CN103333802A - 一种倒锥阵列三维细胞定位培养芯片及其制备方法 - Google Patents

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郝艳鹏
魏晨
谢晋
蒋瑾
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Abstract

本发明公开了一种倒锥阵列三维细胞定位培养芯片及其制备方法，属于生物微机电系统领域。该芯片包含阵列分布的倒锥，相邻倒锥之间分布有空腔，各相邻空腔之间有微沟槽相连接；所述芯片基于倒锥阵列硅模板及PDMS完成，其模板采用湿法刻蚀技术完成，其PDMS芯片采用复制模塑技术完成。本发明的有益效果：直接在硅片上湿法刻蚀出倒锥阵列结构，通过复制模塑技术，在PDMS表面构建锥形基底，利用细胞自重，使细胞滑入大小适中的空腔内，实现细胞长时间定位培养。同时，采用空腔之间具有微沟槽连接的图型化设计，使芯片不仅可用于细胞培养，亦可用于细胞间相互作用的研究。该芯片将为贴壁依赖型细胞研究及行为控制、理解细胞功能等提供强有力的工具。

Description

一种倒锥阵列三维细胞定位培养芯片及其制备方法
所属领域
本发明涉及一种基于微细加工技术实现的三维细胞定位培养芯片，属于生物微机电系统（Bio-MEMS）领域。
背景技术
微图型化细胞定位培养芯片作为贴壁依赖型细胞研究及行为控制的实验性工具，在基础细胞生物学、生命科学、组织工程学以及药物筛选、基于细胞的生物传感器等领域具有广阔的应用前景。用微系统技术实现细胞图型化一般有两种方案，一种是通过对表面进行修饰，形成细胞贴附生长的图型化的区域，使细胞选择性地贴附生长形成细胞图型；另一种方法是通过可移除的物理阻隔层将细胞限制在图型化的区域生长，形成细胞图型。通过进行表面化学修饰的细胞培养芯片稳定性较差，实验结果的可重复性较差。Ahmi Choia等（Ahmi Choia,Jae Young Kimc,Jong Eun Leec.Et al.Effectsof PDMS curing ratio and3D micro-pyramid structure on the formation of an invitro neural network.Current Applied Physics.2009,9,(4):294-297.）提出了一种物理图型化方法，通过制备硅金字塔模板，利用复制模塑技术将金字塔复型到PDMS表面，由于细胞自重，细胞滑入沟槽中，实现了海马神经元细胞的培养。但是由于棱锥阵列构成的微沟槽交汇处尺寸受限，细胞将因无法实现正常铺展生长而凋亡，因此无法实现长时间的细胞定位培养，影响对细胞的进一步研究。
发明内容
本发明的目的是：为解决现有细胞定位培养存在稳定性差，或因尺寸受限而无法实现长时间的细胞定位培养的不足，本发明提供一种稳定的长期的三维细胞定位培养芯片。
本发明的技术方案是：一种三维细胞定位培养芯片，包含阵列分布的倒锥1，相邻倒锥1之间分布有空腔2，使得所述倒锥1阵列和空腔2阵列交错分布；各相邻空腔2之间有微沟槽3相连接，微沟槽3与空腔2底面齐平；空腔2最大内切圆直径
Figure BDA00003476932700021
满足：其中，
Figure BDA00003476932700023
是待培养细胞4的平均直径；空腔2底面与锥尖高度差h满足：h≥h0，其中，h0是待培养细胞4的高度平均值；相邻两个空腔2间的距离l，即空腔2中心线之间的距离满足：当应用于细胞接触性连接研究时，
Figure BDA00003476932700024
当应用于细胞非接触性连接研究时，
Figure BDA00003476932700025
其中，l0是待培养细胞4突触长度的平均值；所述微沟槽3均匀分布，宽度b满足：0.5μm≤b≤10μm。
所述三维细胞定位培养芯片基于倒锥阵列硅模板及PDMS完成，其硅倒锥阵列模板的制备采用湿法刻蚀技术完成，具体包括如下步骤：
步骤一：用浓硫酸和过氧化氢混合溶液对硅片表面进行清洗，然后用去离子水清洗，用氮气吹干；
步骤二：LPCVD沉积氮化硅，作为湿法刻蚀硅片的掩膜层；
步骤三：涂光刻胶，进行曝光，显影，将刻蚀窗口从掩膜版转移到光刻胶上；
步骤四：RIE刻蚀氮化硅掩膜，将刻蚀窗口转移到氮化硅掩膜层上；
步骤五：丙酮去除光刻胶；
步骤六：KOH溶液湿法刻蚀硅片，刻蚀出倒锥阵列结构；
步骤七：H3PO4去除氮化硅掩膜层，得到所述倒锥阵列硅模板。
所述倒锥阵列PDMS三维细胞定位培养芯片的制备方法，采用复制模塑技术完成，具体包括如下步骤：
步骤一：按质量或体积比为10:1混合PDMS预聚体和交联剂，充分搅拌均匀后，放入真空干燥箱中脱气，直至混合过程中产生的气泡完全排除；
步骤二：将PDMS浇注在硅模板上，并静置；所述硅模板包含阵列分布的倒锥，倒锥底部方形区域最大内切圆直径满足：
Figure BDA00003476932700027
倒锥深度h满足：h≥h0，相邻两个倒锥间距离l满足：当应用于细胞接触性连接研究时，
Figure BDA00003476932700031
当应用于细胞非接触性连接研究时，
Figure BDA00003476932700032
倒锥有均匀分布的梁连接，梁宽度b满足：0.5μm≤b≤10μm；
步骤三：将浇注PDMS后的硅模板置于真空干燥箱中，使PDMS发生交联反应而固化；
步骤四：将冷却后的PDMS轻轻剥下，就得到了所述倒锥阵列PDMS的三维细胞定位培养芯片。
本发明的有益效果是：发明提出了一种基于倒锥阵列硅模板及PDMS的三维细胞定位培养芯片的结构及制备方法，直接在硅片上湿法刻蚀出倒锥阵列结构，通过复制模塑技术，在PDMS表面构建锥形基底，利用细胞自重，使细胞滑入大小适中的空腔2内，实现细胞长时间定位培养。同时，采用空腔2之间具有微沟槽3连接的图型化设计，使芯片不仅可用于细胞培养，亦可用于细胞间相互作用的研究。该细胞培养微芯片将为贴壁依赖型细胞研究及行为控制、理解细胞功能等提供强有力的工具。
附图说明
图1为本发明提出的三维细胞定位培养芯片三维视图
图2为本发明提出的三维细胞定位培养芯片结构尺寸及示意图
图3为湿法刻蚀硅成倒锥阵列的三维视图
图4为三维细胞定位培养芯片的三维视图
图5为硅模板制备的掩膜版图型
图6为硅模板制备方法示意图
图7为倒锥阵列PDMS的三维细胞定位培养芯片制备方法示意图
图中：1.倒锥，2.空腔，3.微沟槽，4.待培养细胞，5.掩膜版掩膜区域，6.硅湿法刻蚀窗口
具体实施方式：
实施例1：
本实施例中的芯片用于培养成骨细胞MC3T3-E1来进行细胞接触性连接研究。MC3T3-E1平均直径
Figure BDA00003476932700041
为20μm，平均高度h0为3μm，平均突触长度l0为20μm。
参阅图2，本实施例中用于MC3T3-E1培养的三维细胞定位培养芯片，包含阵列分布的倒锥1，倒锥1底部分布着空腔2；各相邻空腔2之间有微沟槽3相连接，微沟槽3与空腔2底面齐平；空腔2底面与锥尖高度差h=40μm；空腔2内切圆直径
Figure BDA00003476932700042
相邻两个空腔2间的距离l＝60μm；所述微沟槽3均匀分布，宽度b＝3μm。
本实施例中基于硅倒锥阵列模板及PDMS的三维细胞培养定位芯片的制备方法，采用湿法刻蚀技术和复制模塑技术完成，具体包括如下步骤：
步骤一：按质量为10:1混合PDMS预聚体和交联剂，并充分搅拌均匀后，放入真空干燥箱中脱气30分钟，直至混合过程中产生的气泡完全排除；
步骤二：将PDMS浇注在硅模板上，并静置；所述硅模板包含倒锥阵列，锥底方形内切圆直径
Figure BDA00003476932700043
倒锥深度h＝40μm，相邻两个倒锥间的距离l＝60μm，倒锥间有均匀分布的梁连接，梁宽度b＝3μm；
所述硅倒锥阵列模板结构制备包括如下子步骤：
子步骤一：制作掩模版；
子步骤二：对硅片表面进行清洗，用体积比为3：1的98%的硫酸和30%的过氧化氢混合溶液清洗10分钟，然后用去离子水清洗，用氮气吹干；
子步骤三：LPCVD沉积氮化硅200nm，作为湿法刻蚀硅片的掩膜层；
子步骤四：涂光刻胶，进行曝光，显影，将刻蚀窗口从掩膜版转移到光刻胶上；
子步骤五：RIE刻蚀氮化硅掩膜200s，将刻蚀窗口转移到氮化硅掩膜层上；
子步骤六：丙酮去除光刻胶；
子步骤七：在浓度为30%，温度为80℃的KOH溶液中湿法刻蚀硅片35min，刻蚀出倒锥阵列结构；
子步骤八：在浓度为85%，温度为170℃的H3PO4中去除氮化硅掩膜层，得到所述有倒锥阵列结构的硅模板。
步骤三：将浇注PDMS后的硅模板置于真空干燥箱中，使PDMS发生交联反应而固化，固化参数为：固化温度80℃，固化时间2h；
步骤四：将冷却后的PDMS轻轻剥下，就得到了所述倒锥阵列PDMS的三维细胞定位培养芯片。

Claims (2)

1.一种三维细胞定位培养芯片，材质为PDMS，其特征在于：所述芯片包含阵列分布的倒锥（1），相邻倒锥（1）之间分布有空腔（2），使得所述倒锥（1）阵列和空腔（2）阵列交错分布；各相邻空腔（2）之间有微沟槽（3）相连接，微沟槽（3）与空腔（2）底面齐平；空腔（2）最大内切圆直径
Figure FDA00003476932600015
满足：
Figure FDA00003476932600016
，其中，
Figure FDA00003476932600017
是待培养细胞（4）的平均直径；空腔（2）底面与锥尖高度差h满足：h≥h0，其中，h0是待培养细胞（4）的高度平均值；相邻两个空腔（2）间的距离l，即空腔（2）中心线之间的距离满足：当应用于细胞接触性连接研究时，
Figure FDA00003476932600018
；当应用于细胞非接触性连接研究时，
Figure FDA00003476932600019
，其中，l0是待培养细胞（4）突触长度的平均值；所述微沟槽（3）均匀分布，宽度b满足：0.5μm≤b≤10μm。
2.如权利要求1所述三维细胞定位培养芯片，其制备基于倒锥阵列硅模板及PDMS完成，所述硅倒锥阵列模板的制备,包括如下步骤：
步骤一：对硅片表面进行清洗，吹干；
步骤二：LPCVD沉积氮化硅，作为湿法刻蚀硅片的掩膜层；
步骤三：涂光刻胶，进行曝光，显影，将刻蚀窗口从掩膜版转移到光刻胶上；
步骤四：RIE刻蚀氮化硅掩膜，将刻蚀窗口转移到氮化硅掩膜层上；
步骤五：丙酮去除光刻胶；
步骤六：KOH溶液湿法刻蚀硅片，刻蚀出倒锥阵列结构；
步骤七：H3PO4去除氮化硅掩膜层，得到所述倒锥阵列硅模板，所述硅模板包含阵列分布的倒锥，倒锥底部方形区域最大内切圆直径满足：倒锥深度h满足：h≥h0，相邻两个倒锥间距离l满足：当应用于细胞接触性连接研究时，
Figure FDA00003476932600013
当应用于细胞非接触性连接研究时，倒锥有均匀分布的梁连接，梁宽度b满足：0.5μm≤b≤10μm；
基于所述倒锥阵列进行三维细胞定位培养PDMS芯片制备的方法,包括如下步骤：
步骤一：混合PDMS预聚体和交联剂，充分搅拌均匀后，放入真空干燥箱中脱气，直至混合过程中产生的气泡完全排除；
步骤二：将PDMS浇注在硅模板上，并静置；
步骤三：将浇注PDMS后的硅模板置于真空干燥箱中，使PDMS发生交联反应而固化；
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