KR20110045841A - 세포 기반 주화성 키트 및 이의 제조 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 세포 기반 주화성 키트 및 이의 제조 방법에 관한 것으로, 본 발명의 실시예에 따른 세포 기반 주화성 키트는 세포 주입구 및 비드 고정부를 구비하는 미세 유체 칩 및 내부에 특정 약물이 함유되는 공간을 구비하며 상기 비드 고정부에 고정되는 적어도 하나의 다공성 비드를 포함한다. 다공성 비드는 실리카로 이루어지며, 다공성 실리카 비드의 내부에 채워지는 특정 약물은 세포 주입구를 통해 주입된 세포를 성장시키기 위한 성장인자의 주화성 약물로 이루어진다.
중공 비드, 주화성 키트, 세포 기반, 미세 채널, 농도 구배

Description

세포 기반 주화성 키트 및 이의 제조 방법{CELL-BASED CHEMOTAXIS KIT AND FABRICATING METHOD THEREOF}
본 발명은 세포 기반 주화성 키트 및 이의 제조 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 미세 채널에 고정된 중공 비드로부터 유출된 특정 약물의 농도 구배를 인식하여 세포가 주화성 이동을 할 수 있도록 하는 세포 기반 주화성 키트 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.
미세 유체 칩(microfluidics chip)은 주 채널 및 미세 채널이 형성된 칩 내에 미량의 시료를 흘려보내거나 주입하여 분석하는 장치를 말하는 것으로, 나노 리터 이하의 극미량의 시료만으로도 물질의 분리, 분석 및 합성이 가능하며, 기기의 초소형화, 사용 약물의 최소화 및 실험 결과의 신뢰도 극대화 등의 장점을 가지므로, 분자생물, 의학, 약물 개발은 물론 제조업 및 통신 분야 등에서 각광받고 있다.
이러한 미세 유체 칩은 실험실의 모든 장치를 칩 위의 각 모듈로 집적하여 실험실에서 행해지던 특정 실험들을 미세 유체 칩 내에 집적시켜 수행할 수 있으므로, “칩 위의 실험실(lab-on-a-chip)"이라 불린다.
미세 유체 칩을 이용한 미세 유체 제어 기술은 세포가 특정 약물의 농도구배를 인식하여 약물의 높은 농도를 향하여 이동하는 현상, 즉 “주화성”을 이용한다.
세포의 주화성 실험에 관한 연구는 세포 주변의 화학 약물의 농도구배를 조절하는 방법을 연구하는 방향으로 진행되어 있으며, 상업적이며 실험실적인 세포 주화성 연구 시스템으로는 Boyden chamber, Zigmond chamber, Dunn chamber, Under-agarose assay, Micropipette-based assay가 있다.
그리고 최근에는 Jeon 등에 의해 미세 채널을 이용한 농도구배 형성장치가 개발되어 주화성 연구에 활용된 바 있다.
전술한 주화성 실험에 관한 연구는 특히 미생물학 분야에서 박테리아를 이용한 주화성 실험이 가장 활발히 연구되고 있으며, 최근에는 주화성을 통한 암세포의 전이과정 억제 기작에 대한 연구가 진행되고 있다.
이 외에도 상기 주화성 실험에 관한 연구는 상처 치유의 기작을 연구하기 위한 호중구 주화성 연구, 암세포의 전이 억제를 위한 유방암 세포 주화성 연구 등이 활발하게 이루어지고 있으며, 신경세포의 축삭 유도와 같은 연구도 진행되고 있다.
그런데 종래에 개발된 주화성 연구 시스템, 예컨대 Zigmond chamber 및 Dunn chamber는 약물이 저장된 장소와 세포의 이동을 평가하는 장소 사이의 거리가 짧아야 확산이 잘 일어나는 특징이 있다.
그리고 아가로즈 젤이나 콜라겐 젤을 사용하는 경우에는 약물의 이동 속도가 매우 느려 주화성 연구에 긴 시간이 걸리는 문제점이 있고, 마이크로미터 단위의 실험에서 오랜 시간동안 실험을 수행하기에는 적합하지 않으며, 실험 수행에 있어 매우 많은 비용이 소모되고 실시간 모니터링이 불가능하고, 시간에 따라 농도 구배가 불안정하여 변할 수 있는 문제점이 있다.
또한 상기 시스템은 단지 하나의 농도구배만을 형성할 수 있으며, 실험 수행 중간에 농도구배를 임의로 조작할 수 없고, 실험 수행 중 농도구배를 변경할 때에는 새로운 실험을 수행해야 하므로 오랜 시간을 필요로 하는 문제점이 있다.
한편, 미세 채널과 주사기 펌프를 활용한 주화성 키트는 안정적인 농도구배를 형성할 수 있고 실시간 모니터링이 가능한 장점이 있지만, 주사기 펌프의 사용이 복잡하고 주사기 속에 주입된 배지가 외부 환경과 단절되어 있어 시간에 따라 배양 조건, 특히 pH가 달라질 수 있는 단점이 있다.
본 발명의 기술적 과제는 구성이 간단하며 효율적인 세포 기반 주화성 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 기술적 과제는 세포 기반 주화성 키트의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 실시예에 따른 세포 기반 주화성 키트는 세포 주입구 및 비드 고정부를 구비하는 미세 유체 칩; 및 내부에 특정 약물이 함유되는 공간을 구비하며, 상기 비드 고정부에 고정되는 적어도 하나의 다공성 비드를 포함한다.
미세 유체 칩은 서로 결합된 상부 몰드 및 하부 몰드로 이루어지고, 다공성 비드는 실리카로 이루어지며, 다공성 실리카 비드의 내부에 채워지는 특정 약물은 세포 주입구를 통해 주입된 세포를 성장시키기 위한 성장인자의 주화성 약물로 이루어진다. 그리고 미세 유체 칩은 주 채널, 미세 채널, 용액 주입구 및 용액 배출구를 더 구비할 수 있다.
이러한 구성의 세포 기반 주화성 키트는, 세포 주입구 및 비드 고정부를 구비하는 미세 유체 칩을 제조하는 단계; 내부가 비어 있는 다공성 비드를 제조하는 단계; 상기 세포 주입구를 통해 세포를 주입하는 단계; 및 상기 다공성 비드를 상기 미세 유체 칩의 비드 고정부에 배치하는 단계를 포함하는 제조 방법에 의해 제조할 수 있다. 이때, 상기 다공성 비드는 주화성 약물이 주입된 것일 수 있다.
본 발명의 실시예에서, 미세 유체 칩을 제조하는 단계는 실리콘 웨이퍼 위에 감광제를 일정 두께로 도포하는 단계; 주 채널 및 미세 채널을 형성하기 위한 패턴이 형성된 마스크를 이용하여 거푸집을 제작하는 단계; 폴리디메틸실록산(PDMS, polydimethylsiloxane)을 거푸집에 부어 몰딩한 후, 소정 온도로 소정 시간 동안 경화하는 단계; 경화된 PDMS 몰드를 거푸집에서 분리한 후, 용액 주입구, 세포 주입구 및 용액 배출구 중에서 필요한 적어도 하나를 형성하는 단계, 및 2개의 PDMS 몰드, 예컨대 상부 몰드 및 하부 몰드를 플라즈마 처리하여 산화시킨 후 결합하는 단계를 포함할 수 있다.
그리고 다공성 비드를 제조하는 단계는 옥틸아민(octylamine)과 티이오에스(TEOS)를 교반하여 균일한 용액을 형성하는 단계; 상기 용액에 염산 수용액을 첨 가하여 속은 유기물로 이루어지고 겉은 무기물로 이루어지는 비드를 형성하는 단계; 원심 분리하여 얻어진 비드 전구체를 세정 및 건조하는 단계; 설정 온도에 도달할 때까지 상기 비드 전구체를 설정 조건(℃/mim)으로 승온시키는 단계; 및 설정 시간 동안 소성하는 단계를 포함할 수 있다.
여기에서, 설정 온도는 대략 600℃이며, 상기 설정 조건(℃/mim)을 조절하는 것에 따라 다공성 비드의 미세 세공의 크기를 결정할 수 있다.
특정 약물이 주입된 다공성 비드를 미세 유체 칩의 비드 고정부에 배치하는 단계는 에스에이엠에스(SAMs)를 이용한 화학적 결합을 이용하여 다공성 비드를 고정하는 방법 또는 세포가 배양된 미세 유체의 단차에 의해 상기 다공성 비드를 고정하는 방법을 포함할 수 있다.
전자의 방법은 에이피티엠에스(APTMS, (3-aminopropyl)trimethoxysilane)를 에탄올에 소정 비율로 희석한 용액을 준비하는 단계; 미세 유체 칩과 다공성 비드를 상기 용액에 소정 시간동안 담구어 잔기가 아민(amine)인 SAMs를 상기 미세 유체 칩과 다공성 비드에 결합시키는 단계; 상기 미세 유체 칩과 다공성 비드를 세정하는 단계; 플라즈마 식각을 실시하여 일부 영역의 아민 잔기를 제거하는 단계; 및 상기 아민 잔기와 화학 결합을 할 수 있는 1,4-phenylene diisothiocynate를 이용하여 상기 화학 결합에 의해 미세 유체 칩의 비드 고정부에 비드 고정 패턴을 형성하는 단계를 포함할 수 있다. 여기에서, 비드 고정 패턴은 단차로 이루어질 수 있다.
그리고 후자의 방법은 미세 채널 내에서 세포를 배양하는 단계; 혈장이 없는 배지로 교체하는 단계; 소정 시간 동안 인큐베이터에서 보관하는 단계; 및 특정 약물이 주입된 다공성 비드를 주입구를 통해 흘려보내어 상기 다공성 비드를 비드 고정부에 고정하는 단계를 포함할 수 있다.
이러한 구성의 세포 기반 주화성 키트는 다공성의 비드가 약물 주입 및 유출이 가능한 펌프의 기능을 하게 되므로, 주사기 펌프를 제거할 수 있어 실험 과정의 단순화 및 실험 수행의 경제적인 효과를 얻을 수 있다.
그리고 다공성의 비드 내부에 함유된 특정 약물의 유출을 통해 비드 주변의 세포의 주화성 거동을 확인할 수 있으므로, 약물이 유출되는 양 및 시간에 따라 세포의 거동 변화를 실시간으로 관찰할 수 있다.
또한, 기존의 웰 플레이트(well plate)에서 실험을 수행하는 경우와 비교하여 상당히 경제적이고 효율적인 실험을 수행할 수 있다.
또한, 미세 유체 칩의 내부에 복수의 비드가 고정되므로, 하나의 칩으로 복수의 병행 실험이 가능하여 방대한 자료 수집이 가능하며, 실험 수행 능력을 향상시킬 수 있다.
이하, 도면을 참조하여 본 발명의 실시예를 더욱 자세하게 설명한다. 첨부된 도면들에서 구성에 표기된 참조번호를 다른 도면에서도 동일한 구성을 표기할 때에 가능한 한 동일한 도면번호를 사용하고 있음에 유의하여야 한다. 또한, 본 발명을 설명함에 있어, 관련된 공지의 기능 또는 공지의 구성에 대한 구체적인 설 명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략하기로 한다. 그리고 도면에 제시된 어떤 특징들은 설명의 용이함을 위해 확대 또는 축소 또는 단순화된 것이고, 도면 및 그 구성요소들이 반드시 적절한 비율로 도시되어 있지는 않다. 그러나 당업자라면 이러한 상세 사항들을 쉽게 이해할 것이다.
도 1은 본 발명의 실시예에 따른 세포 기반 주화성 키트의 개략적인 구성을 나타내는 사시도이고, 도 2는 도 1에 도시한 비드 고정부의 구성을 나타내는 확대도이다.
도시한 바와 같이, 본 발명의 실시예에 따른 세포 기반 주화성 키트(100)는 미세 유체 칩(10) 및 다공성 비드(30)를 포함한다.
미세 유체 칩(10)은 서로 결합된 상부 몰드(12) 및 하부 몰드(14)로 이루어지며, 상부 몰드(12) 및 하부 몰드(14)는 폴리디메틸실록산(PDMS, polydimethylsiloxane) 몰드로 이루어진다.
미세 유체 칩(10)의 내부에는 주 채널(CH1), 미세 채널(CH2) 및 비드 고정부(16)가 구비되어 있으며, 상부 몰드(12)에는 용액 주입구(18), 세포 주입구(20) 및 용액 배출구(22)가 형성되어 있다.
다공성 실리카 비드(30)는 비드 고정부(16)의 단차(16a)에 고정되는 것으로, 내부에는 세포 주입구(20)를 통해 주입된 세포의 주화성 이동을 일으키는 주화성 약물이 포함되어 있으며, 주화성 약물은 비드(30)에 형성된 미세 세공(도시하지 않음)을 통해 서서히 유출될 수 있다.
이러한 구성의 세포 기반 주화성 키트(100)는 다공성 실리카 비드(30)가 주사기 펌프의 기능을 하게 되므로, 종래의 주사기 펌프를 제거할 수 있어 실험 과정의 단순화 및 실험 수행의 경제적인 효과를 얻을 수 있다.
그리고 다공성 비드(30) 내부에 함유된 특정 약물, 예컨대 주화성 약물의 유출을 통해 비드(30) 주변의 세포의 주화성 거동을 확인할 수 있으므로, 약물이 유출되는 양 및 시간에 따라 세포의 거동 변화를 실시간으로 관찰할 수 있다.
본 발명의 실시예에 따른 미세 유체 칩(10)은 16×40㎜의 크기를 갖는다. 다공성 실리카 비드(30)를 고정할 수 있는 단차(16a)가 50개이므로, 비드 고정부(16)의 단차(16a)에 다공성 실리카 비드(30)가 모두 고정되는 경우에는 각 칩마다 55개의 병행 실험이 가능하다.
이하, 전술한 구성의 세포 기반 주화성 키트의 제조 방법을 설명한다.
본 발명의 실시예에 따른 세포 기반 주화성 키트의 제조 방법은 도 3에 도시한 바와 같이, 세포 주입구 및 비드 고정부를 구비하는 미세 유체 칩을 제조하는 단계(S100), 내부가 비어 있는 다공성 비드를 제조하는 단계(S200), 세포 주입구를 통해 세포를 주입하는 단계(S300), 및 상기 다공성 비드를 상기 미세 유체 칩의 비드 고정부에 배치하는 단계(S400)를 포함할 수 있다. 이때, 다공성 비드는 주화성 약물이 주입된 것일 수 있다.
먼저 미세 유체 칩을 제조하는 단계에 대해 도 1 및 도 4를 참고로 설명하면, 이 단계(S100)는 실리콘 웨이퍼 위에 감광제를 일정 두께로 도포하는 단계(S110), 미세 채널(CH2)을 형성하기 위한 패턴이 형성된 마스크를 이용하여 거푸 집을 제작하는 단계(S120), 폴리디메틸실록산(PDMS, polydimethylsiloxane)을 거푸집에 부어 몰딩한 후 소정 온도에서 소정 시간 동안 경화하는 단계(S130), 경화된 PDMS 몰드를 거푸집에서 분리한 후 세포 주입구(20), 용액 주입구(18) 및 용액 배출구(22) 중에서 필요한 적어도 하나를 형성하는 단계(S140), 및 2개의 PDMS 몰드, 예컨대 상부 몰드(12) 및 하부 몰드(14)를 플라즈마 처리하여 산화시킨 후 결합하는 단계(S150)를 포함할 수 있다.
여기에서, 상기 폴리디메틸실록산은 고분자전구체와 경화제를 10:1의 비율로 섞어 제조할 수 있다. 그리고 소정 온도는 70℃이고, 소정 시간은 4시간일 수 있다. 그리고 플라즈마 처리는 5분간 실시할 수 있다.
다음으로 다공성 비드를 제조하는 단계에 대하여 도 1 및 도 5를 참고로 설명하면, 본 실시예에 따른 다공성 비드의 제조 방법은 옥틸아민(octylamine)과 티이오에스(TEOS)를 교반하여 균일한 용액을 형성하는 단계(S210), 상기 용액에 염산 수용액을 첨가하여 속은 유기물로 이루어지고 겉은 무기물로 이루어지는 비드를 형성하는 단계(S220), 원심 분리하여 얻어진 비드 전구체를 세정 및 건조하는 단계(S230), 설정 온도에 도달할 때까지 상기 비드 전구체를 설정 조건(℃/mim)으로 승온시키는 단계(S240), 및 설정 시간 동안 소성하는 단계(S250)를 포함할 수 있다.
이와 같이 다공성 실리카 비드(30)는 옥틸아민(octylamine)과 티이오에스(TEOS) 및 염산을 합성하여 제조할 수 있다.
보다 구체적으로 설명하면, 옥틸아민(octylamine)과 티이오에스(TEOS)를 250 ㎖ 용량의 둥근바닥 플라스크에 넣어 교반하여 균일한 용액을 형성하고, 0.20M 염산 수용액을 100㎖ 첨가한다. 염산 수용액을 첨가하면, 옥틸아민이 틀을 만들고, 염산으로부터 제공된 H+가 옥틸아민 잔기 NH2를 NH3 +로 전환시키며(도 6 참조), 티이오에스가 틀의 표면에서 반응하여 속은 유기물, 겉은 무기물인 비드를 형성한다.
원심 분리하여 얻어진 비드 전구체를 증류수로 세정하고 공기 중에서 건조한 후, 전기로를 이용하여 4℃/min의 속도로 온도를 증가시켜 최종 온도가 600℃가 되게 한 후, 6시간 동안 소성하면 내부가 빈 다공성 실리카 비드(30)가 제조된다.
그리고 상기 소성 과정에서는 온도의 증가 속도에 따라 비드의 미세 세공의 크기가 결정된다.
합성된 비드가 다공성 비드인가를 확인하기 위하여 에프아이티씨-덱스트란(FITC-Dextran)을 사용하여 형광 분석을 실시하였다.
일정 농도의 에프아이티씨-덱스트란 용액을 제조하여 다공성 비드(30)를 용액 속에 충분한 시간 동안 담근 후 형광 분석을 통하여 비드(30) 내부가 형광물질 용액으로 포화되는 것을 확인할 수 있었다(도 7 참조).
이렇게 주입된 형광물질이 용액 내에서 다공성 비드(30)의 미세 세공을 통해 유출되는 것을 도 1의 세포 기반 주화성 키트(100)를 활용하여 분석하였으며, 시간에 따른 형광물질의 농도구배를 분석하였다(도 8 및 도 9 참조). 그리고 일정 시간 간격으로 얻어진 형광물질의 농도구배를 주화성 실험의 표준 농도구배로 활용하였다.
특정 약물, 예컨대 주화성 약물이 주입된 다공성 비드(30)를 미세 유체 칩(10)의 비드 고정부(16)에 배치하는 단계는 에스에이엠에스(SAMs)를 이용한 화학적 결합을 이용하여 다공성 비드를 고정하는 방법 또는 세포가 배양된 미세 유체의 단차에 의해 상기 다공성 비드를 고정하는 방법을 포함할 수 있다.
전자의 방법에 대해 도 1 및 도 10을 참고로 설명하면, 본 실시예에 따른 방법은 에이피티엠에스(APTMS, (3-aminopropyl)trimethoxysilane)를 에탄올에 1:1,000(v/v)의 비율로 희석한 용액을 준비하는 단계(S410), 미세 유체 칩(10)과 다공성 비드(30)를 상기 용액에 담군 상태에서 30분간 동안 방치하여 잔기가 아민(amine)인 SAMs를 상기 미세 유체 칩(10)과 다공성 비드(30)에 결합시키는 단계(S420), 상기 미세 유체 칩(10)과 다공성 비드(30)를 에탄올과 증류수로 세정하는 단계(S430), 플라즈마 식각을 실시하여 일부 영역의 아민 잔기를 제거하는 단계(S440), 및 상기 아민 잔기와 화학 결합을 할 수 있는 1,4-phenylene diisothiocynate를 이용하여 상기 화학 결합에 의해 미세 유체 칩(10)의 비드 고정부(16)에 비드 고정 패턴, 즉 단차(16a)를 형성하는 단계(S450)를 포함할 수 있다.
그리고 후자의 방법에 대하여 도 1 및 도 11을 참고로 설명하면, 본 실시예에 따른 방법은 미세 채널(CH2) 내에서 세포를 배양하는 단계(S410'), 혈장이 없는 배지로 교체하는 단계(S420'), 6시간 동안 인큐베이터에서 보관하는 단계(S430'), 및 특정 약물이 주입된 다공성 비드(30)를 주입구를 통해 흘려보내어 상기 다공성 비드(30)를 비드 고정부(16)에 고정하는 단계(S440')를 포함할 수 있다.
여기에서, 미세 채널(CH2) 내에 세포를 배양하는 단계(S410')는 생쥐 BALB/c 3T3 섬유아세포(약 4×10,000개/㎖)를 세포 주입구(20)를 통해 주입하고, 그 후 6시간 간격으로 배지를 교체하는 것에 따라 이루어질 수 있다.
도 12는 다공성 비드로부터의 약물 유출 및 세포의 주화성을 실험한 것으로, 시간이 지남에 따라 세포가 이동하는 것을 분석한 것이며, 시간에 따른 이동을 선으로 연결하여 가시화하였다.
본 실험은 생쥐 BALB/c 3T3 섬유아세포의 성장인자인 PDGF-BB 용액을 다공성 실리카 비드(30)에 주입하고, 형광 용액 주입과 마찬가지로 PDGF-BB 용액 속에 비드(30)를 5일 이상 담가 상기 용액이 비드(30) 내부로 충분히 주입되게 한 후, 세포가 배양된 채널의 주입구를 통해 비드(30)를 주입하여 비드 고정부(16)에 고정시키고, 시간이 지남에 따라 세포가 비드(30) 주변으로 움직이는 것을 관찰하였다. 도 12에 있어서, 우측의 사진은 6시간이 경과된 후의 상태를 나타낸다.
도 13은 도 12의 실험을 통해서 얻어진 실험 결과를 바탕으로 세포의 이동을 분석한 것이다. 본 실험에 의하면, 도 9에 도시한 바와 같이 시간당 세포의 이동 위치를 알 수 있다. 또한, 비드(30) 주변을 일정한 구획으로 나누어 시간당 세포가 이동한 실제 거리를 분석할 수 있다.
이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명의 실시예에 따른 세포 기반 주화성 키트는 실험 과정의 단순화 및 실험 수행의 경제적인 효과를 얻을 수 있고, 약물이 유출되는 양 및 시간에 따라 세포의 거동 변화를 실시간으로 관찰할 수 있다.
도 1은 본 발명의 실시예에 따른 세포 기반 주화성 키트의 개략적인 구성을 나타내는 사시도이다.
도 2는 도 1에 도시한 비드 고정부의 구성을 나타내는 확대도이다.
도 3은 본 발명의 실시예에 따른 세포 기반 주화성 키트의 제조 방법을 나타내는 공정 블록도이다.
도 4는 본 발명의 실시예에 따른 미세 유체 칩의 제조 방법을 나타내는 공정 블록도이다.
도 5는 본 발명의 실시예에 따른 다공성 비드의 제조 방법을 나타내는 공정 블록도이다.
도 6은 본 발명의 실시예에 따른 다공성 비드의 제조 과정을 도식화 한 것이다.
도 7은 형광물질로 포화된 다공성 비드가 비드 고정부에 고정된 상태를 나타내는 것이다.
도 8은 비드로부터 유출되는 약물의 농도에 대한 이론적인 농도구배를 나타낸 것이다.
도 9는 비드에 주입된 형광물질이 시간이 지남에 따라 비드 내부로부터 유출되어 주 채널에 존재하는 형광물질의 농도를 분석한 것이다.
도 10은 다공성 비드를 비드 고정부에 배치하는 방법의 제1 실시예를 나타내는 공정 블록도이다.
도 11은 다공성 비드를 비드 고정부에 배치하는 방법의 제2 실시예를 나타내는 공정 블록도이다.
도 12는 비드로부터의 약물 유출 및 세포의 주화성을 실험한 것으로, 시간이 지남에 따라 세포가 이동하는 것을 분석한 것이다.
도 13은 도 12의 실험을 통해서 얻어진 실험 결과를 바탕으로 세포의 이동을 분석한 것이다.
*** 도면의 주요 부분에 대한 부호의 설명 ***
100: 세포 기반 주화성 키트 10: 미세 유체 칩
12: 상부 몰드 14: 하부 몰드
16: 비드 고정부 18: 용액 주입구
20: 세포 주입구 22: 용액 배출구
30: 다공성 실리카 비드 CH1: 주 채널
CH2: 미세 채널

Claims (15)

  1. 세포 주입구 및 비드 고정부를 구비하는 미세 유체 칩; 및
    내부에 특정 약물이 함유되는 공간을 구비하며, 상기 비드 고정부에 고정되는 적어도 하나의 다공성 비드
    를 포함하는 세포 기반 주화성 키트.
  2. 제1항에서,
    상기 미세 유체 칩은 서로 결합된 상부 몰드 및 하부 몰드로 이루어지는 세포 기반 주화성 키트.
  3. 제1항 또는 제2항에서,
    상기 다공성 비드는 실리카로 이루어지는 세포 기반 주화성 키트.
  4. 제3항에서,
    상기 다공성 실리카 비드의 내부에 채워지는 상기 특정 약물은 상기 세포 주입구를 통해 주입된 세포를 성장시키기 위한 성장인자의 주화성 약물로 이루어지는 세포 기반 주화성 키트.
  5. 제3항에서,
    상기 미세 유체 칩은 주 채널, 미세 채널, 용액 주입구 및 용액 배출구를 더 구비하는 세포 기반 주화성 키트.
  6. 세포 주입구 및 비드 고정부를 구비하는 미세 유체 칩을 제조하는 단계;
    내부가 비어 있는 다공성 비드를 제조하는 단계;
    상기 세포 주입구를 통해 세포를 주입하는 단계; 및
    상기 다공성 비드를 상기 미세 유체 칩의 비드 고정부에 배치하는 단계
    를 포함하는 세포 기반 주화성 키트의 제조 방법.
  7. 제6항에서,
    상기 다공성 비드의 내부에는 주화성 약물이 주입된 것을 특징으로 하는 세포 기반 주화성 키트의 제조 방법.
  8. 제6항에서, 상기 미세 유체 칩을 제조하는 단계는,
    실리콘 웨이퍼 위에 감광제를 일정 두께로 도포하는 단계;
    주 채널 및 미세 채널을 형성하기 위한 패턴이 형성된 마스크를 이용하여 거푸집을 제작하는 단계;
    폴리디메틸실록산(PDMS, polydimethylsiloxane)을 거푸집에 부어 몰딩한 후, 소정 온도로 소정 시간 동안 경화하는 단계;
    경화된 PDMS 몰드를 거푸집에서 분리한 후, 세포 주입구, 용액 주입구 및 용 액 배출구 중에서 필요한 적어도 하나를 형성하는 단계; 및
    2개의 PDMS 몰드를 플라즈마 처리하여 산화시킨 후 결합하는 단계
    를 포함하는 세포 기반 주화성 키트의 제조 방법.
  9. 제6항에서, 상기 다공성 비드를 제조하는 단계는,
    옥틸아민(octylamine)과 티이오에스(TEOS)를 교반하여 균일한 용액을 형성하는 단계;
    상기 용액에 염산 수용액을 첨가하여 속은 유기물로 이루어지고 겉은 무기물로 이루어지는 비드를 형성하는 단계;
    원심 분리하여 얻어진 비드 전구체를 세정 및 건조하는 단계;
    설정 온도에 도달할 때까지 상기 비드 전구체를 설정 조건(℃/mim)으로 승온시키는 단계; 및
    설정 시간 동안 소성하는 단계
    를 포함하는 세포 기반 주화성 키트의 제조 방법.
  10. 제9항에서,
    상기 설정 온도는 600℃인 것을 특징으로 하는 세포 기반 주화성 키트의 제조 방법.
  11. 제9항에서,
    상기 설정 조건을 조절하는 것에 따라 상기 다공성 비드의 미세 세공의 크기를 결정하는 세포 기반 주화성 키트의 제조 방법.
  12. 제6항 내지 제11항 중 어느 한 항에서,
    상기 특정 약물이 주입된 다공성 비드를 상기 미세 유체 칩의 비드 고정부에 배치하는 단계는 에스에이엠에스(SAMs)를 이용한 화학적 결합을 이용하여 다공성 비드를 고정하는 방법을 포함하는 세포 기반 주화성 키트의 제조 방법.
  13. 제12항에서,
    상기 SAMs를 이용한 화학적 결합을 이용하여 다공성 비드를 고정하는 방법은,
    에이피티엠에스(APTMS, (3-aminopropyl)trimethoxysilane)를 에탄올에 소정 비율로 희석한 용액을 준비하는 단계;
    미세 유체 칩과 다공성 비드를 상기 용액에 소정 시간동안 담가 잔기가 아민(amine)인 상기 SAMs를 상기 미세 유체 칩과 다공성 비드에 결합시키는 단계;
    상기 미세 유체 칩과 다공성 비드를 세정하는 단계;
    플라즈마 식각을 실시하여 일부 영역의 아민 잔기를 제거하는 단계; 및
    상기 아민 잔기와 화학 결합을 할 수 있는 1,4-phenylene diisothiocynate를 이용하여 상기 화학 결합에 의해 미세 유체 칩의 비드 고정부에 비드 고정 패턴을 형성하는 단계
    를 포함하는 세포 기반 주화성 키트의 제조 방법.
  14. 제6항 내지 제11항 중 어느 한 항에서,
    상기 특정 약물이 주입된 다공성 비드를 상기 미세 유체 칩의 비드 고정부에 배치하는 단계는 세포가 배양된 미세 유체의 단차에 의해 상기 다공성 비드를 고정하는 방법을 포함하는 세포 기반 주화성 키트의 제조 방법.
  15. 제14항에서,
    상기 세포가 배양된 미세 유체의 단차에 의해 상기 다공성 비드를 고정하는 방법은,
    미세 채널 내에서 세포를 배양하는 단계;
    혈장이 없는 배지로 교체하는 단계;
    소정 시간 동안 인큐베이터에서 보관하는 단계; 및
    특정 약물이 주입된 다공성 비드를 주입구를 통해 흘려보내어 상기 다공성 비드를 비드 고정부에 고정하는 단계
    를 포함하는 세포 기반 주화성 키트의 제조 방법.
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20150098089A (ko) * 2014-02-19 2015-08-27 한국과학기술연구원 관류 세포 배양 장치, 이의 제조 방법 및 세포 배양 방법
CN110650802A (zh) * 2017-05-18 2020-01-03 高保真生物技术有限公司 用于制造微通道阵列的方法

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101330875B1 (ko) 2012-08-14 2013-11-18 국립대학법인 울산과학기술대학교 산학협력단 미세입자 및 미생물 분류를 위한 다단 높이의 몰드 제조방법

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7374906B2 (en) 2000-11-08 2008-05-20 Surface Logix, Inc. Biological assays using gradients formed in microfluidic systems
US20040063206A1 (en) * 2002-09-30 2004-04-01 Rowley Jon A. Programmable scaffold and method for making and using the same
EP1764409A1 (en) 2005-09-12 2007-03-21 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Device and method for observing the organization of studied cells cultured in the presence of a concentration gradient of chemotactic molecules
KR100975611B1 (ko) * 2008-11-28 2010-08-17 한국생산기술연구원 세포 주화성 검사용 마이크로 플루이딕 칩 및 제조방법

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20150098089A (ko) * 2014-02-19 2015-08-27 한국과학기술연구원 관류 세포 배양 장치, 이의 제조 방법 및 세포 배양 방법
CN110650802A (zh) * 2017-05-18 2020-01-03 高保真生物技术有限公司 用于制造微通道阵列的方法

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