CN103122311B - 一种柔性三维单细胞定位培养芯片及其可控制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于微细加工技术实现的柔性三维单细胞定位培养芯片，属于生物微机电系统（Bio-MEMS）领域。该芯片包含阵列分布的细胞培养微井1，每个细胞培养微井1底部包含微柱阵列3。该芯片的制备方法采用MEMS技术和复制模塑技术完成，包括混合PDMS预聚体和交联剂、硅模板上浇注PDMS、PDMS固化、剥离PDMS的过程。本发明的有益效果：通过控制细胞培养微井1尺寸将待培养细胞2限制在微井内，实现细胞定位培养；同时使微井本身深度大于微井中微柱高度，实现细胞的三维培养。芯片制备时直接在PDMS表面构建图型化基底，芯片无需经过任何物理或化学修饰即可用于细胞培养，具有图型性质和图型结构长期稳定、可靠的特点。PDMS材料具有良好的透光性，便于细胞的观察。

Description

一种柔性三维单细胞定位培养芯片及其可控制备方法

所属领域

本发明涉及一种基于微细加工技术实现的柔性三维单细胞定位培养芯片，属于生物微机电系统（Bio-MEMS）领域。

背景技术

大部分基于细胞群的实验由于平均细胞反应可能出现误导，并遗失细胞的瞬态数据。为了准确探测细胞功能，将单个细胞限定在特定位点的技术是不可或缺的。单细胞培养芯片作为贴壁依赖型细胞研究及行为控制的实验性工具，在基础细胞生物学、组织工程学、药物筛选以及基于细胞的生物传感器等领域具有广阔的应用前景。

目前研究最广泛的细胞定位方法是基于凝胶实现的，这些软凝胶具有对细胞无毒性、透明、柔软等特性，被用来分析细胞-基底间、细胞-细胞间的相互作用。其中的关键问题在于凝胶具有从玻璃表面物理剥离的趋势，细胞图型的稳定性也因此成为该技术发展的瓶颈。为此，Inhee Choi等（Inhee Choi,Young In Yang,JongheopYi.et al.Directed positioning of single cells in microwells fabricated byscanning probe lithography and wet etching methods.Langmuir2008,24:2597-2602）基于扫描探针微影技术和湿法刻蚀技术直接在硅片表面加工出微井，并实现了单个大肠杆菌细胞的定位培养。该方法通过控制微井尺寸将细胞限制在微井中。由于微井是基于MEMS技术直接在硅表面刻蚀得到，用于细胞培养无需任何化学修饰，因此，具有细胞图型稳定的特点。然而，该方法的局限性在于硅基底不透明，细胞观察需借助于各种染色方法实现。Jianping Fu等（Jianping Fu,Yang-Kao Wang,Christopher S Chen.et al.Mechanical regulation of cell function withgeometrically modulated elastomeric substrates.Nat Methods.2010,7(9):733-736.）的研究工作表明，PDMS微柱阵列可用于细胞培养。

发明内容

本发明的目的是：为解决现有单细胞三维定位培养芯片存在的图型质量稳定性差的问题，本发明提供一种可实现稳定的细胞培养的柔性三维单细胞定位培养芯片。

本发明的技术方案是：一种基于PDMS的柔性三维单细胞定位培养芯片，包含阵列分布的细胞培养微井1，每个细胞培养微井1底部包含微柱阵列3；所述微柱呈方形，边长a₁满足：1≤a₁≤10μm，高度h₁满足：1≤h₁≤100μm,相邻两个微柱间的距离l₁，即相邻微柱中心线之间的距离满足：0＜l₁＜10μm；所述细胞培养微井1呈方形，边长a₂满足：其中，是待培养细胞2直径的统计平均值，细胞培养微井1上表面与微柱阵列3顶部所形成表面的高度差h₂满足：h₀≤h₂＜2h₀，其中，h₀是待培养细胞2的高度平均值，细胞培养微井1深度h满足h＝h₁+h₂，相邻两个细胞培养微井1间的距离l，即微井中心线之间的距离满足：

所述柔性三维单细胞定位培养芯片的制备方法，采用MEMS技术和复制模塑技术完成，具体包括如下步骤：

步骤一：按质量或体积比为10:1混合PDMS预聚体和交联剂，并充分搅拌均匀后，放入真空干燥箱中脱气直至混合过程中产生的气泡完全排除。

步骤二：将PDMS浇注在硅模板上，并静置；所述硅模板由重复单元组成，每个单元包含微孔阵列，图型尺寸设计如下：微孔设计呈方形，边长A₁满足1≤A₁≤10μm，深度H₁满足1≤H₁≤100μm，相邻两个微孔间的距离L₁，即微孔中心线之间的距离满足：0＜L₁＜10μm；重复单元外形设计呈方形，边长A₂满足：其中，是待培养细胞直径2的统计平均值，单元底部表面与微孔阵列底部所形成表面的高度差H₂满足：h₀≤H₂＜2h₀，其中，h₀是待培养细胞2的高度平均值，单元深度H满足H＝H₁+H₂，相邻两个重复单元间的距离L满足：

步骤三：将浇注后的PDMS及模板置于真空干燥箱中，使PDMS预聚物发生交联反应而固化。

步骤四：将冷却后的PDMS剥下，就得到了带有浮凸图型的PDMS芯片，在PDMS芯片表面上精确复制了模板上原有的图型。

本发明的有益效果是：本发明提出了一种基于PDMS材料的柔性三维单细胞定位培养芯片结构及制备方法。通过控制细胞培养微井1尺寸将待培养细胞2限制在细胞培养微井1内，实现细胞的定位培养；同时使细胞培养微井1本身深度大于微井中微柱的高度，实现细胞的三维培养。

本发明提出的柔性三维单细胞定位培养芯片，直接在PDMS表面构建图型化基底，芯片无需经过任何物理或化学修饰即可用于细胞培养，因而具有图型性质和图型结构长期稳定、可靠的特点，克服了目前基于凝胶实现图型化时，图型稳定性差的缺陷；克服了基于硅材料的细胞定位培养芯片由于不透明而不利于细胞观察的不足。该细胞培养微芯片将为贴壁依赖型细胞研究及行为控制、理解细胞功能等提供强有力的工具。

附图说明

图1为实施例中的柔性三维单细胞定位培养芯片进行细胞培养的效果图

图2为实施例中的柔性三维单细胞定位培养芯片结构示意图

图3为图2的A-A剖面图

图4为实施例中柔性三维单细胞定位培养芯片制备技术路线图

图5为实施例中柔性三维单细胞定位培养芯片制备过程中使用的硅模板结构示意图

图6为图4的A-A剖面图

图7为实施例中柔性三维单细胞定位培养芯片制备过程中使用的硅模板结构制备流程图

图中：1-细胞培养微井，2-待培养细胞，3-微柱阵列

具体实施方式：

实施例1：

本实施例中的芯片用于培养成骨细胞MC3T3-E1。MC3T3-E1直径的统计平均值为20μm，高度h₀为3μm。

参阅图1~图3，本实施例中用于MC3T3-E1培养的柔性三维单细胞定位培养芯片，包含阵列分布的细胞培养微井1，每个细胞培养微井1底部包含微柱阵列3；所述微柱呈方形，边长a₁满足：a₁＝3μm，高度h₁满足：h₁＝15μm,相邻两个微柱间的距离l₁，即相邻微柱中心线之间的距离满足：l₁＝6μm；所述细胞培养微井1呈方形，边长a₂满足：a₂＝25μm，细胞培养微井1上表面与微柱阵列3顶部所形成表面的高度差h₂满足：h₂＝4μm，细胞培养微井1深度h＝h₁+h₂＝15+4＝19μm，相邻两个细胞培养微井1间的距离l，即微井中心线之间的距离满足：l＝30μm。

参阅图4，本实施例中柔性三维单细胞定位培养芯片的制备方法，采用MEMS技术和复制模塑技术完成，具体包括如下步骤：

步骤一：混合:按质量为10:1混合PDMS预聚体和交联剂，并充分搅拌均匀后，放入真空干燥箱中脱气30分钟，直至混合过程中产生的气泡完全排除；

步骤二：将PDMS浇注在硅模板上，并静置。参阅图5、图6，所述硅模板由重复单元组成，每个单元包含微孔阵列，图型尺寸设计如下：微孔设计呈方形，边长A₁＝3μm，深度H₁＝15μm，相邻两个微孔间的距离（微孔中心线之间的距离）L₁＝6μm。重复单元外形设计呈方形，边长A₂＝25μm，单元底部表面与微孔阵列底部所形成表面的高度差H₂＝4μm。单元深度H满足H＝H₁+H₂＝15+4＝19μm，相邻两个重复单元间的距离L＝30μm。参阅图7，所述硅模板制备包括如下子步骤：

子步骤一：制作掩模版；

子步骤二：溅射铝：铝膜厚度为100nm；

子步骤三：光刻；

子步骤四：铝刻蚀剂刻蚀铝；

子步骤五：去除光刻胶；

子步骤六：涂胶；

子步骤七：光刻；

子步骤八：刻蚀铝；

子步骤九：电感耦合等离子体反应刻蚀，得到符合要求的硅微米结构。采用的具体刻蚀工艺参数为：SF₆，气体流量180sccm/min，刻蚀时间14s；C₄F₆，气体流量85sccm/min，钝化时间7s；刻蚀/钝化循环的次数为14次；刻蚀结束后，以O₂作为工作气体，去除光刻胶；

子步骤十：铝刻蚀剂刻蚀铝；

步骤三：固化。将浇注后的PDMS及模板置于真空干燥箱中，使PDMS预聚物发生交联反应而固化。固化参数为：固化温度80℃，固化时间2h。

步骤四：将冷却后的PDMS轻轻剥下，就得到了所述柔性三维单细胞定位培养芯片。

实施例2：

本实施例中的芯片用于培养人乳腺上皮细胞HMEC。HMEC平均直径为45μm，平均高度h₀为5μm。

参阅图1~图3，本实施例中的基于PDMS的柔性三维单细胞定位培养芯片，包含阵列分布的细胞培养微井1，每个细胞培养微井1底部包含微柱阵列3；所述微柱呈方形，边长a₁满足：a₁＝4μm，高度h₁满足：h₁＝20μm,相邻两个微柱间的距离l₁，即相邻微柱中心线之间的距离满足：l₁＝7μm；所述细胞培养微井1呈方形，边长a₂满足：a₂＝55μm，细胞培养微井1上表面与微柱阵列3顶部所形成表面的高度差h₂满足：h₂＝6μm，细胞培养微井1深度h＝h₁+h₂＝20+6＝26μm，相邻两个细胞培养微井1间的距离l，即微井中心线之间的距离满足：l＝60μm。

参阅图4，本实施例中柔性三维单细胞定位培养芯片的制备方法，采用MEMS技术和复制模塑技术完成，具体包括如下步骤：

步骤一：混合：按体积比为10:1混合PDMS预聚体和交联剂，并充分搅拌均匀后，放入真空干燥箱中脱气30分钟，直至混合过程中产生的气泡完全排除；

步骤二：将PDMS浇注在硅模板上，并静置。参阅图5、图6，所述硅模板由重复单元组成，每个单元包含微孔阵列，图型尺寸设计如下：微孔设计呈方形，边长A₁＝4μm，深度H₁＝20μm，相邻两个微孔间的距离（微孔中心线之间的距离）L₁＝7μm。重复单元外形设计呈方形，边长A₂＝55μm，单元底部表面与微孔阵列底部所形成表面的高度差H₂＝6μm，单元高度H满足H＝H₁+H₂＝20+6＝26μm，相邻两个重复单元间的距离L＝60μm。

步骤三：固化。将浇注后的PDMS及模板置于真空干燥箱中，使PDMS预聚物发生交联反应而固化。固化参数为：固化温度90℃，固化时间2h。

步骤四：将冷却后的PDMS轻轻剥下，就得到了所述柔性三维单细胞定位培养芯片。其它步骤与实施例1无异，故略去。

Claims (1)

1.一种基于PDMS的柔性三维单细胞定位培养芯片，包含阵列分布的细胞培养微井（1），每个细胞培养微井（1）底部包含微柱阵列（3）；所述微柱呈方形，边长a₁满足：1≤a₁≤10μm，高度h₁满足：1≤h₁≤100μm,相邻两个微柱间的距离l₁，即相邻微柱中心线之间的距离满足：0＜l₁＜10μm；所述细胞培养微井（1）呈方形，边长a₂满足：其中， 是待培养细胞（2）直径的统计平均值，细胞培养微井（1）上表面与微柱阵列（3）顶部所形成表面的高度差h₂满足：h₀≤h₂＜2h₀，其中，h₀是待培养细胞（2）的高度平均值，细胞培养微井（1）深度h满足h＝h₁+h₂，相邻两个细胞培养微井（1）间的距离l，即微井中心线之间的距离满足：  ;

所述柔性三维单细胞定位培养芯片的制备方法，采用MEMS技术和复制模塑技术完成，具体包括如下步骤：

步骤一：按质量或体积比为10:1混合PDMS预聚体和交联剂，并充分搅拌均匀后，放入真空干燥箱中脱气直至混合过程中产生的气泡完全排除 ;

步骤二：将PDMS浇注在硅模板上，并静置；所述硅模板由重复单元组成，每个单元包含微孔阵列，图型尺寸设计如下：微孔设计呈方形，边长A₁满足1≤A₁≤10μm，深度H₁满足1≤H₁≤100μm，相邻两个微孔间的距离L₁，即微孔中心线之间的距离满足：0＜L₁＜10μm；重复单元外形设计呈方形，边长A₂满足：其中，是待培养细胞直径（2）的统计平均值，单元底部表面与微孔阵列底部所形成表面的高度差H₂ 满足：h₀≤H₂＜2h₀，其中，h₀是待培养细胞（2）的高度平均值，单元深度H满足H＝H₁+H₂，相邻两个重复单元间的距离L：  ;

步骤三：将浇注后的PDMS及模板置于真空干燥箱中，使PDMS预聚物发生交联反应而固化 ;

步骤四：将冷却后的PDMS剥下，就得到了带有浮凸图型的PDMS芯片，在PDMS芯片表面上精确复制了模板上原有的图型。