CN113930337B - 用于制备细胞团簇的装置及其构建方法及应用 - Google Patents

用于制备细胞团簇的装置及其构建方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种用于制备细胞团簇的装置及其构建方法及应用。该装置包括细胞培养板和固定于细胞培养板的微孔内且具有阵列排列的微图形空腔的基底。每个微图形空腔形成细胞团簇生长的空间，其形状和体积可调控获得的细胞团簇性质。其制备方法包括：制备尺寸可调的微图形模板，再通过两次翻模得到阵列排列的微图形基底。本发明提供的装置可以便捷、大规模制备细胞团簇，可重复使用；可调节基底的弹性模量，以达到各种细胞、多种细胞共培养的要求。采用本装置制备的细胞团簇活性高、大小均一、形状完整、性能可控、生物学性能良好，可用于细胞治疗、高通量模型构建、多细胞共培养、干细胞分化、类器官构建、药物筛选、组织再生和体外人工系统等方面。

Description

用于制备细胞团簇的装置及其构建方法及应用
技术领域
本发明涉及生物技术和组织工程技术领域，具体地说，涉及一种用于制备细胞团簇的装置及其构建方法及应用。
背景技术
传统的细胞培养方式是平面培养，采用平面培养得到的单层细胞培养与体内细胞的生理结构并不相同，会影响细胞的存活与功能。利用细胞间的自组装形成细胞团簇，可以构建一个准3D环境。与平面培养相比，三维细胞培养可以重建细胞与细胞、细胞与基质之间的相互作用，减少体外培养与天然组织之间的差异。例如，胚胎干细胞、间充质干细胞、多种肿瘤细胞等细胞具有成团的特性。此外，胰岛β细胞需要形成细胞团簇以维持其功能，构建细胞团簇有利于细胞的培养和分化。同时，有关类器官的研究近来也快速增加，而类器官往往需要多种细胞成团共培养，以保证其结构发育成形和功能表达。细胞团簇的下游应用有药物检测、体内移植等，这些下游应用一般都需要108～109个细胞才能得到可靠的结果，因此前期制备大量的细胞团簇。鉴于细胞团簇的广泛应用，大规模制备细胞团簇是非常有必要的。
构建细胞团簇的一个重要因素是团簇尺寸，过小不利于细胞成团，过大不利于细胞团内部的营养供给，进而造成细胞团簇内部的异质性，因此制备尺寸可控的细胞团簇至关重要。另一个重要因素是基底的刚度，不同细胞种类对于材料刚度的要求不同，因此在制备细胞团簇时需要有一个合适的培养基底。
目前有关细胞团簇的研究，一般是在常规多孔培养皿中铺上基底，种植一定数量的细胞后依靠细胞自组装形成团簇；也有部分的商业化产品，多孔培养皿底部具备微孔阵列，可以制备大量的细胞团簇。但目前这些方法仍然存在不足。通过在常规多孔培养皿上构造基底的方法，可以提供有利于细胞成团和培养的软底，但数量、尺寸受限，难以获得大量、均一的细胞团簇；商业化微孔产品可以满足数量和均一尺寸的要求，但一般产品仍是塑料基底，刚度太大，且微孔尺寸和形状不能满足自定义的要求，且无法重复使用，成本和费用过高。
综上，大规模制备细胞团簇仍然存在着挑战，开发同时满足自定义微图形(形状、尺寸)、适合刚度的基底、可产生大规模活性高的细胞团簇三个要求的培养装置和技术成为当务之急。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于制备细胞团簇的装置及其构建方法及应用。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种用于制备细胞团簇的装置，所述装置包括细胞培养板以及固定于细胞培养板的微孔内且具有阵列排列的微图形空腔的基底。
每个微图形空腔构成细胞团簇生长的空间(大致决定细胞团簇生长的尺寸和空间)；空腔的形状可选自圆形、正方形、长方形、三角形、菱形、倒锥形、倒金字塔形等任意规则或不规则形状；空腔的上表面面积为0.04～1mm2，空腔深度为100～500μm，基底上排列的微图形空腔的数量为1000～5000个左右(视微图形尺寸与模板整体尺寸而定)，阵列图案和尺寸可相同，也可不同，排列可整齐均一，也可自定义排列，同一基底阵列可包含不同形状、尺寸和排列方式的微图形。
本发明提供的装置示意图见图1。微图形空腔示意图见图2。
用于制作基底的材料可选自聚丙烯、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚乳酸、聚羟基酸、聚乳酸醇酸共聚物、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚酸酐、聚酸酯、聚酰胺、聚氨基酸、聚缩醛、聚氰基丙烯酸酯、聚氨基甲酸酯、聚吡咯、聚酯、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯、聚碳酸酯、聚氧化乙烯、丝素蛋白、丝素蛋白衍生物、壳聚糖、明胶、明胶衍生物、藻酸盐、琼脂、基质胶、胶原、胶原衍生物、透明质酸、透明质酸衍生物、纤维素、纤维素衍生材料、蛋白多糖、蛋白多糖衍生物、糖蛋白、糖蛋白衍生材料、层连接蛋白、纤连接蛋白和纤维蛋白等中的至少一种，优选聚二甲基硅氧烷和丝素蛋白的混合物。更优选地，聚二甲基硅氧烷和丝素蛋白的质量比为10:1～1:10。
所述细胞培养板为商用多孔培养板，优选6孔板、12孔板或24孔板。
优选地，所述基底的弹性模量为0.1KPa-10MPa，可根据微图形基底材料的成分、浓度和固化特性调节弹性模量。
优选地，所述基底的pH值为3～12。
优选地，所述基底的厚度为100μm～2cm。
进一步地，为保证细胞团簇的稳定粘附，可根据需要添加有利于细胞团簇粘附和生长的细胞外基质成分，如胶原、基质胶、蛋白多糖、糖蛋白、透明质酸、层连接蛋白或纤维连接蛋白等。
优选地，所述细胞外基质材料的质量百分比浓度为0.1％～80％，优选1％～25％。
本装置可重复使用，一次使用、收集细胞团簇后可进行清洗、灭菌并再次使用，且能保持微图形精度和无菌程度。
第二方面，本发明提供一种用于制备细胞团簇的装置的构建方法，包括：先制备尺寸可调的微图形模板，再通过两次翻模得到阵列排列的微图形基底。具体如下：
1)采用蚀刻或光刻工艺制作具有阵列排列的微图形空腔的模板；
2)利用模具成型法，将液态或半固态的翻模材料注入模板内，固化成型后从模板上剥离，得到翻模印章；
3)将基底材料与交联剂混合(要求进行抽真空操作去除气泡)，将翻模印章置于上述混合物中，固化成型；
4)将翻模印章从上述成型材料中剥离下来，或者通过化学或物理方法从上述成型材料中去除翻模印章，得到具有阵列排列的微图形空腔的基底；
5)将基底固定于细胞培养板的微孔内，灭菌处理(高温灭菌或紫外灭菌)。
步骤3)中所述的基底材料可选自聚丙烯、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚乳酸、聚羟基酸、聚乳酸醇酸共聚物、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚酸酐、聚酸酯、聚酰胺、聚氨基酸、聚缩醛、聚氰基丙烯酸酯、聚氨基甲酸酯、聚吡咯、聚酯、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯、聚碳酸酯、聚氧化乙烯、丝素蛋白、丝素蛋白衍生物、壳聚糖、明胶、明胶衍生物、藻酸盐、琼脂、基质胶、胶原、胶原衍生物、透明质酸、透明质酸衍生物、纤维素、纤维素衍生材料、蛋白多糖、蛋白多糖衍生物、糖蛋白、糖蛋白衍生材料、层连接蛋白、纤连接蛋白和纤维蛋白等中的至少一种，优选聚二甲基硅氧烷和丝素蛋白的混合物。更优选地，聚二甲基硅氧烷和丝素蛋白的质量比为10:1～1:10。
步骤1)中所述模板上的空腔的形状可选自圆形、正方形、长方形、三角形、菱形、倒锥形、倒金字塔形等任意规则或不规则形状；空腔的上表面面积为0.04～1mm2，空腔深度为100～500μm，模板上排列的微图形空腔的数量为1000～5000个。
步骤1)中用于制作模板的材料可选自硅、铝、铁、锡、玻璃、聚甲基丙烯酸甲酯、聚二甲基硅氧烷、聚己内酯、聚三亚甲基碳酸酯、聚四氟乙烯、聚氧化乙烯、聚乙烯醋酸乙烯酯、聚对二氧环己酮、聚醚醚酮等中的至少一种。
步骤2)中所述的翻模材料为可降解材料或不可降解材料，所述可降解材料可选自明胶、明胶衍生物、琼脂、琼脂糖、
Figure BDA0002560728330000031
F-127、聚乙烯醇、聚乙二醇等中的至少一种，所述不可降解材料可选自环氧树脂、酚醛树脂、聚氯乙烯树脂、不饱和聚酯树脂、石膏、硅胶(硅胶基质)等中的至少一种。
优选地，步骤2)中所述翻模材料的质量百分比浓度为0.1％～80％，优选1％～25％。
优选地，步骤3)中所述交联剂的浓度为0.1mM～10M，优选1mM～100mM。
所述交联剂可选自含氢硅油、硅烷偶联剂、二价阳离子、京尼平、戊二醛、已二酸二酰肼、环氧氯丙烷、碳化二亚胺、凝血酶及其衍生物等中的至少一种，优选含氢硅油。
优选地，步骤3)中所述基底材料与交联剂按1000:1～1:1000的体积比混合，优选10:1～1:10。
优选地，步骤3)中固化的条件为：温度10～100℃和/或光照强度0.5～1000lx。
在本发明的一个具体实施方式中，用于制备细胞团簇的装置的构建方法包括：
A1、采用光刻工艺制作具有阵列排列的微图形空腔的聚甲基丙烯酸甲酯模板；
A2、利用模具成型法，将高温液态琼脂注入模板内，冷却凝固成型后从模板上剥离，得到可降解翻模印章；
A3、将PDMS和丝素蛋白与交联剂混合，经消泡处理后(抽真空去除气泡)，将翻模印章置于上述混合物中，室温过夜，固化成型，得到PDMS和丝素蛋白混合基底；
A4、将翻模印章通过加热融化，从PDMS和丝素蛋白混合基底上去除，得到具有阵列排列的微图形空腔的基底；
A5、外力挤压，将基底固定于12孔细胞培养板的孔内，灭菌处理。
步骤A3中，PDMS、丝素蛋白和交联剂的质量比为5～10：0.6～60：1，所述交联剂为含氢硅油。
在本发明的另一个具体实施方式中，用于制备细胞团簇的装置的构建方法包括：
B1、采用刻蚀工艺制作具有阵列排列的微图形空腔的聚甲基丙烯酸甲酯模板；
B2、利用模具成型法，将硅胶基质(主要成分为乙烯基硅油、二氧化硅)与交联剂混合后倒入模板，压制并保证材料完全覆盖微图形模板，待材料完全固化成型后从模板上剥离，得到不可降解翻模印章；
B3、将PDMS和丝素蛋白与交联剂混合，经消泡处理后，将翻模印章置于上述混合物中，室温过夜，固化成型；
B4、将翻模印章通过机械力直接剥除，得到具有阵列排列的微图形空腔的基底；
B5、外力挤压，将基底固定于12孔细胞培养板的孔内，灭菌处理。
步骤B2中，硅胶基质和交联剂的质量比为10：1～1:10，所述交联剂为含氢硅油。
步骤B3中，PDMS、丝素蛋白和交联剂的质量比为5～10：0.6～60：1，所述交联剂为含氢硅油。
第三方面，本发明提供上述装置，或按照上述方法制备的装置在细胞团簇培养中的应用。
本装置适合于：
1)培养单细胞团簇，如胰岛细胞、肝细胞培养成团簇；
2)干细胞培养和诱导分化，如胚胎干细胞、间充质干细胞成团簇培养并进一步诱导分化等；
3)多细胞共培养，如内皮细胞、成纤维细胞和肝实质细胞、胰岛细胞共培养，组织碎片与间充质干细胞成团共培养等。
本装置适合培养的细胞可选自以下一种或多种细胞：各种来源的胚胎干细胞、多能干细胞、诱导性多能干细胞、各种器官来源的干细胞、各种器官来源的祖细胞、间充质干细胞、各种干细胞诱导分化得到的细胞、各种器官来源的成纤维细胞、各种器官来源的上皮细胞、各种器官来源的表皮细胞、各种器官来源的内皮细胞、各种器官来源的肌细胞、羊膜细胞、视锥细胞、神经细胞、血细胞、红细胞、白细胞、血小板、血管细胞、吞噬细胞、免疫细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、浆细胞、肥大细胞、抗原呈递细胞、单核吞噬细胞系统的细胞、黑色素细胞、软骨细胞、骨来源细胞、平滑肌细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、分泌细胞、脂肪细胞、纤毛细胞、胰腺细胞、肾细胞、肠粘膜细胞、肝细胞、肝来源的干细胞或祖细胞、肝巨噬细胞、枯否细胞、星状细胞、胆管上皮细胞、肝窦内皮细胞和其他各种组织和器官来源细胞，以及各种肿瘤细胞、各种用于免疫治疗的细胞、各种经过基因编辑、病毒包装或改造的细胞与细胞系。
所述细胞特别优选为干细胞，更优选为胚胎干细胞或间充质干细胞。
本装置可通过简单操作收集团簇。例如可选择疏水性材料制备微图形基底，细胞团簇对其粘附性不高，通过吹打的方式即可完成细胞团簇的脱离和收集，便于进行后续操作。
本装置可通过合适的基底保证细胞团簇的稳定粘附，进行细胞团簇的长期培养和下游分化研究，并进一步应用于细胞治疗、高通量模型构建、类器官构建、药物筛选、组织再生和体外人工系统等方面。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
本发明提供的装置包括具有阵列排列的微图形空腔的基底和商用多孔培养板；每个微图形空腔形成细胞团簇生长的空间，其形状和体积可调控获得的细胞团簇性质。本发明提供的装置可以便捷、大规模制备细胞团簇，可重复使用；可调节基底的弹性模量，以适应各种细胞、多种细胞共培养所要求的条件。采用本装置制备的细胞团簇活性高、大小均一、形状完整、性能可控、生物学性能良好，可用于细胞治疗、高通量模型构建、多细胞共培养、干细胞分化、类器官构建、药物筛选、组织再生和体外人工系统等方面。
具体地，本发明提供的大规模细胞团簇制备装置具有可重复使用、个性化定制、快速大规模制备、物化性能可调控和满足高通量培养的特点。
(一)本发明中的大规模细胞团簇制备装置可重复使用。本发明中的大规模细胞团簇制备装置经过清洗灭菌后重复使用，且能保持微图形精度和培养所需无菌环境。
(二)本装置可通过快速、可控、大规模的制备方法获得。本装置通过两步翻模的方式制备得到微图形基底，避免了微图形模板的阴阳模反转，可应用于复杂模具，也可以大规模制备获取。
(三)本装置可根据需要调控其物化性能。可通过对细胞团簇尺寸、基底材料性能、机械强度等物化因素进行调控，从而实现细胞团簇的均质性生长、长期培养和下游研究，可用于不同细胞种类、不同细胞尺寸的培养、分化和功能维持，也可以完成细胞团簇的脱离和收集。
(四)本装置可实现细胞团簇的高通量制备。本发明中的大规模细胞团簇制备装置借助计算机辅助设计和微图形化技术，可在同一模板、同一基底上实现各种微图形空腔的形状和尺寸，从而实现同一培养条件下不同细胞团簇尺寸和分布的比较，对于通量研究和筛选具有重要意义。
附图说明
图1为本发明用于制备细胞团簇的装置及细胞团簇培养的示意图。
图2为本发明用于制备细胞团簇的装置的不同空腔形状的示意图。其中，1)～4)为不同空腔形状。
图3为本发明装置制备时翻模过程的示意图。
图4为本发明较佳实施例中脂肪干细胞在细胞团簇制备装置中的分化情况。其中，A是脂肪干细胞光镜图，B是分化后类胰岛细胞的光镜图，C是类胰岛细胞的免疫荧光染色图(scale bar＝200μm)。
图5为本发明较佳实施例中类胰岛细胞和内皮细胞在细胞团簇制备装置中的共培养情况。其中，A是类胰岛细胞和内皮细胞共培养的光镜图(scale bar＝500μm)，B是共培养细胞的免疫荧光染色图(scale bar＝200μm)。
图6为本发明对比例中PDMS与丝素蛋白混合基底与纯PDMS基底在培养细胞方面的差异。
具体实施方式
本发明提供一种大规模制备细胞团簇的装置和方法，通过该装置和方法，可以获得微米级别的细胞/共培养细胞团簇，所制备的细胞/共培养细胞团簇具有活性高、大小均一、形状完整、性能可控、生物学性能良好的特点。本装置可重复使用，并可以采用合适的基底保证细胞团簇的稳定粘附，从而进行长期培养和下游分化研究，此外，也可以根据需要完成细胞团簇的脱离和收集，以便后续工作。
本发明通过尺寸可调的微图形、刚度合适的基底一次性得到数以万计的活性高、大小均一、形状完整、性能可控、生物学性能良好的细胞/共培养细胞团簇，可满足细胞治疗、高通量模型构建、多细胞共培养、干细胞分化、类器官构建、药物筛选、组织再生和体外人工系统等下游应用的多种要求。本发明提供的装置示意图见图1。
本发明提供的细胞团簇制备装置，主要组成部分为阵列排列的具有微图形空腔的微图形基底。
本发明提供的微图形基底的每个微图形空腔是细胞生长的空间，其形状和体积影响细胞团簇的特性和生理功能。形状可为圆形、正方形、长方形、三角形、菱形、倒锥形、倒金字塔形和不规则形状等，多为空腔结构，空腔的上表面面积为0.04～1mm2，空腔深度为100～500μm，从而大致决定细胞团簇生长的尺寸和空间。微图形空腔示意图可见图2。
本发明提供的微图形阵列含有微图形数量1000～5000左右，视微图形尺寸与模板整体尺寸而定，阵列图案和尺寸可相同，也可不同，排列可整齐均一，也可自定义排列，同一基底阵列可包含不同形状、尺寸和排列方式的微图形。
本发明提供的细胞团簇制备装置可配合商业常规多孔培养板(如6孔板、12孔板、24孔板等)使用。
本装置的微图形基底的弹性模量为0.1KPa-10MPa，可通过微图形基底材料的成分、浓度和固化特性调节弹性模量。
本装置可重复使用，一次使用、收集细胞团簇后可进行清洗、灭菌并再次使用，且能保持微图形精度和无菌程度。
本发明提供上述细胞团簇制备装置的制备方式。装置制备方法包括以下步骤：
1)采用蚀刻或光刻工艺制作具有阵列排列的微图形空腔的模板；
2)利用模具成型法，将液态或半固态翻模材料注入模板内，固化成型后从模板上剥离，得到翻模印章；
3)将基底材料与交联剂混合(进行抽真空操作去除气泡)，将翻模印章置于上述混合物中，固化成型；
4)将翻模印章从上述成型材料中剥离下来，或者通过化学或物理方法从上述成型材料中去除翻模印章，得到具有阵列排列的微图形空腔的基底；
5)将基底固定于细胞培养板的微孔内，高温灭菌或紫外灭菌处理；6)可将多种细胞先后种植于微图形基底上，实现尺寸和生物性能可控的多细胞共培养细胞团簇的培养。
装置制备过程示意图见图3。
所述微图形模板为自定义、具有微图形阵列、可重复使用的模板。本发明实施例中，所述微图形模板可选择已经商业化的产品，如底部具有400μm微孔阵列的多孔培养板AgreewellTM400(Stemcell)，也可以选择自定义模板，采用本领域公知的微图形化方法如激光切割雕刻、微图形模具成型等结合计算机辅助设计自定义制备。
微图形模板的材料可为硅、铝、铁、锡、玻璃、聚甲基丙烯酸甲酯、聚二甲基硅氧烷、聚己内酯、聚三亚甲基碳酸酯、聚四氟乙烯、聚氧化乙烯、聚乙烯醋酸乙烯酯、聚对二氧环己酮、聚醚醚酮等。
微图形模板可控调节微图形模板上微图形的形状、尺寸和数量，形状可为圆形、正方形、长方形、三角形、菱形、倒锥形、倒金字塔形和不规则形状等，多为空腔结构，空腔的上表面面积为0.04～1mm2，空腔深度为100～500μm，数量1000～5000左右，视微图形尺寸与模板整体尺寸决定。微图形模板的形状和尺寸不必均一。
微图形模板的整体尺寸和形状一般取决于配套使用的商业常规多孔培养板，一般为圆形，直径等于或略小于多孔培养板的孔径，厚度不决定最终基底厚度，以省材为主，一般为100μm～2cm不等。
所述翻模印章为用于进行中间翻模的可降解材料或不可降解材料，通过模具成型法制得，其图案为模板微孔(阴模)的阳模，用于两次翻模、拓印到基底上制备微图形基底。
翻模印章的形状可为圆形、正方形、长方形、三角形、菱形、倒锥形、倒金字塔形和不规则形状等，多为凸出结构，结构上表面面积为0.04～1mm2，高度为100～500μm，数量1000～5000左右，形状和尺寸不必均一。
用于翻模印章的可降解材料可为明胶、明胶衍生物、琼脂、琼脂糖、
Figure BDA0002560728330000081
F-127、聚乙烯醇、聚乙二醇等牺牲材料，便于后续制得基底后通过加热、水溶等牺牲方式去除模板。用于翻模印章的不可降解材料可为环氧树脂、酚醛树脂、聚氯乙烯树脂、不饱和聚酯树脂、石膏、硅胶等中的至少一种。
所述翻模印章材料的质量百分比浓度为0.1％～80％，优选为1％～25％。
所述微图形基底为培养细胞团簇的基底。微图形基底可用的材料为聚丙烯、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚乳酸、聚羟基酸、聚乳酸醇酸共聚物、聚二甲基硅氧烷、聚酸酐、聚酸酯、聚酰胺、聚氨基酸、聚缩醛、聚氰基丙烯酸酯、聚氨基甲酸酯、聚吡咯、聚酯、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯、聚碳酸酯、聚氧化乙烯、丝素蛋白、丝素蛋白衍生物、壳聚糖、明胶、明胶衍生物、藻酸盐、琼脂、基质胶、胶原、胶原衍生物、透明质酸、透明质酸衍生物、纤维素、纤维素衍生材料、蛋白多糖、蛋白多糖衍生物、糖蛋白、糖蛋白衍生材料、层连接蛋白、纤连接蛋白和纤维蛋白等中的至少一种，优选聚二甲基硅氧烷和丝素蛋白的混合物，其中聚二甲基硅氧烷和丝素蛋白的质量比为10:1～1:10。
所述基底材料的质量百分比浓度可以是0.1％～80％，优选1％～25％。
微图形基底的成型固定是利用翻模印章两次翻模。将翻模印章置于未成型固定的基底材料上，通过抽取真空、静置等方式保证基底材料与翻模印章紧密贴合，然后根据基底材料和翻模印章材料的特性采取交联剂固化、热固化、光固化、紫外固化、pH调节固化等方式完成基底材料的成型固定，得到具有等同于微图形模板的微图形基底。
微图形基底为保证细胞团簇的稳定粘附，可以根据需要添加有利于细胞团簇粘附和生长的细胞外基质成分，如胶原、基质胶、蛋白多糖、糖蛋白、透明质酸、层连接蛋白或纤维连接蛋白。
所述细胞外基质材料的质量百分比浓度为0.1％～80％，优选为1％～25％。
微图形基底的弹性模量为0.1KPa-100MPa，通过基底材料的成分、浓度和固化特性调节。基底材料的成分和浓度可根据培养细胞团簇的特性进行选择，交联剂固化的材料可调节固化剂比例，热固化的材料可调节固化时间和固化温度，光固化或紫外固化的材料可调节光照强度和光照时间，从而调节弹性模量，一般而言，固化剂比例越大、固化温度越高、固化时间越长、光照强度越大，得到的基底弹性模量越大。
所用交联剂可为含氢硅油、硅烷偶联剂、二价阳离子、京尼平、戊二醛、已二酸二酰肼、环氧氯丙烷、碳化二亚胺、凝血酶及其衍生物等中的至少一种，优选含氢硅油。
所用交联剂的浓度为0.1mM～10M，优选1mM～100mM。
所述基底材料与交联剂溶液按1000:1～1:1000的体积比混合，优选10:1～1:10。
所述基底材料的热固化温度为10～100℃。
所述基底材料的光照强度为0.5～1000lx。
所述基底材料的pH值为3～12。
可降解翻模印章在微图形基底成型固定后需要根据其材料特性选择牺牲去除。翻模印章材料为温敏材料，如明胶、明胶衍生物、琼脂、琼脂糖等高温溶解材料则可通过加热去除，如
Figure BDA0002560728330000091
F-127等低温溶解材料可采用冷冻去除，材料为聚乙烯醇、聚乙二醇等水溶性材料可通过水溶方式去除。
不可降解翻模印章在微图形基底成型固定后机械剥离即可。
所述具有微图形空腔的微图形基底通过两次翻模制得，具备与上述微图形模板相同的微图形阵列，形状可为圆形、正方形、长方形、三角形、菱形、倒锥形、倒金字塔形和不规则形状等，多为空腔结构，空腔的上表面面积为0.04～1mm2，空腔深度为100～500μm，数量1000～5000左右，形状和尺寸不必均一。
具有微图形空腔的微图形基底具有一定阵列的微图形空腔，每个微图形空腔的形状和体积构成细胞团簇生长的物理空间，与种植的细胞数量共同决定细胞团簇的尺寸，进而影响细胞团簇的功能表达。
所述具有微图形空腔的微图形基底与常规细胞培养板粘着构成整体，构建方法包括但不局限于以下两种：
1、设计和制备出需要尺寸和形状的微图形基底后，裁剪为合适形状，并嵌入商业常规多孔培养板中，利用压力和微图形基底材料的粘附性，将微图形基底与多孔培养皿表面连接形成整体，待灭菌处理后可即时使用或保存待用。
2、将微图形基底材料和翻模印章同时置于商业常规多孔培养板，待微图形基底材料成型后去除翻模印章，即得到成为整体的微图形基底-多用培养板，待灭菌处理后可即时使用或保存待用。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
聚甲基丙烯酸甲酯购自淘宝电商百邦亚克力加工店，平均分子量约200万道尔顿。
聚二甲基硅氧烷(PDMS)购自Dow Corning公司，货号7450507，为双组份硅橡胶，混合前黏度5500cps(25℃)，混合后黏度3900cps(25℃)。
基本组分主要为二甲基硅油和铂系催化剂。
固化剂主要为含氢硅油。
硅胶材料为菲丽克加成型硅橡胶印模材料，购自上海贝珍生物科技有限公司，为双组份硅橡胶。
硅胶基质主要为乙烯基硅油和二氧化硅。
交联剂主要为含氢硅油。
丝素蛋白购自Sigma-Aldrich公司，货号5154，平均分子量为100KDa。
实施例1用可降解翻模印章制作细胞团簇制备装置的方法
1、制备微图形模板
微图形模板采用光刻聚甲基丙烯酸甲酯，制备整体直径为3cm的圆形模板，模板上为含1500个微空腔的倒锥形阵列，相邻空腔之间的距离为200μm，微图形为上表面为正方形的倒锥形，上表面面积为0.25mm2，深度为500μm。
2、制备可降解翻模印章
翻模印章采用琼脂材料。采用浓度为5％的琼脂溶液，高温高压溶解，趁热灌注于微图形模板中，每次灌注2ml琼脂即可，并在琼脂溶液凝固前用真空去除气泡。待琼脂冷却凝固后小心取出琼脂印章。此处完成12个印章的制备。
3、制备微图形基底
按质量比5：1将Sylgard 184silicone elastomer kit(Dow Corning公司，货号7450507)中的PDMS基本组分(主要成分为二甲基硅油和铂系催化剂)与固化剂(主要成分为含氢硅油)充分混合，置于60mm直径培养皿中，每克PDMS再加入100mg丝素蛋白，充分搅拌均匀，并用真空抽气去除气泡。将制备的12个琼脂印章轻置于PDMS-丝素蛋白混合物上。室温过夜。
待PDMS和丝素蛋白混合物完全固化后，加热牺牲琼脂，得到含有12个具有阵列排列的微图形基底。利用打孔器，按照常规12孔培养皿的孔径大小取出PDMS和丝素蛋白混合物中含微孔阵列的部分，并根据需要裁减为合适厚度。得到的微图形基底大小均一，含有相同的微孔阵列。将微图形基底嵌入12孔培养皿中，利用压力和PDMS本身的粘附性，将微图形基底与12孔培养皿表面连接在一起。
最后对PDMS进行高温高压灭菌处理，处理后保持疏水状态。高压灭菌的条件为：105℃，0.15MPa灭菌30min。
所制备装置的形态、结构及性质如下：
常规12孔培养皿底部为PDMS和丝素蛋白组成的微图形基底，基底整体为直径3cm的圆形，基底表面为微孔阵列，空腔形状为倒四方锥，上表面面积为0.25mm2，深度为500μm，阵列排布密度为214个微孔/cm2，相邻空腔之间的距离为200μm，基底弹性模量为5MPa，pH值为7.4。
实施例2用不可降解翻模印章制作细胞团簇制备装置的方法
1、制备微图形模板
微图形模板采用刻蚀聚甲基丙烯酸甲酯，制备整体直径为3cm的圆形模板，模板上为含1500个微空腔的倒锥形阵列，相邻空腔之间的距离为200μm，微图形为上表面为正方形的倒锥形，上表面面积为0.25mm2，深度为500μm。
2、制备不可降解翻模印章
不可降解翻模印章采用硅胶材料。将硅胶基质(主要成分为乙烯基硅油、二氧化硅)与交联剂(主要成分为含氢硅油)按体积比1：1混合，并迅速倒入模板上，用力压制，保证材料完全覆盖微图形模板，待材料完全凝固成型后取出。此处完成12个印章的制备，此印章可重复使用。
3、制备PDMS的微图形基底
按质量比5：1将Sylgard 184silicone elastomer kit中的PDMS基本组分(主要成分为二甲基硅油和铂系催化剂)与固化剂(主要成分为含氢硅油)充分混合，置于60mm直径培养皿中，每克PDMS再加入100mg丝素蛋白，充分搅拌均匀，并用真空抽气去除气泡。将制备的12个硅胶印章轻置于PDMS上。室温过夜。
待PDMS和丝素蛋白混合物完全固化后，用力将硅胶印章垂直拔出，得到含有12个具有阵列排列的微图形基底。利用打孔器，按照常规12孔培养皿的孔径大小取出PDMS和丝素蛋白混合物中含微孔阵列的部分，并根据需要裁减为合适厚度。得到的微图形基底大小均一，含有相同的微孔阵列。将微图形基底嵌入12孔培养皿中，利用压力和PDMS本身的粘附性，将微图形基底与12孔培养皿表面连接在一起。
最后对装置进行高温高压灭菌处理，处理后保持疏水状态。高压灭菌的条件为：105℃，0.15MPa灭菌30min。高温高压灭菌不会破坏基底的空间结构。印章用酒精清洗后晾干，以便之后使用。
所制备装置的形态、结构及性质如下：
常规12孔培养皿底部为PDMS和丝素蛋白组成的微图形基底，基底整体为直径3cm的圆形，基底表面为微孔阵列，空腔形状为倒四方锥，上表面面积为0.25mm2，深度为500μm，阵列排布密度为214个微孔/cm2，相邻空腔之间的距离为200μm，基底弹性模量为5MPa，pH值为7.4。
实施例3利用细胞团簇制备装置诱导脂肪干细胞分化为胰岛细胞团
脂肪干细胞-类胰岛细胞分化液的配制：DMEM培养基和DMEM/F-12培养基按2:1体积比混合，加入Nicotinamide(5mM)，Activin A(4nM)，Exendin-4(20nM)，Pentagastrin(20nM)，hepatocyte growth factor(200pM)，B-27supplement(1％)，N-2supplement(1％)，双抗(1％)。
本发明在现有脂肪干细胞-类胰岛细胞分化液的基础上进行了改良，增加了Activin A、Exendin-4、Pentagastrin、hepatocyte growth factor这四类促进胰腺分化的生长因子的浓度，并且降低了B-27supplement、N-2supplement这两类维持干细胞干性的培养基成分，提升了脂肪干细胞向胰腺细胞分化的效率。
1、准备台盼蓝染色液：将160μl分化液和20μl台盼蓝溶液混合备用。
2、取2瓶T75的脂肪干细胞(ATCC)，对于每瓶细胞，消化细胞；终止消化，离心。
3、2支离心管吸走上清，分别加入1ml分化液吹打重悬；将所有细胞悬液汇聚到一支离心管中。
4、吹打使细胞尽可能分散，取20μl细胞悬液至台盼蓝染液中，室温染色2min。
5、对这200μl细胞悬液，吹打使细胞尽可能分散；取20μl加入细胞计数板，进行细胞计数。根据计数结果，将2ml细胞悬液调节至活细胞浓度为9×105个/ml。
6、向实施例1制备的12孔细胞团簇制备装置中每孔加入2ml已调节密度的细胞悬液，最终得到细胞密度为1.8×106个/孔，每个微孔约含有1200个细胞；吹打分散细胞，注意避免产生气泡。
7、用配平板进行离心操作，200g离心3min；显微镜下观察，确保每个微孔有细胞。
8、将细胞团簇制备装置放入培养箱，共分化6天左右，每3天进行半换液。
9、观察脂肪干细胞分化。光学显微镜下观察脂肪干细胞向类胰岛细胞的分化情况。吹打收集细胞，可获得大量细胞团簇，不易分散，边缘清晰。
脂肪干细胞在实施例1的细胞团簇制备装置中的分化情况见图4。其中，A是脂肪干细胞的形貌光镜图；B是脂肪干细胞在细胞团簇制备装置中分化6天后的形貌光镜图，光镜下可以观察到细胞从松散分布到紧密堆积，形成细胞团簇，边缘清晰、尺寸均一、形状完整；
10、检测脂肪干细胞分化情况。为了检测装置中脂肪干细胞向类胰岛细胞的分化情况，采用免疫荧光染色检测胰岛β细胞的特异性标记蛋白的表达(如Pdx1)。
收集细胞：收集装置中每个孔的上清液；每个孔加入1ml PBS吹打一次，收集液体，并再重复该过程1次。转移至50ml离心管，1000rpm 3min离心，弃上清，除去大部分单细胞，并置于培养皿中。
免疫荧光染色：用磷酸缓冲液(PBS)洗涤细胞团簇；4％多聚甲醛在室温下固定30分钟，后用PBS洗涤1次，5分钟；含0.3％Triton-X(Sigma，X100)冰上透化20分钟，后用PBS洗涤1次，5分钟；5％牛血清白蛋白(Multicell，800-096-EG)封闭1小时，后用PBS洗涤1次，5分钟；加入按说明书稀释的一抗，Pdx1(Abcam，ab47383)，4℃过夜孵育。用PBS洗涤3次，每次5分钟；加入对应二抗Alexa
Figure BDA0002560728330000131
(abcam，ab150080)，室温避光孵育2小时，后用PBS洗涤3次，每次5分钟；加入DAPI染细胞核，室温避光孵育10分钟。用激光共聚焦显微镜(LSCM,Nikon，Z2)观察记录。
实验结果见图4，其中C是类胰岛细胞的免疫荧光染色图，分化后的细胞团是Pdx1阳性表达，证明脂肪干细胞分化成功，得到的类胰岛细胞团表达胰岛β细胞的一定功能。
本实施例中采用微孔阵列进行细胞培养，为准3D环境，与平面培养相比，具有如下技术优势：培养周期更短，可在2天后即形成细胞团簇；成团效率更高，接近100％，几乎不产生单细胞；分化效率更高，近80％细胞表达胰岛相关蛋白；细胞团簇获取高效便捷，避免消化等操作，减少细胞团簇的松散和凋亡；细胞团簇尺寸一致性良好，且能够保证细胞团簇的生物性能。
与悬浮培养相比，技术优势主要在于：脂肪干细胞贴壁能力强，难以悬浮培养，可用本发明装置构建准3D环境；成团效率更高，几乎不产生单细胞；分化效率更高；细胞团簇更紧密，细胞间接触更充分；细胞团簇尺寸一致性良好，保证细胞团簇的生物性能。
实施例4利用细胞团簇制备装置共培养类胰岛细胞与内皮细胞
1、类胰岛细胞的准备
由脂肪干细胞分化得到，分化方法类似于实施例3。脂肪干细胞在补充有10％FBS、1％双抗的DMEM培养液中培养，并由脂肪干细胞-类胰岛细胞分化液分化为类胰岛细胞。
脂肪干细胞-类胰岛细胞分化液的配制：DMEM培养基和DMEM/F-12培养基按2:1混合，加入Nicotinamide(5mM)，Activin A(4nM)，Exendin-4(20nM)，Pentagastrin(20nM)，hepatocyte growth factor(200pM)，B-27supplement(1％)，N-2supplement(1％)，双抗(1％)。
2、内皮细胞的准备
内皮细胞(PUMC-HUVEC-T1，北京协和细胞资源中心)在添加有10％FBS、1％双抗(青霉素-链霉素)的DMEM培养液中培养。
3、细胞团簇共培养
共培养液：胰岛细胞分化液和内皮细胞液按1：1体积比混合。
1)准备台盼蓝染色液：配制160μl培养液+20μl台盼蓝溶液混合备用。
2)取1瓶T75的内皮细胞和1瓶T75的脂肪干细胞，消化细胞；终止消化，离心。
3)2支离心管吸走上清，各加入1ml共培养液吹打重悬、汇总，使细胞尽可能分散，内皮细胞和脂肪干细胞各取20μl细胞悬液至台盼蓝染液中，室温染色2min。取20μl加入细胞计数板，进行细胞计数。根据计数结果，用共培养液将两种细胞的细胞悬液调节至活细胞浓度为9×105个/ml，然后1：1混合，得到细胞悬液中含内皮细胞和脂肪干细胞各4.5×105个/ml。
4)向实施例2制备的12孔细胞团簇培养装置中加入2ml细胞悬液，每个孔最终有细胞1.8×106个/孔，每个微孔约含有1200个细胞；吹打分散细胞，注意避免产生气泡。
5)用配平板进行离心操作，200g离心3min；显微镜下观察，确保每个微孔有细胞。
6)将细胞团簇制备装置放入培养箱，共分化6天左右，每3天进行半换液。
4、细胞团簇检测
1)观察细胞团簇共培养情况。
光学显微镜下观察类胰岛细胞和内皮细胞的共培养情况。吹打收集细胞，可获得大量细胞团簇，不易分散，边缘清晰。
类胰岛细胞和内皮细胞在实施例2的细胞团簇制备装置中的共培养情况见图5。其中，A是类胰岛细胞和内皮细胞共培养的形貌光镜图，可看到松散细胞逐渐聚集，形成紧密团簇形态，边缘清晰，细胞团簇大小均一。
2)检测共培养情况下类胰岛细胞和内皮细胞功能。
为了检测共培养情况下类胰岛细胞和内皮细胞的功能表达，采用免疫荧光染色检测胰岛β细胞的特异性标记蛋白的表达(如Pdx1)和内皮细胞的特异性标记蛋白的表达(如CD31)。
收集细胞：收集装置中每个孔的上清液；每个孔加入1ml PBS吹打一次，收集液体，并再重复该过程1次。转移至50ml离心管，1000rpm离心3min，弃上清，除去大部分单细胞，并置于培养皿中。
免疫荧光染色：用磷酸缓冲液(PBS)洗涤细胞团簇；4％多聚甲醛在室温下固定30分钟，后用PBS洗涤1次，5分钟；含0.3％Triton-X(Sigma，X100)冰上透化20分钟，后用PBS洗涤1次，5分钟；5％牛血清白蛋白(Multicell，800-096-EG)封闭1小时，后用PBS洗涤1次，5分钟；加入按说明书稀释的一抗，Pdx1(Abcam，ab47383)和CD31(Abcam，ab24590)，4℃过夜孵育。用PBS洗涤3次，每次5分钟；加入对应二抗Alexa
Figure BDA0002560728330000151
(abcam，ab150080)和Alexa
Figure BDA0002560728330000152
(abcam，ab150113)，室温避光孵育2小时，后用PBS洗涤3次，每次5分钟；加入DAPI染细胞核，室温避光孵育10分钟。用激光共聚焦显微镜(LSCM,Nikon，Z2)观察记录。
类胰岛细胞和内皮细胞在实施例2的细胞团簇制备装置中的共培养情况见图5。其中，B是共培养细胞的免疫荧光染色图，细胞团簇中类胰岛细胞呈Pdx1阳性表达，内皮细胞呈CD31阳性表达，证明在细胞团簇制备中类胰岛细胞和内皮细胞能够维持分化功能表达。
本实施例中采用微孔阵列进行细胞培养，为准3D环境，与平面培养相比，具有如下技术优势：培养周期更短，可在2天后即形成细胞团簇；成团效率更高，接近100％，几乎不产生单细胞；分化效率更高，近80％细胞表达胰岛相关蛋白；可加强不同细胞之间的接触，达到共培养的目的；细胞团簇获取高效便捷，避免消化等操作，减少细胞团簇的松散和凋亡；细胞团簇尺寸一致性良好，且能够保证细胞团簇的生物性能。
与悬浮培养相比，技术优势主要在于：脂肪干细胞贴壁能力强，难以悬浮培养，可用本发明装置构建准3D环境；成团效率更高，几乎不产生单细胞；分化效率更高；细胞团簇更紧密，细胞间接触更充分；细胞团簇尺寸一致性良好，保证细胞团簇的生物性能。
对比例：
实施例1和实施例2中都采用了PDMS与丝素蛋白混合物作为微图形基底。PDMS是常用材料，可弹性基底用于细胞培养等领域。本申请将PDMS与丝素蛋白的混合物作为基底材料，取得了显著的技术效果：
1、丝素蛋白具有良好的生物相容性，可用于细胞培养基质，与PDMS混合作为基底后，可调节细胞生长情况，其纳米级多孔结构加强了氧气交换和渗透作用，更有利于细胞快速增殖。PDMS与丝素蛋白混合基底与纯PDMS基底在培养细胞方面的差异见图6，对应于实施例3，可看出PDMS与丝素蛋白混合基底可促进细胞快速增殖。
2、丝素蛋白具有疏水性，作为混合基底，有利于细胞从基底脱落，方便无损收集细胞。纯PDMS作为基底材料制备本发明的装置，细胞团簇的回收率为85％，采用PDMS与丝素蛋白的混合体系作为基底材料制备本发明的装置，细胞团簇的回收率可达94％。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (12)

1.用于制备细胞团簇的装置的构建方法，其特征在于，所述装置包括细胞培养板以及固定于细胞培养板的微孔内且具有阵列排列的微图形空腔的基底；
每个微图形空腔构成细胞团簇生长的空间；空腔的形状选自正方形、长方形、三角形、菱形、倒锥形、倒金字塔形或不规则形状；空腔的上表面面积为0.04～1mm2，空腔深度为100～500μm，基底上排列的微图形空腔的数量为1000～5000个；所述构建方法包括：
1)采用蚀刻或光刻工艺制作具有阵列排列的微图形空腔的模板；
2)将液态或半固态的翻模材料注入模板内，固化成型后从模板上剥离，得到翻模印章；
3)将基底材料与交联剂混合，将翻模印章置于上述混合物中，固化成型；
4)将翻模印章从上述成型材料中剥离下来，或者通过化学或物理方法从上述成型材料中去除翻模印章，得到具有阵列排列的微图形空腔的基底；
5)将基底固定于细胞培养板的微孔内，灭菌处理。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，用于制作基底的材料选自聚丙烯、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚乳酸、聚羟基酸、聚乳酸醇酸共聚物、聚二甲基硅氧烷、聚酸酐、聚酸酯、聚酰胺、聚氨基酸、聚缩醛、聚氰基丙烯酸酯、聚氨基甲酸酯、聚吡咯、聚酯、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯、聚碳酸酯、聚氧化乙烯、丝素蛋白、丝素蛋白衍生物、壳聚糖、明胶、明胶衍生物、藻酸盐、琼脂、基质胶、胶原、胶原衍生物、透明质酸、透明质酸衍生物、纤维素、纤维素衍生材料、蛋白多糖、蛋白多糖衍生物、糖蛋白、糖蛋白衍生材料、层连接蛋白、纤连接蛋白和纤维蛋白中的至少一种；和/或
所述细胞培养板为商用多孔培养板。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，用于制作基底的材料为聚二甲基硅氧烷和丝素蛋白的混合物；和/或，所述细胞培养板为商用6孔板、12孔板或24孔板。
4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述基底的弹性模量为0.1KPa-10MPa；和/或
所述基底的pH值为3～12；和/或
所述基底的厚度为100μm～2cm。
5.根据权利要求1-4任一项所述的构建方法，其特征在于，所述基底还包被有细胞外基质成分；
所述细胞外基质成分选自胶原、基质胶、蛋白多糖、糖蛋白、透明质酸、层连接蛋白、纤维连接蛋白中的至少一种。
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，步骤1)中用于制作模板的材料选自硅、铝、铁、锡、玻璃、聚甲基丙烯酸甲酯、聚二甲基硅氧烷、聚己内酯、聚三亚甲基碳酸酯、聚四氟乙烯、聚氧化乙烯、聚乙烯醋酸乙烯酯、聚对二氧环己酮、聚醚醚酮中的至少一种；和/或
步骤2)中所述的翻模材料为可降解材料或不可降解材料，所述可降解材料选自明胶、明胶衍生物、琼脂、琼脂糖、
Figure QLYQS_1
F-127、聚乙烯醇、聚乙二醇中的至少一种，所述不可降解材料选自环氧树脂、酚醛树脂、聚氯乙烯树脂、不饱和聚酯树脂、石膏、硅胶中的至少一种。
7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，步骤2)中所述翻模材料的质量百分比浓度为0.1％～80％；和/或
步骤3)中所述交联剂的浓度为0.1mM～10M；和/或
所述交联剂选自含氢硅油、硅烷偶联剂、二价阳离子、京尼平、戊二醛、已二酸二酰肼、环氧氯丙烷、碳化二亚胺、凝血酶及其衍生物中的至少一种；和/或
步骤3)中所述基底材料与交联剂按1000:1～1:1000的体积比混合；和/或
步骤3)中固化的条件为：温度10～100℃和/或光照强度0.5～1000lx。
8.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，所述交联剂的浓度为1mM～100mM；
和/或，所述翻模材料的质量百分比浓度为1％～25％；
和/或，所述交联剂为含氢硅油；
和/或；所述基底材料与交联剂按10:1～1:10的体积比混合。
9.根据权利要求6-7任一项所述的构建方法，其特征在于，包括：
A1、采用光刻工艺制作具有阵列排列的微图形空腔的聚甲基丙烯酸甲酯模板；
A2、利用模具成型法，将高温液态琼脂注入模板内，冷却凝固成型后从模板上剥离，得到可降解翻模印章；
A3、将聚二甲基硅氧烷和丝素蛋白与交联剂混合，经消泡处理后，将翻模印章置于上述混合物中，室温过夜，固化成型，得到聚二甲基硅氧烷和丝素蛋白混合基底；
A4、将翻模印章通过加热融化，从聚二甲基硅氧烷和丝素蛋白混合基底上去除，得到具有阵列排列的微图形空腔的基底；
A5、外力挤压，将基底固定于12孔细胞培养板的孔内，灭菌处理；
步骤A3中，聚二甲基硅氧烷、丝素蛋白和交联剂的质量比为5～10：0.6～60：1，所述交联剂为含氢硅油。
10.根据权利要求6-7任一项所述的构建方法，其特征在于，包括：
B1、采用刻蚀工艺制作具有阵列排列的微图形空腔的聚甲基丙烯酸甲酯模板；
B2、利用模具成型法，将硅胶与交联剂混合后倒入模板，压制并保证材料完全覆盖微图形模板，待材料完全固化成型后从模板上剥离，得到不可降解翻模印章；
B3、将聚二甲基硅氧烷和丝素蛋白与交联剂混合，经消泡处理后，将翻模印章置于上述混合物中，室温过夜，固化成型；
B4、将翻模印章通过机械力直接剥除，得到具有阵列排列的微图形空腔的基底；
B5、外力挤压，将基底固定于12孔细胞培养板的孔内，灭菌处理；
步骤B2中，硅胶和交联剂的质量比为10：1～1:10，所述交联剂为含氢硅油；
步骤B3中，聚二甲基硅氧烷、丝素蛋白和交联剂的质量比为5～10：0.6～60：1，所述交联剂为含氢硅油。
11.一种用于制备细胞团簇的装置，其特征在于，采用权利要求1-10中任一项所述的构建方法得到。
12.权利要求1-10任一项所述的构建方法，或按照权利要求11所述的装置在细胞团簇培养中的应用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114657126A (zh) * 2022-02-16 2022-06-24 清华大学 造血干细胞的体外培养方法和包括其的组合物及其用途
CN115433679B (zh) * 2022-06-17 2023-06-09 成都诺医德医学检验实验室有限公司 一种类器官培养装置及制造方法和应用
CN115287189B (zh) * 2022-08-18 2023-12-12 重庆大学 一种用于细胞球快速制备的微流控芯片及细胞球制备方法
CN115491285B (zh) * 2022-09-23 2024-05-24 哈尔滨工业大学 可替换的类器官芯片、柔性制造类器官设备及方法
CN115895884A (zh) * 2022-11-30 2023-04-04 苏州大学 一种用于细胞三维培养的超疏水孔板，多器官微流控芯片及其应用
CN115845142B (zh) * 2022-12-23 2024-08-13 武汉大学 快速修复颌骨缺损的软骨样微组织的制备方法
CN118496995B (zh) * 2024-07-16 2024-10-11 清华大学 细胞培养装置及其制备、培养方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103146572A (zh) * 2011-12-07 2013-06-12 清华大学 一种实现细胞集落均质性生长的装置和方法
CN111197024A (zh) * 2018-11-16 2020-05-26 杭州捷诺飞生物科技股份有限公司 类胰腺结构体及其构建方法与应用

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103333802A (zh) * 2013-07-08 2013-10-02 西北工业大学 一种倒锥阵列三维细胞定位培养芯片及其制备方法
CN107257850A (zh) * 2014-12-22 2017-10-17 洛桑联邦理工学院 用于哺乳动物细胞的高通量聚集和操作的装置
CN109097274A (zh) * 2017-06-20 2018-12-28 中国科学院大连化学物理研究所 一种标准化的高通量三维细胞制备装置及其应用
CN108570416B (zh) * 2018-04-08 2021-08-10 西北工业大学 功能分离的单细胞级直接共培养芯片及其使用及制备方法
CN111057649B (zh) * 2019-12-31 2023-02-07 复旦大学 一种微流控芯片及其制备方法与应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103146572A (zh) * 2011-12-07 2013-06-12 清华大学 一种实现细胞集落均质性生长的装置和方法
CN111197024A (zh) * 2018-11-16 2020-05-26 杭州捷诺飞生物科技股份有限公司 类胰腺结构体及其构建方法与应用

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