した。SRFは、その補因子であるMAL(MRTF−AまたはMKL1としても知られる)と相互作用したときにのみ、活性化される。MALは、球状アクチン(G−アクチン)レベルの変動に感受性である。核内で、G−アクチンはMALに結合し、MALがSRFに結合することを防ぎ、G−アクチン依存性核外輸送を活性化して核内のMAL量を減らし、かくしてSRF転写の抑制をもたらす。G−アクチンは、糸状アクチン(F−アクチン)細胞骨格の単量体として存在し、G−アクチンとF−アクチンは相互に変換できる。細胞の接着および伸展の上昇に伴って、F−アクチンのレベルが上昇することが報告されている。一方、F−アクチンの脱重合化は、リプログラミング過程を促進し、かくしてiPSCの生成を増進し得ることが知られている。
細胞を低接着性のGNF基板上で培養すると、顕著なF−アクチンストレスファイバーがMCoG細胞の糸状仮足と細胞体の全体に広がった。対照的に、DCoG細胞では、F−アクチンは皮層の細胞外殻(cortical cell shell)に局在した(図14)。F−アクチンおよびG−アクチンを、ファロイジンおよびDNaseIをそれぞれ用いる蛍光分析により定量したところ、DCoG細胞では有意にF−アクチンのレベルが低く、G−アクチンのレベルが高かった(図15)。DCoG細胞における高いG−アクチンレベルは、核から細胞質に輸送されるMALの量の増加をもたらした。MALはMCoG細胞の核で高濃度であった(図16)。加えて、高接着性のMG基板上では、DCoGとMCoG細胞のアクチン細胞骨格およびMAL分布に差異はなかった。
さらに、2種類の形態の異なるコロニーを形成する細胞の出現は、細胞−細胞接触の密度に実質的な差異があり得ることを示唆する。DCoG細胞では、MCoG細胞よりも細胞−細胞相互作用が強く、E−カドヘリン発現が高かった(図17)。
(4)様々な基板上でのDCoGおよびMCoG細胞の培養
Miyazaki, T. et al., Nat. Commun. 3, 1210-1236 (2012) の記載に従い、細胞−マトリックス接着を測定した。ヒドロゲル(マトリゲル、フィブロネクチン、ビトロネクチンおよびラミニン)の密度を変えて、接着特性の異なる基板を用意した。推奨密度のヒドロゲル(例えば、10μg/cm2マトリゲル)で被覆された基板では、2種類の細胞は同様の細胞−マトリックス接着を示したが、DCoG細胞の細胞−マトリックス接着は、密度の低下に伴って、MCoG細胞よりも急速に低下した(図18)。フィブロネクチン、ビトロネクチンおよびラミニンでも、同様の傾向が見られた(図19)。低密度でMG被覆された基板(0.1μg/cm2)上でDCoG細胞を培養すると、ドーム状のコロニーを形成し、KLF4/5およびNANOG発現の上方調節を示した(図20および21)。高密度でMG被覆された基板(1および10μg/cm2)上では、DCoG細胞は単層のコロニーを形成し、MCoG細胞と同様のKLF4/5およびNANOG遺伝子発現を示した(図20および21)。対照的に、MCoG細胞については、MG密度を変えても形態および発現パターンに明白な変化は観察されなかった(図20および21)。このように、低密度のマトリゲルで被覆した基板上では、DCoG細胞は、GNF上で培養した場合と同様に、ドーム状のコロニーを形成することが明らかになった。細胞−マトリックス接着の結果から、他のヒドロゲルを低密度で使用した場合でも、DCoG細胞はドーム状のコロニーを形成することが示唆される。
Miyazaki, T. et al., Nat. Commun. 3, 1210-1236 (2012) の記載に従い、細胞−マトリックス接着を測定した。ヒドロゲル(マトリゲル、フィブロネクチン、ビトロネクチンおよびラミニン)の密度を変えて、接着特性の異なる基板を用意した。推奨密度のヒドロゲル(例えば、10μg/cm2マトリゲル)で被覆された基板では、2種類の細胞は同様の細胞−マトリックス接着を示したが、DCoG細胞の細胞−マトリックス接着は、密度の低下に伴って、MCoG細胞よりも急速に低下した(図18)。フィブロネクチン、ビトロネクチンおよびラミニンでも、同様の傾向が見られた(図19)。低密度でMG被覆された基板(0.1μg/cm2)上でDCoG細胞を培養すると、ドーム状のコロニーを形成し、KLF4/5およびNANOG発現の上方調節を示した(図20および21)。高密度でMG被覆された基板(1および10μg/cm2)上では、DCoG細胞は単層のコロニーを形成し、MCoG細胞と同様のKLF4/5およびNANOG遺伝子発現を示した(図20および21)。対照的に、MCoG細胞については、MG密度を変えても形態および発現パターンに明白な変化は観察されなかった(図20および21)。このように、低密度のマトリゲルで被覆した基板上では、DCoG細胞は、GNF上で培養した場合と同様に、ドーム状のコロニーを形成することが明らかになった。細胞−マトリックス接着の結果から、他のヒドロゲルを低密度で使用した場合でも、DCoG細胞はドーム状のコロニーを形成することが示唆される。
本願は、成熟度が高い心筋細胞集団の製造に有用である。成熟度が高い心筋細胞集団は、例えば、再生医療、薬剤の効果または毒性の評価への応用、特に、心疾患の処置剤のスクリーニングや医薬候補物質の心毒性評価等に寄与すると期待される。
Claims (11)
- 心筋細胞に分化させるための多能性幹細胞の製造方法であって、
(1)弱い細胞接着性を有する基板上で多能性幹細胞を培養し、ドーム状のコロニーを形成させること、
(2)ドーム状のコロニーから細胞を得ること、
の各段階を含む方法。 - 基板が、ヒドロゲルまたはナノファイバーを含む、請求項1に記載の方法。
- 基板が、マトリゲル、フィブロネクチン、ビトロネクチンおよびラミニンから選択されるヒドロゲルを含む、請求項2に記載の方法。
- 基板が、約0.01〜1.0μg/cm2のマトリゲル、約0.01〜1.0μg/cm2のフィブロネクチン、約0.01〜1.0μg/cm2のビトロネクチンおよび約0.01〜0.1μg/cm2のラミニンから選択されるヒドロゲルを含む、請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- 基板がゼラチンナノファイバーを含む、請求項1または2に記載の方法。
- ゼラチンナノファイバーの密度が約3〜5μg/cm2である、請求項5に記載の方法。
- ドーム状のコロニーが、50μm以上の高さのコロニーである、請求項1〜6のいずれかに記載の方法。
- 段階(1)において、1個の多能性幹細胞に由来するコロニーを形成させる、請求項1〜7のいずれかに記載の方法。
- 請求項1〜8のいずれかに記載の方法により得られる多能性幹細胞を含む、心筋細胞を製造するための組成物。
- 請求項1〜8のいずれかに記載の方法により得られる多能性幹細胞の集団を心筋細胞分化誘導することを含む、心筋細胞集団の製造方法。
- 請求項10に記載の方法により製造される心筋細胞集団。
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