CN112798785A - 一种可实现细胞捕获与多指标生物分析的芯片与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种可实现细胞捕获与多指标生物分子分析的芯片与应用，属于生物微机电系统、微流控芯片、细胞分析领域。所述芯片包括上、下两层生物分析基底与中间的微孔阵列穿孔膜。其优点在于：(1)所制作的微孔阵列穿孔膜可实现细胞的捕获与培养；(2)该芯片中的微孔阵列穿孔膜与上、下层生物分析基底形成封闭微环境，使得检测生物分子富集，提高灵敏度；(3)该芯片可用于细胞多指标生物分子分析，如分泌蛋白、microRNA、外泌体等。

Description

一种可实现细胞捕获与多指标生物分析的芯片与应用
技术领域
本发明属于生物微机电系统、微流控芯片、细胞分析领域，特别涉及一种可实现细胞捕获与多指标生物分析的芯片与应用。
背景技术
分泌的蛋白质，包括细胞因子，趋化因子等，是关键的可溶性生物信号分子，由不同类型的细胞产生，以在一系列生物学和临床环境中介导细胞间的通讯。例如，先天性免疫细胞将产生一系列细胞因子，以提供第一道保护作用，抵抗细菌感染或组织损伤，从而保护人类健康。嵌合抗原受体(CAR)-T细胞的多功能分布，表征了每个细胞共同分泌的蛋白质数量，与免疫疗法临床试验中患者的客观反应密切相关。因此，在单个细胞水平上多重检测这些分泌的效应蛋白对于为免疫学，癌症等基础研究和治疗干预提供关键的深入信息非常重要。
用于活细胞单细胞因子分泌分析的最常用方法是ELISPOT(酶联免疫吸附测定)，通过计数细胞分泌可溶性蛋白的相应位置的可辨认斑点，ELISPOT可以测量单细胞细胞因子分泌的频率。但是，光谱重叠将共同检测到的蛋白质参数限制为两个。随着微流控技术的发展，出现了微型化的ELISPOT，它不仅可以产生与常规ELISPOT相当的单细胞分泌频率信息，而且还提供了新颖的功能，例如细胞间旁分泌/自分泌信号监测，动态分泌分析等。由于荧光光谱重叠，基于PDMS(聚二甲基硅氧烷)微孔的单细胞分泌分析平台的复用参数限制为四个。为了增加每个细胞要同时测定的蛋白质参数，开发了单细胞条形码微芯片技术(SCBC)，该技术利用抗体的空间固定化将多路复用能力显着扩展到十几种。尽管SCBC是一项强大的技术，但抗体条形码是平台的关键功能组件之一，它是通过流模式操作来准备的，该操作涉及繁琐，耗时的流体处理步骤以及笨重的设备，这限制了它的广泛使用。因此，本发明提出了一种简单的方法，通过将PDMS微孔阵列穿孔膜结合到生物分子分析平台中来扩展其多路复用能力，如分泌蛋白多指标分析。可以将不同的生物检测基底与PDMS微孔阵列穿孔膜组装在一起，形成封闭的微环境，用于单细胞捕获，培养和检测，无需使用复杂的液体处理或笨重的设备。
发明内容
本发明的目的是提供一种可实现细胞捕获与多指标生物分析的芯片，可高通量剖析多重单细胞细胞分泌因子，从而揭示群体细胞分泌特征中的细胞异质性，来调节人类健康和疾病。本发明所解决的技术问题采用以下技术方案来实现：
本发明提供了一种可实现细胞捕获与多指标生物分析的芯片，所述芯片包括三层结构，从上到下依次为生物分析基底a、微孔阵列穿孔膜和生物分析基底b。其中上、下层的生物分析基底可实现生物分子捕获和检测，中间层的微孔阵列穿孔膜可实现细胞捕获和生物分子富集。
进一步地，上述技术方案中，所述生物分析基底包括包被了蛋白、抗体或DNA的多聚赖氨酸/环氧树脂玻片，或者包被了蛋白阵列、抗体阵列或DNA阵列的多聚赖氨酸/环氧树脂玻片。
进一步地，上述技术方案中，所述微孔阵列穿孔膜由正方形单元阵列组成，每个正方形单元由微孔阵列组成，所述微孔的形状包括正多边形、矩形或圆形，微孔数目为1～1000000个/cm2，微孔尺寸为1μm～1cm，穿孔膜厚度为1μm～1mm，相邻两个微孔中心之间的距离为200μm，相邻两个正方形单元中心之间的距离为2850μm。
进一步地，上述技术方案中，所述的微孔阵列穿孔膜由弹性材料制成，所述弹性材料包括PDMS及各种修饰后的PDMS。
一种可实现细胞捕获的多指标生物分析芯片的制备方法，按照以下步骤进行：
采用多聚赖氨酸玻璃、环氧树脂玻璃、或者包被了蛋白、抗体或DNA的玻片、或者包被了蛋白阵列、抗体阵列或DNA阵列的玻片作为生物分析基底；
通过将PDMS预聚物以一定速度旋转到用光刻法制得的模具上来制造PDMS微孔阵列穿孔膜。硬模在使用前用三甲基氯硅烷处理过夜，以促进PDMS释放。然后将旋涂的PDMS加热固化，然后用镊子在乙醇中将其从模具中分离出来。剥离后，将其在乙醇中用超声波清洗，吹干后再使用。将PDMS微孔阵列穿孔膜与上下两层检测基底组装起来。
一种可实现细胞捕获与多指标生物分析的芯片的应用，该芯片可应用于多种细胞分析、多种细胞的单细胞分析、多种细胞的多重生物分子分析或多种细胞的单细胞多重生物分子分析。
进一步地，上述技术方案中，所述的多种细胞包括动物细胞。
进一步地，上述技术方案中，所述动物细胞包括哺乳动物细胞。
进一步地，上述技术方案中，所述的多重生物分子分析包括分泌蛋白、细胞因子、多肽、核酸、细胞表面蛋白、细胞表面受体、激素、抗原、生长因子或外泌体的分析。
进一步地，上述技术方案中，所述的多重生物分子分析中的多重分析包括从1到100个指标的分析。
一种可实现细胞捕获与多指标生物分析的芯片的应用，其检测分泌蛋白的应用方法具体为：将细胞接种在微孔阵列穿孔膜上，在微孔阵列穿孔膜的上、下分别盖上包被了捕获抗体的生物分析基底，用夹具固定，置培养箱中培养，显微镜拍照，卸下夹具，采用夹心免疫法进行分泌蛋白的检测。
进一步地，上述技术方案中，所述细胞接种数目为10000～200000个；在培养箱中培养的条件为37℃培养1-24h。
与现有技术相比，本发明优点在于：
(1)所述微孔阵列穿孔膜可与上下层检测基底结合，为细胞培养提供微环境；
(2)所述芯片可用于细胞多指标生物分子分析；
(3)所述芯片可实现单细胞捕获；
(4)所述芯片可用于单细胞多指标生物分子分析，如分泌蛋白谱分析。
附图说明
图1为本发明所述实现细胞捕获与多指标生物分析的芯片结构示意图。
图2为本发明所述芯片应用于分泌蛋白检测时的芯片示意图。
图3为本发明所述芯片应用于分泌蛋白检测时的芯片俯视图。
图4为PDMS微孔阵列穿孔膜的制备方法示意图。
图5为PDMS微孔阵列穿孔膜芯片设计图。
图6为PDMS微孔阵列穿孔膜的硅模板的制备方法示意图。
图7为PDMS微孔阵列穿孔膜扫描电镜图。
图8为PDMS微孔阵列穿孔膜截面图。
图9为FITC-BSA流过通道的扫描图。
图10为FITC-BSA流过通道的荧光强度图。
图11为大面积表征PDMS微孔阵列穿孔膜穿孔率细胞荧光图。
图12为圆形穿孔中U937单细胞分布结果图。
图13为部分圆形穿孔中U937单细胞和IL-8分泌蛋白荧光信号图。
图14为圆形穿孔中U937单细胞分泌IL-8蛋白情况结果图。
图15为上、下层中IL-8分泌频率结果图。
图16为部分圆形穿孔中U937单细胞和多重蛋白荧光信号图。
图17为圆形穿孔中U937单细胞多重分泌蛋白情况结果图。
图18为U937单细胞多重分泌蛋白聚类分析结果图。
图中，1：生物分析基底a，2：微孔阵列穿孔膜，3：生物分析基底b，4：夹具，5：圆形阵列硅模板，6：PDMS微孔阵列穿孔膜，7：硅片，8：光刻胶，9：掩膜。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步解释说明，但并不限于将发明限制在所述的实施例中。
实施例1
一种可实现细胞捕获与多指标生物分析的芯片，如图1～图3所示。该芯片包括三层结构，从上到下依次为生物分析基底a1、微孔阵列穿孔膜2和生物分析基底b3。
所述微孔阵列穿孔膜2为PDMS微孔阵列穿孔膜。
所述生物分析基底a1和生物分析基底b3为包被了IL-8捕获抗体的多聚赖氨酸玻片。
本实施例中PDMS微孔阵列穿孔膜，采用MEMS技术和复制模塑技术完成，如图4、图5所示，具体包括以下步骤：
步骤一：按质量比10:1混合PDMS(Dow Corning SYLGARD 184)A胶和B胶(PDMS交联剂)搅拌均匀，置于真空干燥器中脱气至无气泡；
步骤二：将PDMS倒在圆形阵列硅模板5上，用匀胶机进行甩胶，甩胶条件为：500rpm18s+1400rpm 60s；所述硅模板5包含14×8个正方形单元，每个正方形单元由10×10的圆柱形微柱组成，微柱直径为100μm，高度约为130μm，每两个相邻的微柱中心的距离为200μm，每两个相邻的正方形单元中心的距离为2.9mm；
所述圆形阵列硅模板5上的微米图型结构由光刻制得，具体工艺参数为：硅片7预烘105℃10min；O2 plasma仪器处理3min；甩光刻胶(SU-8)10500rpm 18s+1000rpm 60s；前烘95℃15min；二次甩光刻胶500rpm 18s+1000rpm 60s；二次前烘95℃30min；测量光刻强度为9.8mW/cm2，将掩膜9置于光刻胶上，分三次曝光(12s+12s+12s)；后烘95℃1min；乳酸乙酯显影后坚模165℃0.5h；熏三甲基氯硅烷过夜(12h)。
步骤三：将浇注了PDMS的硅模板5置于热板上80℃加热30min，使PDMS发生交联而固化；
步骤四：冷却后于乙醇中揭下PDMS，得到所述PDMS微孔阵列穿孔膜6。
本实施例中的芯片通过使用U937(人组织细胞淋巴瘤细胞，ATCC-CRL-1593.2)单细胞检测IL-8分泌蛋白情况来研究上、下层生物分析基底之间单细胞分泌结果是否存在差异，验证平台是否成功进行。如图2所示，本实施例实验流程包括以下步骤：
步骤一：分别在两块多聚赖氨酸玻片(生物分析基底a和生物分析基底b)上包被上IL-8捕获抗体；
步骤二：将PDMS微孔阵列穿孔膜放置到生物分析基底b上；
步骤三：以1×105cells/ml，400μl/chip将U937单细胞接种在PDMS微孔阵列穿孔膜上；
步骤四：盖上步骤一获得的生物分析基底a，用夹具将芯片固定，置37℃培养箱培养18h；
步骤五：显微镜明场、荧光拍照；
步骤六：卸下夹具，进行后续ELISA(酶联免疫吸附实验)检测，芯片扫描仪扫描。
本实施例结果见图7～图15。图7为PDMS微孔阵列穿孔膜扫描电镜图，从图中可以看出所成功制作出穿孔的微孔阵列穿孔膜；图8为PDMS微孔阵列穿孔膜截面图，可知穿孔膜厚度约为120μm；图9为FITC-BSA流过PDMS微孔阵列穿孔膜的扫描图；图10为FITC-BSA流过PDMS微孔阵列穿孔膜的荧光强度图，从图9和图10中可以看出孔中荧光强度基本一致，说明在流动模式下玻片对蛋白的固载很均匀；图11为大面积表征PDMS微孔阵列穿孔膜穿孔率细胞荧光图，其中无细胞微孔99个，穿孔率为99.1％；图12为U937单细胞分布结果图，单细胞捕获率为13.7％，可知捕获单细胞数目为1972个；图13为节选了部分芯片圆形微孔穿孔中U937单细胞的细胞图与信号图，细胞与信号一一对应；图14为上、下层抗体玻片检测U937分泌IL-8蛋白散点图，分泌蛋白散点图中发现由于两个抗体玻片的扩散距离的差异导致不同结合动力学所以它们的荧光强度没有很高的相关性；图15是为比较上、下层IL-8分泌频率结果，证明上、下层载体玻片之间的分泌没有显著差异，验证了本分析平台成功进行，为接下来的多指标分泌蛋白检测提供可靠依据。
实施例2
一种可实现细胞捕获与多指标生物分析的芯片，如图1～图3所示。该芯片包括三层结构，从上到下依次为生物分析基底a1、微孔阵列穿孔膜2和生物分析基底b3。
所述微孔阵列穿孔膜为PDMS微孔阵列穿孔膜。
所述生物分析基底a1和生物分析基底b3为包被了抗体阵列的多聚赖氨酸玻片。
本实施例中PDMS微孔阵列穿孔膜，如图4和图5，采用MEMS技术和复制模塑技术完成，具体步骤如实例1。
本实施例中的芯片用于U937单细胞多种分泌蛋白分析，实验流程包括以下步骤：
步骤一：在上层多聚赖氨酸玻片(生物分析基底a)上包被上IL-8、MCP-1、IL-10捕获抗体，在下层多聚赖氨酸玻片(生物分析基底b)上包被上TNF-a、IL-1b、MIP-1b捕获抗体；
步骤二：将PDMS微孔阵列穿孔膜放置于生物分析基底b上；
步骤三：以1×105cells/ml，400μl/chip分别将U937单细胞接种在PDMS微孔阵列穿孔膜上；
步骤四：盖上步骤一获得的生物分析基底a，用夹具将芯片固定，置37℃培养箱培养18h；
步骤五：显微镜明场、荧光拍照；
步骤六：卸下夹具，进行后续ELISA检测，芯片扫描仪扫描。
本实施例结果见图16～图18。图16为节选芯片一个单元的圆形穿孔中U937单细胞的细胞图和信号图，从图中可以看出单个细胞对应的监测区域(图16左侧图中虚线圆圈标记)6种分泌蛋白的信号强度均不同，说明了同种单细胞之间分泌功能存在差异性；图17为U937单细胞多重分泌蛋白散点图，圆形微孔中细胞分泌蛋白定量分析结果与原始数据扫描荧光图一致，6种分泌蛋白的信号强度均不同，其中，分泌IL-10，IL-1b分泌量位列第一，接近50％以上的单细胞都分泌这两种蛋白；分泌IL-8量居中，但是只有8％左右的单细胞分泌此蛋白；TNF-a，MCP-1和MIP-1b分泌量与分泌频率都很低。图18为U937单细胞多重分泌蛋白聚类分析结果图，从图中可得知，簇1，2，6中的细胞主要产生IL-1b，IL-8，IL-10；簇3和5的细胞是静止细胞，其蛋白分泌量很少；而簇4细胞具有更多功能，其中的细胞同时分泌IL-10，IL-1b。

Claims (9)

1.一种可实现细胞捕获与多指标生物分析的芯片，其特征在于，该芯片包括三层结构：从上到下依次为生物分析基底a(1)、微孔阵列穿孔膜(2)和生物分析基底b(3)。
2.根据权利要求1所述的可实现细胞捕获与多指标生物分析的芯片，其特征在于，所述生物分析基底包括包被了蛋白、抗体或DNA的多聚赖氨酸/环氧树脂玻片，或者包被了蛋白阵列、抗体阵列或DNA阵列的多聚赖氨酸/环氧树脂玻片。
3.根据权利要求1所述的可实现细胞捕获与多指标生物分析的芯片，其特征在于，所述微孔阵列穿孔膜(2)由正方形单元阵列组成，每个正方形单元由微孔阵列组成，所述微孔的形状包括正多边形、矩形或圆形，微孔数目为1～1000000个/cm2，微孔尺寸为1μm～1cm，穿孔膜厚度为1μm～1mm，相邻两个微孔中心之间的距离为200μm，相邻两个正方形单元中心之间的距离为2850μm。
4.根据权利要求1所述的可实现细胞捕获与多指标生物分析的芯片，其特征在于，所述微孔阵列穿孔膜(2)由弹性材料制成，所述弹性材料包括PDMS及各种修饰后的PDMS。
5.权利要求1-4中任一项所述的可实现细胞捕获与多指标生物分析的芯片的应用，其特征在于，所述芯片可应用于多种细胞分析、多种细胞的单细胞分析、多种细胞的多重生物分子分析或多种细胞的单细胞多重生物分子分析。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述多种细胞包括动物细胞。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述多重生物分子分析包括分泌蛋白、细胞因子、多肽、核酸、细胞表面蛋白、细胞表面受体、激素、抗原、生长因子或外泌体的分析。
8.根据权利要求5中的应用，其特征在于，应用方法为：将细胞接种在微孔阵列穿孔膜上，在微孔阵列穿孔膜的上、下分别盖上包被了捕获抗体的生物分析基底，用夹具固定，置培养箱中培养，显微镜拍照，卸下夹具，采用夹心免疫法进行分泌蛋白的检测。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述细胞接种数目为10000～200000个；在培养箱中培养1-24h。
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