WO2019013531A1 - 항암제 조합에 대한 단일 세포 분석 칩 - Google Patents

항암제 조합에 대한 단일 세포 분석 칩 Download PDF

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WO2019013531A1
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cancer cells
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anticancer agent
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양성
최종찬
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광주과학기술원
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Definitions

  • the present invention relates to a chip for finding an appropriate combination of anticancer agents for cancer cells. Specifically, the present invention relates to a structure of a chip for finding an appropriate combination of anticancer agents for cancer cells and a method for detecting an appropriate anticancer agent combination through a chip.
  • Microfluidics is a study to study the behavior of fluids in microchannels. It has the advantage of precisely controlling a small amount of liquid at the pico / nanoliter level, And has been attracting much attention as a next generation technology for single cell analysis.
  • the passive method can be operated with a simple system configuration, and many have been developed and used. It is a technique that can arrange the cells at a desired position by considering biological cells as particles and trapping particles of a specific size in the microchannel.
  • the analysis chip for determining an effective anticancer agent or anticancer agent combination comprises a chamber for analyzing a single cancer cell and a plurality of valves for controlling the fluid to be injected into the chamber, A cell sorting unit for focusing the cancer cells flowing along the channel, a cell trapping unit for capturing the cancer cells focused by the cell sorting unit, And an antibody array capturing 10 kinds of proteins.
  • the single cell analysis chip according to an embodiment of the present invention can provide a high efficiency single cell capture structure.
  • the single cell analysis chip according to an embodiment of the present invention is capable of cell lysis at a higher rate than the conventional method.
  • the single cell analysis chip can measure multiple secreted proteins or intracellular signal transduction proteins from a single cell through a high density antibody array. Chip can be used to verify efficiency of various drugs at once.
  • FIG. 1 shows an optimal anticancer drug combination detection system for a single cell according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 shows a structure of a chamber constituting the single cell analysis chip described above.
  • Figure 4 shows the capture rate according to the number of captured cells. As shown in FIG. 4, a high level of capture rate can be secured through the above-described cell sorting unit.
  • Figure 5 shows the specific shape of the antibody array.
  • FIG. 7 shows the result of fluorescence signal measurement performed along the channel before and after cell lysis.
  • FIG. 8 is a flowchart illustrating a method of analyzing a combination of anticancer drugs according to an embodiment of the present invention, using a single cell analysis chip.
  • FIG. 1 shows an optimal anticancer drug combination detection system for a single cell according to an embodiment of the present invention.
  • the single cell analysis chip 10 comprises a plurality of chambers for single cell analysis.
  • the single cell analysis chip 10 may comprise a plurality of channels depending on the number of anticancer drugs to be combined, and the channel is composed of a plurality of chambers.
  • a single cell injection part ii) a detection antibody and a fluorescent probe injection port, and iii washing buffer are injected.
  • iv is an outlet (outlet) for the 3 solution.
  • v is the inlet of the cell lysis buffer and vi is the outlet of the cell lysis buffer. vi can also be used as an injector when injecting multiple anticancer drugs, where v serves as the exit to the common outlet of the anticancer drug.
  • the anticancer drug injected through vi may be a single anticancer drug or a combination product of anticancer drugs combined with different anticancer drugs.
  • FIG. 2 shows a structure of a chamber constituting the single cell analysis chip described above.
  • a single chamber A includes a fluid channel 100, a cell trapping unit 200, an antibody array 300, a cell sorting unit 400, a mixing pump 500, a first valve (600), a second valve (700), and a third valve (800).
  • the fluid channel 100 is a channel through which a cell infusion solution containing cancer cells, an injection solution for assay, an anticancer drug or a cell lysis buffer passes.
  • the fluid channel 100 includes a first channel (a) through which a cell injection solution or an assay solution flows, and a second channel through which a cell lysis buffer flows (b, the anticancer drug flows in the same channel but flows in the opposite direction to the cell lysis buffer) do.
  • the first channel may be divided into an upper channel and a lower channel.
  • the left channel is referred to as an upper channel and the right channel is referred to as a lower channel.
  • the fluid channel 100 may be connected to the anticancer drug combination generator 20 or may be connected to a cell lysis buffer supply device. Typically, anticancer drugs flow from the upper channel to the lower channel.
  • the cell capturing part 200 is a part where a single cancer cell is captured.
  • the cell trapping portion 200 is provided upstream of the upper channel based on the fluid flow. Cancer cells moving along the channel are captured in the cell trapping section 200, and the captured cancer cells can be stained for identification.
  • An antibody array 300 is provided in the upper channel in the form of a bar code.
  • the antibody array 300 may comprise an array of a plurality of different antibodies.
  • the antibody array 300 may comprise one reference array and an array of cells for cell analysis. At this time, the fluorescence signal colors of the reference array and the cell analysis array are set differently so that they can be identified. Refer to the prior patent document 2 for preparation of the antibody array 300.
  • the cell sorting unit 400 is provided in the lower channel.
  • the cell sorting unit 400 may include a plurality of alignment elements.
  • the alignment element may have a circular shape, and a detailed description of the arrangement of the alignment elements and the specific role of the alignment element will be given below, and a detailed description thereof will be omitted.
  • the mixing pump 500 is provided in the upper channel.
  • the mixing pump 500 may be composed of three pumps and is provided in a shape that can press the upper channel.
  • the three pumps can be operated separately, but with cycles, to efficiently mix different fluids.
  • the specific operation of the mixing pump will be further described below, and a detailed description thereof will be omitted.
  • the first valve 600, the second valve 700 and the third valve 800 regulate the flow of fluid and isolate the chamber for protein detection on a single cell. Specifically, the first valve 600 and the third valve 800 close the upper and lower channels with reference to FIG. 2 to isolate the chamber. Single cancer cells are captured in each chamber, and proteins generated in each cancer cell must be detected, so it is necessary to isolate the chambers.
  • the second valve is a valve for controlling the inflow of the cell lysis buffer.
  • a cell lysis buffer is introduced into the chamber through the channel at the top, and a second valve controls the entry of the cell lysis buffer at the top of the upper channel and the lower channel. When the second valve is opened, the cell lysis buffer enters the chamber.
  • first flow (c) is a flow for moving the first particle (e) captured by the cell trapping portion and the second flow (d) is a flow for moving the second particle (f) Flow.
  • the flow of particles is induced inside the channel by the cell aligning part 400.
  • the first particle (e) when the first particle (e) is injected along the first flow (c) when it is first injected, it is captured in the cell trapping section 200 in preference to the second particle (f).
  • the second particles f are introduced into the channel by the cell sorting unit 200, they are injected according to the second flow (d) when they are first injected, and the capture priority is lower than that of the first particles.
  • the second particle (f) moves according to the first flow for the next cell trapping portion, it is captured with a high probability in the next cell trapping portion.
  • Figs. 3 (b) to 3 (c) illustrate a specific design of the cell sorting portion for inducing particle motion described in Fig. 3 (a).
  • the cell sorting unit 400 includes a plurality of alignment elements 410. And in a preferred embodiment the alignment element 410 has a circular shape. At this time, the alignment elements are aligned with a diagonal line at regular intervals. An alignment element formed in a diagonal line in the inner direction of the channel serves to guide the flow of particles (e.g., cancer cells) into the channel.
  • particles e.g., cancer cells
  • the wider the spacing between the alignment elements the less space the particles are directed into the channel, and the alignment element may not be able to exhibit its function. Therefore, it is important to determine an appropriate distance between the alignment elements.
  • Figure 3 (b) shows fluid flow when a plurality of alignment elements are provided in the channel.
  • the fluid width ⁇ , critical streamline
  • the relationship between the alignment elements 410 must be determined in order for the particles to be focused (which means movement along the flow (first flow) that is induced in the channel and captured in the cell trapping portion).
  • the relationship between the alignment devices 410 should be designed so that the Dc value is smaller than the cancer cells desired to be focused.
  • Dc is approximated to twice the fluid width from the circular element, and a specific Dc value can be obtained through Equation (1).
  • G is? -D, and? And D are defined in Fig. 3 (c).
  • N is lambda / DELTA lambda.
  • the spacing between the alignment elements should be greater than the largest cancer cell size, and the Dc value should be less than the smallest cancer cell size.
  • Figure 4 shows the design and thus the capture rate of cell trapping for single cell capture.
  • Fig. 4 (a) shows a specific shape of the cell capturing part 200.
  • the cell capturing unit 200 is configured to automatically capture cells that are aligned and flow through the cell sorting unit 400.
  • the cell trapping unit has a structure for connecting the upper channel and the lower channel, thereby generating a first flow through the cell trapping part and a second flow bypassing the cell trapping part in the fluid channel.
  • the first flow has the same size as a single cell size. Therefore, it is important to determine the flow rate of the first flow and the flow rate of the second flow for this purpose.
  • Equation (2) the hydraulic pressure drop between point A and point B is expressed by Equation (2).
  • w is the width of the channel
  • h is the height of the channel
  • L is the length of the channel
  • g is the fluid viscosity
  • the hydraulic descent value from point A to point B can be regarded as the same in the first and second flows, and the equation is as shown in equation (4).
  • Equation (4) can be summarized as Equation (5).
  • the flow rate ratio of the first flow and the second flow must be adjusted so as to correspond to a single cell size, and the flow rate ratio of the first flow and the second flow is determined by the width, Or by controlling the viscosity
  • Figure (b) shows the capture rate according to the number of captured cells. As shown in FIG. 4 (b), a high level of capture rate can be ensured through the above-described cell sorting unit.
  • Figure 5 shows the specific shape of the antibody array and the final assay.
  • the antibody array 300 can be composed of a reference array and a capture array.
  • reference arrays can use any probe that can emit a fluorescent signal regardless of the protein that cancer cells emit. However, it is different from the fluorescence color of the capture array for measuring the cancer cell protein so that the signal can be distinguished.
  • the capture array may be an array having a plurality of different antibodies.
  • the capture array can be composed of ten, consisting of three arrays in which cancer cells detect proteins before they are dissolved by the cell lysis buffer, and seven arrays that detect proteins after they are dissolved.
  • FIG. 5 (b) shows the final assay in which the shape marker is attached to the captured protein for analysis via the analyzer.
  • the antibody 310 is attached first. Then, the protein 320 released through the anticancer agent or cell lysis buffer treatment binds to the attached antibody. And a fluorescent marker 330 is attached to the protein to analyze the captured protein.
  • biotinylated detection antibody is injected to detect 10 kinds of proteins when all the proteins are bound through the capture array, and fluorescence signals are obtained by injecting streptavidin-Cy5 (fluorescent chromosome) A final assay can be formed.
  • An effective combination of anticancer agents can be selected for the patient based on the protein captured in the antibody array 300 and the fluorescence signal obtained finally.
  • the types of proteins that are released when an anticancer agent is effective for a specific cancer cell are known in the prior art, and the protein that is captured in the antibody array 300 can be analyzed to determine an effective anticancer agent combination for the patient.
  • the mixing pump 600 is provided to press the upper channel.
  • the fluid cell lysis buffer or washing liquid
  • the fluid is first injected into the upper channel by the operation of the mixing pump 600, as shown in FIG. 6 (a).
  • the fluid is circulated and mixed in the order shown in Fig. 6 (a) through the continuous operation of the mixing pump 600.
  • FIG. 6 (b) shows an example of the operation of a mixing pump composed of three pumps.
  • the mixing pump 600 operates as shown in Figure 6 (b) to circulate and mix the fluid.
  • FIG. 7 shows the result of fluorescence signal measurement performed along the channel before and after cell lysis. As shown in FIG. 7, it can be seen that the cell lysate spreads evenly over time.
  • FIG. 8 is a flowchart illustrating a method of analyzing a combination of anticancer drugs according to an embodiment of the present invention, using a single cell analysis chip.
  • Cancer cells are injected into the channel of the analysis chip (S1001).
  • the cancer cells to be injected may be cancer cells of cancer patients who want to know an effective combination of anticancer drugs.
  • the injected cancer cells are captured in the cell trapping portion in the course of flowing through the channel (S1003).
  • the cancer cells pass through the plurality of chambers and are focused by the cell sorting part contained in the chamber. Focused cancer cells are captured in a cell trap in the form of a single cell. At this time, the captured cancer cells can be stained for identification.
  • An anticancer drug mixed in different combinations is injected into a plurality of channels of the analysis chip (S1005). Anticancer drugs mixed in different combinations are injected through different channels.
  • the chamber is a test unit for judging the appropriate anticancer agent for each single cancer cell, in order to prevent a mixture of proteins released from different cancer cells from causing errors in the test results.
  • the proteins released from the cancer cells captured by the anticancer agent are captured (S1009).
  • cancer cells can release a specific protein, and the released protein can be a standard for determining the suitability of an anticancer drug.
  • Proteins released from cancer cells are captured in an antibody array.
  • the first valve When capture of the protein released before cell lysis is completed, the first valve is opened, the second valve is closed, and a cell lysis buffer is prepared (S1011).
  • the second valve is a valve that can close the upper channel and the lower channel in the chamber at one time. At this time, the third valve remains closed. And the reagent 1 can be opened to open the chamber and be ready to be loaded with a lysis buffer.
  • the first valve is closed again to isolate the chamber (S1013).
  • the chambers are isolated so that proteins released from the cancer cells captured for each chamber do not mix with each other.
  • the second valve is opened to inject the cell lysis buffer into the chamber (S1015).
  • Cell lysis buffer acts on cancer cells to destroy cancer cells and dissolve cancer cells.
  • the cell lysis buffer can be rapidly diffused through the mixing pump.
  • Proteins released from the cancer cells destroyed by the cell lysis buffer are captured (S1017). Similar to step S1009, the released protein is captured by the antibody array.
  • proteins released by cancer cells exposed to an effective anticancer drug are known in the prior art, and the captured protein may be another standard for judging an effective anticancer drug.
  • a fluorescent marker for acquiring a fluorescence signal is attached to the captured protein (S1019).
  • a fluorescent marker for example, a biotinylated detection antibody and streptavidin-Cy5 for obtaining a fluorescent signal is injected, and the injected fluorescent marker binds with the captured protein to form a final assay.
  • An analysis chip including a plurality of antibody arrays in which the final assay is formed is inserted into the analyzer to determine the most effective anticancer drug combination (S1021).
  • S1021 the most effective anticancer drug combination
  • the fluorescence signal can be measured through a fluorescent marker attached to the protein captured in the antibody array.
  • Measured fluorescence signals can represent captured proteins, and multiple immunoassays based on these fluorescence signals enable single-cell-based multi-protein measurement and signal acquisition.
  • the present invention described above can be embodied as computer-readable codes on a medium on which a program is recorded.
  • the computer readable medium includes all kinds of recording devices in which data that can be read by a computer system is stored. Examples of the computer readable medium include a hard disk drive (HDD), a solid state disk (SSD), a silicon disk drive (SDD), a ROM, a RAM, a CD-ROM, a magnetic tape, a floppy disk, . Accordingly, the above description should not be construed in a limiting sense in all respects and should be considered illustrative. The scope of the present invention should be determined by rational interpretation of the appended claims, and all changes within the scope of equivalents of the present invention are included in the scope of the present invention.

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Abstract

본 발명에 따른 암세포에 효율적인 항암제 또는 항암제 조합을 결정하기 위한 분석 칩은 단일 암세포를 분석하기 위한 일 단위인 챔버, 상기 챔버에 주입되는 유체를 조절하기 위한 복수의 밸브를 포함하며, 상기 챔버는, 항암제 및 세포용해 버퍼를 포함하는 유체가 흐르는 채널, 상기 채널을 따라 흐르는 암세포를 포커싱하기 위한 세포 정렬부, 상기 세포 정렬부에 따라 포커싱된 암세포를 포획하는 세포 포획부 및 포획된 암세포로부터 분비 되는 단백질과 세포 용해를 통해 세포 내부 단백질을 캡쳐하는 항체 어레이를 포함한다.

Description

항암제 조합에 대한 단일 세포 분석 칩
본 발명은 암세포에 적절한 항암제 조합을 찾기 위한 칩에 관한 것이다. 구체적으로 본 발명은 암세포에 적절한 항암제 조합을 찾기 위한 칩의 구조 및 칩을 통한 적절한 항암제 조합 검출 방법에 관한 것이다.
최근 동형 세포 집단 내에서도 개별적 세포들 간의 이질성이 존재함이 드러나고, 다양한 질병의 근원이라는 주장이 거론되기 시작하면서, 기존의 집단 측정 대신 단일 세포 수준에서의 분석 필요성이 대두하기 시작하였다.
미세 유체 공학은 미세 채널 내 유체의 거동을 연구하는 학문으로, 피코/나노 리터 수준의 소량의 액체를 정밀하게 제어할 수 있다는 장점을 앞세워 단일 수준에서 세포의 분리 및 배열 기술을 효과적으로 미세 유체 칩 상에 구현함으로써 단일 세포 분석을 위한 차세대 기술로 많은 각광을 받고 있다.
이러한 기술들은, 그 작동 메커니즘에 따라 동유체력을 이용하는 수동적 방식과 전기학, 광학적 힘을 근간으로 하는 능동적 방식으로 나뉜다. 이들 중, 수동적 방식은 간단한 시스템 구성으로 작동이 가능하여 많이 개발되어 사용되고 있다. 생물학적 세포를 입자로 고려하고 미세 채널 내 특정한 크기의 입자를 포획할 수 잇는 덫을 제작함으로써 원하는 위치에 세포를 배열할 수 있는 기술이다.
종래의 암세포 포획 장치는 암세포를 단일 세포로 포획하는 효율이 상대적으로 낮았다. 구체적으로 종래 기술은 암세포 내부 단백질 추출을 위해 세포용해시약(lysis buffer)를 확산을 통해 세포 용해를 수행하였다. 이 경우, 시간이 오래 걸리면 세포로부터 떨어진 거리에 따라 편차가 발생하는 문제가 있었다.
단일 세포 수준에서 항암제 종류 및 조합에 대한 다중 단백질 측정 및 이를 이용한 환자 맞춤형 약물 스크리닝 플랫폼을 제공한다.
본 발명에 따른 암세포에 효율적인 항암제 또는 항암제 조합을 결정하기 위한 분석 칩은 단일 암세포를 분석하기 위한 일 단위인 챔버, 상기 챔버에 주입되는 유체를 조절하기 위한 복수의 밸브를 포함하며, 상기 챔버는, 항암제 및 세포용해 버퍼를 포함하는 유체가 흐르는 채널, 상기 채널을 따라 흐르는 암세포를 포커싱하기 위한 세포 정렬부, 상기 세포 정렬부에 따라 포커싱된 암세포를 포획하는 세포 포획부 및 포획된된 암세포로부터 방출되는 10종류의 단백질을 캡쳐하는 항체 어레이를 포함한다.
본 발명의 일 실시 예에 따른 단일 세포 분석 칩은 고효율의 단일 세포 포획 구조를 제공할 수 있다.
본 발명의 일 실시 예에 따른 단일 세포 분석 칩은 기존에 방법에 비해 빠른 속도로 세포 용해가 가능하다.
본 발명의 일 실시 예에 따른 단일 세포 분석 칩은 고밀도 항체 어레이를 통해 단일 세포에서 분비되는 단백질이나 세포 내부 신호 전달 단백질을 다중으로 측정 가능하다.또한, 본 발명의 일 실시 예에 따른 단일 세포 분석 칩은 다양한 약물에 대하여 일시에 효율성 검증을 할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시 예에 따른 단일 세포에 대한 최적의 항암제 조합 검출 시스템을 나타낸다.
도 2는 상술한 단일 세포 분석 칩을 구성하는 챔버의 구조를 나타낸다.
도 3은 세포 정렬부의 구체적인 형상을 나타낸다.
도 4는 포획된 세포의 수에 따른 포획률을 보여주는 결과이다. 도 4에 나타난 바와 같이, 상술한 세포 정렬부를 통해 높은 수준의 포획률을 확보할 수 있다.
도 5는 항체 어레이의 구체적인 형상을 나타낸다.
도 6은 믹싱 펌프의 동작을 나타낸다.
도 7은 세포 용해 전/후 채널을 따라 분석한 형광 신호 측정 결과를 나타낸다.
도 8은 본 발명의 일 실시 예에 따른 항암제 조합에 대한 단일 세포 분석 칩을 통한 분석 방법을 나타내는 흐름도이다.
이하에서는 도면을 참조하여 본 발명의 구체적인 실시예를 상세하게 설명한다. 그러나 본 발명의 사상은 이하의 실시예에 제한되지 아니하며, 본 발명의 사상을 이해하는 당업자는 동일한 사상의 범위 내에 포함되는 다른 실시예를 구성요소의 부가, 변경, 삭제, 및 추가 등에 의해서 용이하게 제안할 수 있을 것이나, 이 또한 본 발명 사상의 범위 내에 포함된다고 할 것이다.
첨부 도면은 발명의 사상을 이해하기 쉽게 표현하기 위하여 전체적인 구조를 설명함에 있어서는 미소한 부분은 구체적으로 표현하지 않을 수도 있고, 미소한 부분을 설명함에 있어서는 전체적인 구조는 구체적으로 반영되지 않을 수도 있다. 또한, 설치 위치 등 구체적인 부분이 다르더라도 그 작용이 동일한 경우에는 동일한 명칭을 부여함으로써, 이해의 편의를 높일 수 있도록 한다. 또한, 동일한 구성이 복수 개가 있을 때에는 어느 하나의 구성에 대해서만 설명하고 다른 구성에 대해서는 동일한 설명이 적용되는 것으로 하고 그 설명을 생략한다.
도 1은 본 발명의 일 실시 예에 따른 단일 세포에 대한 최적의 항암제 조합 검출 시스템을 나타낸다.
단일 세포 분석 칩(10)은 단일 세포 분석을 위한 복수의 챔버로 구성된다. 단일 세포 분석 칩(10)은 조합되는 항암제의 수에 따른 복수의 채널을 포함할 수 있으며, 채널은 복수의 챔버로 구성된다.
단일 세포 분석칩 (10)의 i는 단일 세포 주입부, ii는 detection antibody 및 형광 probe 주입구, iii washing buffer가 주입된다. iv는 상기 3 용액에 대한 아웃렛 (출구부) 이다. v는 세포 용해 버퍼의 주입구이며, vi는 세포 용해 버퍼의 출구부이다. vi는 또한 복수의 항암제를 주사할 때 주입부로도 사용가능하며 이 때에는 v가 항암제의 공통 출구부로 배출부 역할을 한다. 이때, vi를 통해 주입되는 항암제는 단일의 항암제 또는 서로 다른 항암제가 조합된 항암제 조합 생성물일 수 있다.
도 2는 상술한 단일 세포 분석 칩을 구성하는 챔버의 구조를 나타낸다.
도 2에 도시된 바와 같이, 단일의 챔버(A)는 유체 채널(100), 세포 포획부(200), 항체 어레이(300), 세포 정렬부(400), 믹싱 펌프(500), 제1 밸브(600), 제2 밸브(700) 및 제3 밸브(800)를 포함한다.
유체 채널(100)은 암세포를 포함하는 세포 주입액, assay용 주입액, 항암제 또는 세포용해 버퍼가 통과하는 채널이다. 유체 채널(100)은 세포 주입액 또는 assay 주입액이 흐르는 제1 채널(a) 및 세포용해 버퍼가 흐르는 제2 채널(b, 항암제는 같은 채널을 흐르나 세포용해 버퍼와 반대 방향으로 흐름)을 포함한다.
단일 챔버에서 제1 채널은 상위 채널 및 하위 채널로 구분될 수 있다. 여기에서, 도 2에 도시된 제1 채널(a) 중, 좌측의 채널을 상위 채널, 우측의 채널을 하위 채널로 지칭한다. 유체 채널(100)은 항암제 조합 생성 장치(20)와 연결되거나, 세포용해 버퍼 공급 장치와 연결될 수 있다. 통상적으로 항암제는 상위 채널에서 하위 채널 방향으로 흐른다.
세포 포획부(200)는 단일 암세포가 포획되는 부분이다. 세포 포획부는(200)는 유체 흐름을 기준으로 상위 채널의 상류에 제공된다. 채널을 따라 이동하는 암세포는 세포 포획부(200)에 포획되며, 포획된 암세포는 식별을 위해 염색될 수 있다.
항체 어레이(antibody array; 300)은 바코드 형상으로 상위 채널에 마련된다. 항체 어레이(300)는 복수의 서로 다른 항체가 마련된 어레이를 포함할 수 있다. 일 실시 예에서 항체 어레이(300)는 레퍼런스 어레이 한 개와, 세포 분석을 위한 어레이 열개를 포함할 수 있다. 이 때 레퍼런스 어레이와 세포 분석용 어레이의 형광 신호 색은 다르게 설정하여 식별할 수 있게 만든다. 항체 어레이(300)의 제조는 선행특허문헌 2를 참조한다.
세포 정렬부(400)는 하위 채널에 마련된다. 세포 정렬부(400)는 복수의 정렬 소자를 포함할 수 있다. 바람직한 실시 예에서 정렬 소자는 원형의 형상을 가질 수 있으며, 정렬 소자의 배치 및 정렬 소자의 구체적인 역할에 대한 설명은 이하에서 추가로 하도록 하며 여기에서는 구체적인 설명을 생략한다.
믹싱 펌프(500)는 상위 채널에 마련된다. 일 실시 예에서 믹싱 펌프(500)는 세 개의 펌프로 구성될 수 있으며, 상위 채널을 압박할 수 있는 형상으로 마련된다. 세 개의 펌프를 개별적인 동작으로, 그러나 주기를 갖게 동작시켜 이종의 유체를 효율적으로 혼합 할 수 있다. 믹싱 펌프의 구체적인 동작에 대한 설명은 이하에서 추가로 하도록 하며 여기에서는 구체적인 설명을 생략한다.
제1 밸브(600), 제2 밸브(700) 및 제3 밸브(800)는 유체의 흐름을 조절하고, 단일 세포에 대한 단백질 검출을 위해 챔버를 고립시키는 역할을 수행한다. 구체적으로 제1 밸브(600)와 제3 밸브(800)는 도 2를 기준으로 상하에서 채널을 닫아 챔버를 고립시킨다. 각 챔버마다 단일 암 세포가 포획되며, 각 암세포마다 발생되는 단백질을 검출해야 하는바, 챔버를 고립시키는 것이 필요하다.
제2 밸브는 세포용해 버퍼의 유입을 제어하기 위한 밸브이다. 도 2를 기준으로 상단의 채널을 통해 챔버로 세포용해 버퍼가 투입되는데, 제2 밸브가 상위 채널 및 하위 채널의 상단에서 세포용해 버퍼의 유입을 제어한다. 제2 밸브가 열리는 경우 세포용해 버퍼가 챔버로 유입된다.
여기까지, 단일 세포 분석 칩(10)을 구성하는 챔버(A)의 구성에 대하여 설명하였으며, 이하에서는 챔버 각 구성의 구체적인 형상 및 그에 따른 기능에 대하여 설명한다.
먼저 도 3 내지 도 4에서 세포 포획부(200) 및 세포 정렬부(400) 를 설명한다.
도 3은 세포 정렬부의 구체적인 형상을 나타낸다.
도 3(a)는 세포 정렬부를 통한 유체의 흐름 및 유체의 흐름에 따른 입자의 움직임을 나타낸다.
도 3(a)에 도시된 바와 같이, 앞서 설명한 제1 채널에는 제1 흐름(c) 및 제2 흐름(d)이 존재한다. 여기에서 제1 흐름(c)은 세포 포획부에 의해 포획되는 제1 입자(e)를 움직이는 흐름이고, 제2 흐름(d)은 세포 포획부에 의해 포획되지 못하는 제2 입자(f)를 움직이는 흐름이다.
도 3(a)에 도시된 바와 같이, 제1 입자(e) 및 제2 입자(f)가 채널로 주입되면, 세포 정렬부(400)에 의해 채널의 안쪽으로 입자의 흐름이 유도된다. 그러나, 제1 입자(e)의 경우 최초 주입될 때 제1 흐름(c)을 따라 주입된바, 제2 입자(f)에 우선하여 세포 포획부(200)에 포획된다. 제2 입자(f)는 세포 정렬부(200)에 의해 채널 안쪽으로 유도되기는 하나, 최초 주입될 때 제2 흐름(d)에 따라 주입되어 제1 입자에 비해 포획 우선도가 떨어질 수 밖에 없다. 그러나, 제2 입자(f)는 다음 세포 포획부에 대한 제1 흐름에 따라 움직이는 바, 다음 세포 포획부에 높은 확률로 포획된다.
도 3(b) 내지 (c)는 도 3(a)에서 설명한 입자 움직임 유도를 위한 세포 정렬부의 구체적인 설계를 설명한다.
도 3(b)에 도시된 바와 같이, 세포 정렬부(400)는 복수의 정렬 소자(410)을 포함한다. 그리고 바람직한 실시 예에서 정렬 소자(410)는 원형의 형상을 갖는다. 이때 정렬 소자는 일정한 간격을 가지고 사선으로 정렬된다. 채널 안쪽 방향의 사선으로 형성되는 정렬 소자는 입자(a, 예를 들어 암세포)의 흐름을 채널 안쪽으로 유도하는 역할을 한다.
이때, 정렬 소자간의 적절한 거리에 대하여 이하에서 설명한다.
정렬 소자간의 간격이 넓을수록 입자의 흐름이 용이할 수 있으나, 정렬 소자간의 간격이 넓다고 무조건 좋은 것은 아니다. 정렬 소자간의 간격이 넓을수록 입자가 채널 안쪽으로 유도될 여지가 줄어들어 정렬 소자의 제 기능을 발휘하지 못할 수가 있다. 따라서, 정렬 소자간의 적절한 거리를 결정하는 것이 중요하다.
도 3(b)는 채널에 복수의 정렬 소자들이 마련되는 경우, 유체 흐름을 나타낸다. 이때, 유체가 정렬 소자에 의해 두 부분으로 나뉠 때 원형 소자로부터 유체 너비(β, critical streamline)가 정의된다. 이때, 입자가 포커싱(채널 안쪽으로 유도되어 세포 포획부에 포획되기 좋은 흐름(제1 흐름)을 따라 움직임을 뜻함)되기 위해 정렬 소자들(410) 간의 관계를 정해야 한다. 구체적으로 포커싱을 원하는 암세포보다 Dc 값이 작도록 정렬 소자(410)간의 관계를 설계해야 한다. 일반적으로 Dc를 원형 소자로부터의 유체 너비의 2배로 근사하는데, 구체적인 Dc 값은 수학식 1을 통해 획득할 수 있다.
Figure PCTKR2018007819-appb-M000001
여기에서 G는 λ-D이며, λ 및 D는 도 3(c)에 정의되어 있다. 그리고 N은 λ/Δ λ이다.
결과적으로, 정렬 소자간의 간격은 가장 큰 암세포의 크기보다 커야 하며, Dc 값은 가장 작은 암세포의 크기보다 작아야 한다.
도 4는 단일 세포 포획을 위한 세포 포획부의 설계 및 그에 따른 포획률을 나타낸다.
도 4 (a)는세포 포획부(200)의 구체적인 형상을 나타낸다. 세포 포획부(200)는 상기 세포 정렬부(400)를 통해 정렬되어 흐르는 세포를 자동으로 포획되도록 구성된다. 이를 위해 세포 포획부는 상위 채널과 하위 채널을 연결하는 구조로 되어 있으며, 이를 통해 유체 채널에는 세포 포획부를 통한 제1 흐름과 세포 포획부를 우회하는 제2 흐름이 생성된다.
이때 단일 세포를 효율적으로 포획하기 위해서, 제1 흐름이 단일 세포 크기와 같은 크기를 갖는 것이 필요하다. 따라서 이를 위해 제1 흐름의 유량과 제2 흐름의 유량 비를 결정하는 것이 중요하다.
도 4(a)에 도시된 바와 같이 A 점과 B 점이 있으며, 제1 흐름의 유량(Qt)와 제2 흐름의 유량(Qb)가 정의된다. 그리고 A 점과 B 점간의 유압 강하는 수학식 2와 같이 표현된다.
Figure PCTKR2018007819-appb-M000002
여기에서 R은 유체 저항이며 수학식 3과 같이 표현된다.
Figure PCTKR2018007819-appb-M000003
여기에서, w는 채널의 너비, h는 채널의 높이, L은 채널의 길이, 그리고 ㅅ는 유체 점도를 나타낸다.
이때, A 점에서 B 점으로의 유압 강하 값은 제1 흐름 및 제2 흐름에서 동일한 것으로 볼 수 있으며, 수학식 4과 같은 식이 성립한다.
Figure PCTKR2018007819-appb-M000004
그리고, 수학식 4를 수학식 5와 같이 정리할 수 있다.
Figure PCTKR2018007819-appb-M000005
결과적으로, 단일 세포를 세포 포획부가 잘 포획하기 위해서는 단일 세포 크기에 대응하도록 제1 흐름과 제2 흐름의 유량비를 조절해야 하며, 제1 흐름과 제2 흐름의 유량비는 채널의 너비, 길이, 높이 또는 점도의 조절을 통한
그림 (b)는 포획된 세포의 수에 따른 포획률을 보여주는 결과이다. 도 4(b)에 나타난 바와 같이, 상술한 세포 정렬부를 통해 높은 수준의 포획률을 확보할 수 있다.
도 5는 항체 어레이의 구체적인 형상 및 최종 assay를 나타낸다.
도 5(a)에 도시된 바와 같이, 항체 어레이(300)는 레퍼런스 어레이 및 캡쳐 어레이로 구성될 수 있다. 여기에서 레퍼런스 어레이는 암세포가 방출하는 단백질과 무관하게 형광 신호가 나올 수 있는 어떠한 probe를 사용해도 된다. 다만 암세포 단백질을 측정하기 위한 캡쳐 어레이와의 형광 색과는 달라야 신호 구분이 가능하다..
캡쳐 어레이는 복수의 서로 다른 항체가 마련된 어레이일 수 있다. 바람직한 실시 예에서, 캡쳐 어레이는 10개로 구성될 수 있으며, 암세포가 세포용해 버퍼에 의해 용해되기 전 단백질을 검출하는 어레이 3개와 용해된 후 단백질을 검출하는 어레이 7개로 구성될 수 있다.
도 5(b)는 분석기를 통한 분석을 위해 캡쳐된 단백질에 형상 표지자를 붙인 최종 assay를 나타낸다.
캡쳐 어레이에는 가장 먼저 항체(310)이 부착되어 있다. 그리고, 항암체 또는 세포용해 버퍼 처리를 통해 방출되는 단백질(320)이 부착되어 있던 항체와 결합한다. 그리고 캡쳐된 단백질을 분석하기 위해 형광 표지자(330)이 단백질에 부착된다.
구체적인 실시 예에서, 캡쳐 어레이를 통해 단백질이 모두 결합되면 10 종류 단백질을 검출하기 위한 biotinylated detection antibody를 주입하고, 형광 신호를 획득하기 위하여 streptavidin-Cy5(형광염색체)를 주입하여 형광 신호를 획득하기 위한 최종 assay를 형성 할 수 있다.
항체 어레이(300)에 캡쳐된 단백질 및 최종 획득하는 형광 신호에 기초하여 환자에게 효율적인 항암제 조합을 선택할 수 있다. 특정 암세포에 항암제가 효과가 있을 때 방출되는 단백질의 종류는 앞선 연구에서 알려진 것으로, 이를 통해 항체 어레이(300)에 캡쳐된 단백질을 분석하여 환자에게 효율적인 항암제 조합을 결정할 수 있다.
도 6은 믹싱 펌프의 동작을 나타낸다.
도 6에 도시된 바와 같이, 믹싱 펌프(600)는 상위 채널을 압박하는 형태로 마련된다. 그리고 유체(세포용해 버퍼 또는 워싱액)가 채널로 주입되는 경우, 도 6(a)에 도시된 바와 같이, 믹싱 펌프(600)의 동작으로 상위 채널에 먼저 유체가 주입된다. 그리고 믹싱 펌프(600)의 지속적인 동작을 통해 도 6(a)에 도시된 순서로 유체가 순환 및 혼합된다.
도 6(b)는 세 개의 펌프로 구성된 믹싱 펌프의 동작 일 예를 나타낸다. 본 발명의 일 실시 예에서 믹싱 펌프(600)는 도 6(b)에 도시된 바와 같이 동작하여 유체를 순환 및 혼합시킬 수 있다.
도 7은 세포 용해 전/후 채널을 따라 분석한 형광 신호 측정 결과를 나타낸다. 도 7의 결과처럼 시간이 지나면서 세포 용해 물질이 고르게 퍼짐을 확인할 수 있다.
도 8은 본 발명의 일 실시 예에 따른 항암제 조합에 대한 단일 세포 분석 칩을 통한 분석 방법을 나타내는 흐름도이다.
분석 칩의 채널로 암세포가 주입된다(S1001). 이때, 주입되는 암세포는 효율적인 항암제 조합을 알고자 하는 암환자의 암세포일 수 있다.
주입된 암세포가 채널을 통해 흐르는 과정에서 세포 포획부에 포획된다(S1003). 암세포는 복수의 챔버를 통과하고, 챔버에 포함된 세포 정렬부에 의해 포커싱된다. 포커싱된 암세포는 단일 세포의 형태로 셀 트레퍼에 포획된다. 이때, 포획된 암세포는 식별을 위해 염색될 수 있다.
분석 칩의 복수의 채널로 서로 다른 조합으로 혼합된 항암제가 주입된다(S1005). 서로 다른 조합으로 혼합된 항암제는 각각 서로 다른 채널을 통해 주입된다.
각 약물이 채널에 완전히 주입되며, 제1 밸브 및 제3 밸브가 닫히면서 챔버가 고립된다(S1007). 상술한 바와 같이 챔버는 단일 암세포마다 적절한 항암제를 판단하기 위한 일 테스트 단위로서, 서로 다른 암세포에서 방출되는 단백질들이 섞여 테스트 결과에 오류가 발생하는 것을 막기 위한 것이다.
항암제의 의해 포획된 암세포에서 방출되는 단백질을 캡쳐한다(S1009). 항암제와의 작용을 통해 암세포는 특정의 단백질을 배출할 수 있으며, 이때 방출되는 단백질은 항암제의 적합 여부를 판단하는 일 기준이 될 수 있다. 암세포에서 방출되는 단백질은 항체 어레이에서 캡쳐된다.
세포 용해 전에 방출되는 단백질의 캡쳐가 완료되면, 제1 밸브를 열고 제2 밸브를 닫은 후 세포용해 버퍼를 준비한다(S1011). 제2 밸브는 챔버 내 상위 채널 및 하위 채널을 한번에 닫을 수 있는 밸브이다. 이때도 제3 밸브는 닫혀있는 상태를 유지한다. 그리고 재1 밸브를 열어 모든 챔버에 세포용해 버퍼가 주입되도록 준비될 수 있다.
세포용해 버퍼의 준비가 끝나면, 다시 제1 밸브를 닫아 챔버를 고립시킨다(S1013). 단계 S1007과 마찬가지로 챔버마다 포획된 암세포로부터 방출되는 단백질이 서로 섞이지 않기 위해 챔버를 고립시킨다.
챔버가 고립된 상태에서 제2 밸브를 열어 세포용해 버퍼를 챔버에 주입한다(S1015). 세포용해 버퍼는 암세포에 작용하여 암세포의 멤브레인을 파괴해 암세포를 용해시키는 작용을 한다. 이때, 세포용해 버퍼는 믹싱 펌프를 통해 빠르게 확산될 수 있다.
세포용해 버퍼에 의해 파괴된 암세포로부터 방출되는 단백질을 캡쳐한다(S1017). 단계 S1009와 마찬가지로, 방출되는 단백질은 항체 어레이에 의해 캡쳐된다. 또한, 효율적인 항암제에 노출되었던 암세포가 파괴시 방출하는 단백질은 앞선 연구에서 알려진 것으로, 이때 캡쳐되는 단백질 또한 효율적인 항암제를 판단하기 위한 또 다른 일 기준이 될 수 있다.
단백질 캡쳐가 완료되면, 형광 신호 획득을 위한 형광 표지자를 캡쳐된 단백질에 붙힌다(S1019). 구체적으로, 형광 신호를 획득하기 위한 형광 표지자(예를 들면, biotinylated detection antibody 및 streptavidin-Cy5)를 주입하고, 주입된 형광 표지자가 캡쳐된 단백질과 결합하여 최종 assay를 형성한다.
최종 assay가 형성된 복수의 항체 어레이를 포함하는 분석 칩을 분석기에 삽입하여 가장 효율적인 항암제 조합을 판단한다 (S1021). 상술한 바와 같이, 효율적인 항암제에 노출된 암세포가 방출하는 단백질과 그렇지 않은 암세포가 방출하는 단백질에 차이가 있음을 앞선 연구에서 밝혀진바, 이를 이용하여 테스트 대상인 환자에게 가장 효율적인 항암제 조합을 판단할 수 있다.
이때, 항체 어레이에 캡쳐된 단백질에 부착된 형광 표지자를 통해 형광 신호를 측정할 수 있다. 측정된 형광 신호는 캡쳐된 단백질을 나타낼 수 있으며, 이러한 형광 신호 기반의 다중 immunoassay를 통해 단일 세포 기반의 다중 단백질 측정 및 신호 획득이 가능하다.
전술한 본 발명은, 프로그램이 기록된 매체에 컴퓨터가 읽을 수 있는 코드로서 구현하는 것이 가능하다. 컴퓨터가 읽을 수 있는 매체는, 컴퓨터 시스템에 의하여 읽혀질 수 있는 데이터가 저장되는 모든 종류의 기록장치를 포함한다. 컴퓨터가 읽을 수 있는 매체의 예로는, HDD(Hard Disk Drive), SSD(Solid State Disk), SDD(Silicon Disk Drive), ROM, RAM, CD-ROM, 자기 테이프, 플로피 디스크, 광 데이터 저장 장치 등이 있다. 따라서, 상기의 상세한 설명은 모든 면에서 제한적으로 해석되어서는 아니되고 예시적인 것으로 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 첨부된 청구항의 합리적 해석에 의해 결정되어야 하고, 본 발명의 등가적 범위 내에서의 모든 변경은 본 발명의 범위에 포함된다.

Claims (11)

  1. 암세포에 효율적인 항암제 또는 항암제 조합을 결정하기 위한 분석 칩에 있어서,
    단일 암세포를 분석하기 위한 일 단위인 챔버; 및
    상기 챔버에 주입되는 유체를 조절하기 위한 복수의 밸브를 포함하며,
    상기 챔버는,
    항암제 및 세포용해 버퍼를 포함하는 유체가 흐르는 채널;
    상기 채널을 따라 흐르는 암세포를 포커싱하기 위한 세포 정렬부;
    상기 세포 정렬부에 따라 포커싱된 암세포를 포획하는 세포 포획부; 및
    포획된 암세포로부터 방출되는 단백질을 캡쳐하는 항체 어레이를 포함하는
    분석 칩.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 챔버는 세포용해 버퍼의 확산 및 동시의 단일 세포 용해를 촉진하기 위한 미세유체기반의 믹싱 펌프를 더 포함하는
    분석 칩.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 세포 정렬부는 암세포를 포커싱하기 위한 복수의 정렬 소자를 포함하고,
    상기 복수의 정렬 소자는 항암제 흐름을 기준으로 사선으로 배열되는
    분석 칩.
  4. 제 3 항에 있어서,
    상기 복수의 정렬 소자는 특정 간격으로 배치되며,
    상기 특정 간격은 테스트하고자 하는 암세포의 크기, 정렬 소자의 크기에 기초하여 결정되는
    분석 칩.
  5. 제 4 항에 있어서,
    상기 정렬 소자는 원형의 형상을 갖는
    분석 칩
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 항체 어레이는 상기 암세포가 세포용해 버퍼에 의해 파괴되기 전 방출하는 단백질을 캡쳐하는 제1 어레이 및 세포용해 버퍼에 의해 파괴된 후 방출하는 단백질을 모두 캡쳐하는 제2 어레이를 포함하는
    분석 칩.
  7. 제 6 항에 있어서,
    상기 항체 어레이는 암세포가 방출하는 단백질과 무관한 형광 신호 방출을 위한 레퍼런스 어레이를 더 포함하는
    분석 칩.
  8. 암세포에 효율적인 항암제 또는 항암제 조합을 결정하기 위한 분석 방법에 있어서,
    분석 칩에 분석하고자 하는 환자의 암세포를 주입하는 단계;
    주입된 단일 암세포가 한 쪽 채널 벽으로 정렬되어 세포 포획부에 의해 포획되는 단계;
    복수의 약물 조합이 분석 칩을 구성하는 각각의 채널로 주입되는 단계;
    각 채널에 약물이 주입된 상태에서 밸브를 닫아 챔버를 고립시키는 단계;
    포획된 암세포가 항암제와의 반응에서 방출하는 단백질을 캡쳐하는 단계;
    세포용해 버퍼를 주입하여 암세포를 파괴하는 단계;
    파괴된 암세포로부터 방출되는 단백질을 캡쳐하는 단계; 및
    단백질이 캡쳐된 항체 어레이를 포함하는 분석 칩을 분석기에 삽입하여 환자에게 가장 효율적인 항암제 또는 항암제 조합을 판단하는 단계를 포함하는
    분석 방법.
  9. 제7 항에 있어서,
    상기 항체 어레이에 캡쳐된 단백질에 형광 프로브를 연결하는 단계를 더 포함하고,
    상기 환자에게 가장 효율적인 항암제 또는 항암제 조합을 판단하는 단계는,
    상기 형광 프로브를 통해 측정할 수 있는 형광 신호에 기초하여 가장 효율적인 항암제 또는 항암제 조합을 판단하는 단계를 포함하는
    분석 방법.
  10. 단일 암세포를 분석하기 위한 일 단위인 챔버 및 상기 챔버에 주입되는 유체를 조절하기 위한 복수의 밸브를 포함하는 분석 칩; 및
    상기 분석 칩에 형광 브로브를 연결하여 형광 신호를 측정하고, 측정 결과에 기초하여 효율적인 항암제 조합을 판단하는 항암제 조합 생성 장치를 포함하는
    항암제 조합 검출 시스템.
  11. 제 10 항에 있어서,
    상기 챔버는,
    항암제 및 세포용해 버퍼를 포함하는 유체가 흐르는 채널;
    상기 채널을 따라 흐르는 암세포를 포커싱하기 위한 세포 정렬부;
    상기 세포 정렬부에 따라 포커싱된 암세포를 포획하는 세포 포획부; 및
    포획된 암세포로부터 방출되는 단백질을 캡쳐하는 항체 어레이를 포함하는
    항암제 조합 검출 시스템.
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