CN110343655A - 一种集成细胞捕获、三维基底培养及生物分析的芯片 - Google Patents

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CN110343655A CN201810281320.7A CN201810281320A CN110343655A CN 110343655 A CN110343655 A CN 110343655A CN 201810281320 A CN201810281320 A CN 201810281320A CN 110343655 A CN110343655 A CN 110343655A
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李林梅
刘梅梅
颜世强
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Abstract

本发明涉及一种集成细胞捕获、三维基底培养及生物分析的芯片，包括含有微纳结构的细胞三维培养基底、微孔阵列穿孔膜和生物分析基底。其优点在于：(1)所制作的微孔阵列穿孔膜可与各种细胞三维培养基底结合为细胞培养提供不同的三维环境；(2)该系统可用于细胞多指标生物分子分析；(3)该系统可实现单细胞三维基底培养；(4)该系统可用于单细胞多指标生物分子分析，如分泌蛋白谱分析。

Description

一种集成细胞捕获、三维基底培养及生物分析的芯片
技术领域
本发明涉及生物微机电系统、微流控芯片、细胞分析领域，特别涉及一种集成细胞捕获、三维基底培养及生物分析的芯片。
背景技术
细胞的增殖、分化和代谢等生理活动极大程度上受到其生长的微环境的影响。传统二维平面培养的细胞在形态、结构和功能等方面都与体内生长的细胞相去甚远，甚至会失去许多生物标志物。三维细胞培养模型以其能够为细胞提供立体微环境，更加接近生理条件下的培养被广泛应用于血管组织再生、药物毒性研究、药物筛选和肿瘤治疗等方面。
在不同的单细胞分析技术中，单细胞分泌蛋白分析能够直接测定功能表型，揭示细胞反应机制与疾病治疗之间的潜在关联性受到广泛关注。单细胞分泌蛋白分析常用手段有酶联免疫斑点检测ELISPOT、细胞内细胞因子染色ICS和单细胞抗体条形码芯片SCBC等，而这些方法多数都是基于二维细胞培养，灵活设计物理微环境探究细胞培养环境对细胞功能的影响至今仍少有研究，本发明提出了一种高通量细胞捕获、三维基底培养及多重生物分子分析系统及方法，可将其用于单细胞生物分子分析，如分泌蛋白多指标分析。
发明内容
本发明的目的是提供一种集成细胞捕获、三维基底培养及生物分析的芯片，探究细胞培养环境对细胞功能的影响，本发明所解决的技术问题采用以下技术方案来实现：
一种集成细胞捕获、三维基底培养及生物分析的芯片，该芯片包括三层结构，下层是含有微纳结构的细胞三维培养基底，中层是微孔阵列穿孔膜，上层是生物分析基底。
所述的细胞三维培养基底材料包括但不限于硅片、PDMS、水凝胶、聚合物支架、三维聚苯乙烯支架、聚偏二氟乙烯膜、硝酸纤维素膜、各种孔径的滤纸等。
所述的微孔阵列穿孔膜由弹性材料制成，所述弹性材料包括但不限于PDMS及各种修饰后的PDMS。
所述的微孔阵列穿孔膜含阵列分布的穿孔，穿孔形状包括正多边形、矩形或圆形，穿孔数目为1～1000000个/cm2，穿孔尺寸为1μm～1cm，穿孔膜厚度为1μm～1mm。
所述的生物分析基底包括但不限于多聚赖氨酸玻璃、环氧树脂玻璃、或者包被了蛋白、抗体或DNA的玻片、或者包被了蛋白阵列、抗体阵列或DNA阵列的玻片。
一种集成细胞捕获、三维基底培养及生物检测的芯片的制备方法，按照以下步骤进行：
采用多聚赖氨酸玻璃、环氧树脂玻璃、或者包被了蛋白、抗体或DNA的玻片、或者包被了蛋白阵列、抗体阵列或DNA阵列的玻片作为生物分析基底；
用光刻法制作含有微柱阵列的硅模板，将PDMS混匀脱气后倒在硅模板上，以一定转速甩胶使PDMS厚度低于微柱高度，加热使PDMS交联固化，冷却后揭下即得PDMS微孔阵列穿孔膜；
将PDMS微孔阵列穿孔膜与具有微纳结构的细胞三维培养基底组装起来，种上细胞后盖上上述生物分析基底。
一种集成细胞捕获、三维基底培养及生物分析的芯片的应用，该芯片可用于多种细胞分析、多种细胞的单细胞分析、多种细胞的多重生物分子分析或多种细胞的单细胞多重生物分子分析。
所述的多种细胞包括但不限于哺乳细胞、动物细胞。
所述的多重生物分子分析，包括但不限于分泌蛋白、细胞因子、多肽、肽段、核酸、细胞表面蛋白、细胞表面受体、激素、抗原、生长因子或外泌体的分析。
所述的多重生物分子分析中的多重分析包括从1到100个指标的分析。
一种集成细胞捕获、三维基底培养及生物分析的芯片的应用，其检测分泌蛋白的应用方法具体为：
在多聚赖氨酸玻片上包被上捕获抗体；将细胞三维培养基底和微孔阵列穿孔膜组装起来；将细胞以一定密度种在芯片上；盖上包被了捕获抗体的玻片，用夹具固定，置培养箱中培养一定时间；显微镜拍照；卸下夹具，夹心免疫法进行后续分泌蛋白的检测。
与现有技术相比，本发明优点在于：
(1)所制作的微孔阵列穿孔膜可与各种细胞三维培养基底结合为细胞培养提供不同的三维环境；
(2)该系统可用于细胞多指标生物分子分析；
(3)该系统可实现单细胞三维基底培养；
(4)该系统可用于单细胞多指标生物分子分析，如分泌蛋白谱分析。
附图说明
图1为本发明提出的一种集成细胞捕获、三维基底培养及生物分析系统结构示意图。
图2为集成细胞捕获、三维基底培养及生物分析系统应用于分泌蛋白检测时的芯片示意图。
图3为图2的俯视图。
图4为图3的局部放大图。
图5为pr-PDMS的制备方法示意图。
图6(1)为PDMS微孔阵列穿孔膜的制备方法示意图，图6(2)为硅模板7的俯视图和局部放大图。
图7为PDMS微孔阵列穿孔膜的硅模板的制备方法示意图。
图8为PVDF膜扫描电镜图。
图9为pr-PDMS扫描电镜图。
图10为PDMS微孔阵列穿孔膜扫描电镜图。
图11为PDMS微孔阵列穿孔膜扫描仪扫描图。
图12为图11的局部放大图。
图13为PDMS微孔阵列穿孔膜截面图。
图14为PDMS微孔阵列穿孔膜贴在pr-PDMS上的显微镜图。
图15为正方形穿孔中U87细胞和信号图。
图16为U87细胞分布结果图。
图17为PVDF膜上U87分泌蛋白情况结果图。
图18为pr-PDMS上U87分泌蛋白情况结果图。
图19为矩形阵列穿孔膜硅模板示意图。
图20为抗体阵列示意图。
图21(1)为PDMS通道的制备方法示意图，图21(2)为硅模板13的俯视图和局部放大图。
图22为矩形PDMS穿孔膜扫描仪扫描图。
图23为矩形PDMS穿孔膜贴在pr-PDMS上的显微镜图。
图24为FITC-BSA流过通道的扫描图。
图25为图24虚线处的荧光强度图。
图26为矩形穿孔中U87细胞和信号图。
其中1为生物分析基底，2为微孔阵列穿孔膜，3为细胞三维培养基底，4为夹具，5为PVDF膜，6为pr-PDMS，7为正方形阵列硅模板，8为PDMS微孔阵列穿孔膜，9为硅片，10为光刻胶，11为掩膜，12为矩形阵列硅模板,13为抗体阵列通道硅模板，14为PDMS通道。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步解释说明，以下实验事例旨在说明本发明而不是对本发明的进一步限定。
实施例1
本实施例一种集成细胞捕获、三维基底培养及生物分析的芯片，参阅图1～图4。该芯片包括三层结构，下层是含有微纳结构的细胞三维培养基底3，中层是微孔阵列穿孔膜2，上层是生物分析基底1。
所述含有微纳结构的细胞三维培养基底3为包含PVDF膜和基于PVDF膜的PDMS三维支架(以下简称为pr-PDMS)的基底。
所述微孔阵列穿孔膜2为PDMS微孔阵列穿孔膜。
所述生物分析基底1为包被了抗体的多聚赖氨酸玻片。
本实施例中pr-PDMS，采用复制模塑技术完成，如图5所示，具体包括以下步骤：
步骤一：将PVDF膜平整地贴在硅片上；
步骤二：按质量比10:1混合PDMS预聚物和交联剂，搅拌均匀，置于真空干燥器中脱气至无气泡；
步骤三：将PDMS倒在PVDF膜5上，静置至PDMS完全渗透；
步骤四：将上述装置置于烘箱中80℃加热2h，使PDMS发生交联而固化；
步骤五：冷却后于乙醇中揭下PVDF膜，得到pr-PDMS 6。
本实施例中PDMS微孔阵列穿孔膜，采用MEMS技术和复制模塑技术完成，如图6、图7所示，具体包括以下步骤：
步骤一：按质量比10:1混合PDMS预聚物和交联剂，搅拌均匀，置于真空干燥器中脱气至无气泡；
步骤二：将PDMS倒在正方形阵列硅模板7上，甩胶500rpm 18s+1400rpm 60s；所述硅模板7包含15×7个10×10的正方形微柱，微柱大小为100μm×100μm，高度约为130μm，两微柱中心的距离为200μm，两10×10的正方形单元中心的距离为2.9mm；
所述硅模板7上的微米图型结构由光刻制得，具体工艺参数为：硅片9预烘105℃10min；O2plasma处理3min；甩光刻胶(SU 8)10 500rpm 18s+1000rpm 60s；前烘95℃15min；二次甩胶500rpm 18s+1000rpm 60s；二次前烘95℃30min；测量光刻强度为10mW/cm2，将掩膜11置于光刻胶上，曝光40s；后烘95℃1min；乳酸乙酯显影后坚模120℃2h；熏三甲基氯硅烷过夜。
步骤三：将浇注了PDMS的硅模板7置于热板上80℃加热30min，使PDMS发生交联而固化；
步骤四：冷却后于乙醇中揭下PDMS，得到所述PDMS微孔阵列穿孔膜8。
本实施例中的芯片用于培养人脑胶质瘤细胞U87来研究细胞微环境对单细胞分泌功能的影响，如图2所示，本实施例实验流程包括以下步骤：
步骤一：在多聚赖氨酸玻片上包被上IL-8、MCP-1、IL-6捕获抗体；
步骤二：分别将PVDF膜、pr-PDMS基底和PDMS微孔阵列穿孔膜组装起来；
步骤三：以2×105cells/ml，200μl/chip分别将U87种在两个芯片上；
步骤四：盖上步骤一获得的抗体玻片，用夹具固定，置37℃培养箱培养6h；
步骤五：显微镜明场、荧光拍照；
步骤六：卸下夹具，进行后续ELISA检测，芯片扫描仪扫描。
本实施例结果见图8～图18。图8为PVDF膜扫描电镜图，从图中可以看出PVDF膜同时具有微米级和纳米级的孔；图9为pr-PDMS扫描电镜图，从图中可以看出pr-PDMS上有微米级凸起结构；图10为PDMS微孔阵列穿孔膜扫描电镜图，从图中可以看出所制作的穿孔膜的微孔阵列确实为穿孔；图11为PDMS微孔阵列穿孔膜扫描仪扫描图；图12为图11的局部放大图；图13为PDMS微孔阵列穿孔膜截面图，穿孔膜厚度约为120μm；图14为PDMS微孔阵列穿孔膜贴在pr-PDMS上的显微镜图；图15为正方形穿孔中含0个、1个、2个U87细胞的细胞图和信号图；图16为U87细胞分布结果图，细胞分布服从泊松分布；图17为PVDF膜上U87分泌蛋白情况结果图，PVDF膜基底上U87单细胞IL-8的分泌比MCP-1和IL-6高；图18为pr-PDMS上U87分泌蛋白情况结果图，pr-PDMS基底上U87单细胞IL-8的分泌也比MCP-1和IL-6高，比较图17和图18，U87单细胞在pr-PDMS基底上IL-8、MCP-1、IL-6三种蛋白的分泌水平均比PVDF膜上高。
实施例2
一种集成细胞捕获、三维基底培养及生物分析的芯片，参阅图1～图4。该芯片包括三层结构，下层是含有微纳结构的细胞三维培养基底，中层是微孔阵列穿孔膜，上层是生物分析基底。
所述含有微纳结构的细胞三维培养基底为包含PVDF膜和基于PVDF膜的PDMS三维支架(以下简称为pr-PDMS)的基底。
所述微孔阵列穿孔膜为PDMS微孔阵列穿孔膜。
所述生物分析基底为包被了抗体阵列的多聚赖氨酸玻片。
本实施例中pr-PDMS，采用复制模塑技术完成，如图5具体包括以下步骤：
步骤一：将PVDF膜平整地贴在硅片上；
步骤二：按质量比10:1混合PDMS预聚物和交联剂，搅拌均匀，置于真空干燥器中脱气至无气泡；
步骤三：将PDMS倒在PVDF膜上，静置至PDMS完全渗透；
步骤四：将上述装置置于烘箱中80℃加热2h，使PDMS发生交联而固化；
步骤五：冷却后于乙醇中揭下PVDF膜，得到pr-PDMS。
本实施例中PDMS微孔阵列穿孔膜，如图6、图7和图19,采用MEMS技术和复制模塑技术完成，具体包括以下步骤：
步骤一：按质量比10:1混合PDMS预聚物和交联剂，搅拌均匀，置于真空干燥器中脱气至无气泡；
步骤二：将PDMS倒在硅模板12上，甩胶500rpm 18s+1400rpm 60s；所述硅模板包含14列矩形，每列含有59个凸柱，凸柱大小为1.44mm×40μm，高度约为130μm，两凸柱中心的距离为320μm，两列凸柱中心的距离为3.04mm；
所述硅模板12上的图型结构由光刻制得，具体工艺参数为：硅片预烘105℃10min；O2plasma处理3min；甩光刻胶(SU 8)500rpm 18s+1000rpm 60s；前烘95℃15min；二次甩胶500rpm 18s+1000rpm 60s；二次前烘95℃30min；测量光刻强度为10mW/cm2，曝光40s；后烘95℃1min；乳酸乙酯显影后坚模120℃2h；熏三甲基氯硅烷过夜。
步骤三：将浇注了PDMS的硅模板12置于热板上80℃加热30min，使PDMS发生交联而固化；
步骤四：冷却后于乙醇中揭下PDMS，得到所述PDMS微孔阵列穿孔膜，其厚度为120μm。
所述抗体阵列，如图20所示，包含9条抗体条带，每个条带宽40μm，每两个条带之间的距离为80μm，条带通过相应的PDMS通道包被到多聚赖氨酸玻片上，PDMS通道尺寸同抗体条带一致，PDMS通道采用复制模塑技术完成，如图21所示，具体包括以下步骤：
步骤一：按质量比10:1混合PDMS预聚物和交联剂，搅拌均匀，置于真空干燥器中脱气至无气泡；
步骤二：将PDMS倒在硅模板13上直至高度为6mm；所述硅模板13包含9条通道，每条通道宽40μm，高30μm，每两条通道之间的距离为80μm。
所述硅模板13由光刻制得，具体工艺参数为：硅片预烘105℃10min；O2plasma处理3min；甩光刻胶SU 8 500rpm 18s+3000rpm 60s；前烘95℃30min；测量光刻强度为10.7mW/cm2，曝光17s；后烘95℃1min；乳酸乙酯显影后坚模120℃2h；熏三甲基氯硅烷过夜。
步骤三：将浇注了PDMS的硅模板置于热板上80℃加热2h，使PDMS发生交联而固化；
步骤四：冷却后揭下PDMS，得到所述PDMS通道14。
本实施例中的芯片用于不同三维环境下人脑胶质瘤细胞U87单细胞多种分泌蛋白分析，实验流程包括以下步骤：
步骤一：在多聚赖氨酸玻片上通过通道包被上FITC-BSA和IL-8、MCP-1、TNF-a、VEGF、Rantes、MIP-1a、MIP-1b捕获抗体；
步骤二：分别将PVDF膜、pr-PDMS基底和PDMS微孔阵列穿孔膜组装起来；
步骤三：以2×105cells/ml，200μl/chip分别将U87种在两个芯片上；
步骤四：盖上步骤一获得的抗体阵列玻片，用夹具固定，置37℃培养箱培养6h；
步骤五：显微镜明场、荧光拍照；
步骤六：卸下夹具，进行后续ELISA检测，芯片扫描仪扫描。
本实施例结果见图22～图26。图22为矩形PDMS穿孔膜扫描仪扫描图；图23为矩形PDMS穿孔膜贴在pr-PDMS上的显微镜图；图24为FITC-BSA流过通道的扫描图；图25为图24虚线处的荧光强度图，从图中可以看出线上荧光强度基本一致，说明在流动模式下玻片对蛋白的固载很均匀；图26为矩形穿孔中含0个、1个、2个U87细胞的细胞图和信号图，从图中可以看出IL-8的分泌比较强，其他蛋白的分泌很少。

Claims (10)

1.一种集成细胞捕获、三维基底培养及生物分析的芯片，其特征在于该芯片包括三层结构，下层是含有微纳结构的细胞三维培养基底，中层是微孔阵列穿孔膜，上层是生物分析基底。
2.根据权利要求1所述的集成细胞捕获、三维基底培养及生物分析的芯片，其特征在于所述细胞三维培养基底材料包括但不限于硅片、PDMS、水凝胶、聚合物支架、三维聚苯乙烯支架、聚偏二氟乙烯膜、硝酸纤维素膜或各种孔径的滤纸。
3.根据权利要求1所述的集成细胞捕获、三维基底培养及生物分析的芯片，其特征在于所述微孔阵列穿孔膜由弹性材料制成，所述弹性材料包括但不限于PDMS及各种修饰后的PDMS。
4.根据权利要求3所述的集成细胞捕获、三维基底培养及生物分析的芯片，其特征在于所述微孔阵列穿孔膜含阵列分布的穿孔，穿孔形状包括正多边形、矩形或圆形，穿孔数目为1～1000000个/cm2，穿孔尺寸为1μm～1cm，穿孔膜厚度为1μm～1mm。
5.根据权利要求1所述的集成细胞捕获、三维基底培养及生物分析的芯片，其特征在于所述生物分析基底包括但不限于多聚赖氨酸玻璃、环氧树脂玻璃、或者包被了蛋白、抗体或DNA的玻片、或者包被了蛋白阵列、抗体阵列或DNA阵列的玻片。
6.根据权利要求1所述的一种集成细胞捕获、三维基底培养及生物分析的芯片的应用，其特征在于该芯片可用于多种细胞分析、多种细胞的单细胞分析、多种细胞的多重生物分子分析或多种细胞的单细胞多重生物分子分析。
7.根据权利要求6所述的一种集成细胞捕获、三维基底培养及生物分析的芯片的应用，其特征在于所述的多种细胞包括但不限于哺乳细胞、动物细胞。
8.根据权利要求1所述的一种集成细胞捕获、三维基底培养及生物分析的芯片的应用，其特征在于所述的多重生物分子分析，包括但不限于分泌蛋白、细胞因子、多肽、肽段、核酸、细胞表面蛋白、细胞表面受体、激素、抗原、生长因子或外泌体的分析。
9.根据权利要求8所述的根据权利要求1所述的一种集成细胞捕获、三维基底培养及生物分析的芯片的应用，其特征在于所述的多重生物分子分析中的多重分析包括从1到100个指标的分析。
10.根据权利要求8所述的根据权利要求1所述的一种集成细胞捕获、三维基底培养及生物分析的芯片的应用，其特征在于检测分泌蛋白的应用方法具体为：
在多聚赖氨酸玻片上包被上捕获抗体；将细胞三维培养基底和微孔阵列穿孔膜组装起来；将细胞以一定密度种在芯片上；盖上包被了捕获抗体的玻片，用夹具固定，置培养箱中培养一定时间；显微镜拍照；卸下夹具，夹心免疫法进行后续分泌蛋白的检测。
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