CN110650802A - 用于制造微通道阵列的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于制造包含从溶胶‑凝胶溶液获得的固体材料的微流体芯片的方法，所述方法依次包括：a)将由正硅酸乙酯制成的溶胶‑凝胶溶液浇铸到模具上，所述模具具有浮雕图案并且在整个模具上具有不同厚度；b)使所述溶胶‑凝胶溶液胶凝；c)将b)中获得的凝胶脱模并干燥，以获得固体玻璃；和d)将所述固体玻璃键合到载体上，以获得微流体芯片。

Description

用于制造微通道阵列的方法

技术领域

本发明涉及一种制造包含从溶胶-凝胶溶液获得的固体玻璃的微流体芯片的方法，还涉及所获得的微流体芯片及其用途。

背景技术

常规地，可用于细胞分选或评估生物反应的微流体芯片由诸如聚二甲基硅氧烷(PDMS)的硅酮材料制成。在制造方法中使用的模具也可以由这种柔性材料(例如PDMS)制成。

一些微结构化物，可能对微流体领域而言很方便，这些微结构化物可以通过使用PDMS模具的溶胶-凝胶工艺来制造。在US9266765中对此进行了特别描述。

传统地，溶胶-凝胶工艺包括制备包含基于金属或类金属元素(可以是有机金属化合物或金属盐)的前体和一种或多种有机溶剂的溶液，所得溶液由此形成溶胶(也可以称为溶胶-凝胶溶液)。由于溶胶已经包含水，因此包含在该溶胶-凝胶溶液中的部分前体经历水解步骤和缩合步骤，以形成截留溶剂的氧化物网络，从而形成凝胶。然后使凝胶干燥，以在干燥结束时形成单片物。

但是，将PDMS用于微流体芯片有许多缺点：

-围入例如尘土的颗粒，这并不少见；

-由于其不可靠性(特别是用于键合)，因此不适合高生产量方法。如果不进行表面改性，还可能通过使液滴聚结而使引入的生物样本(乳液形式)不稳定。

-这很耗时并且可扩展性低；和

-液滴会随时间收缩。

另一方面，热塑性材料与溶剂的相容性也低。此外，表面质量在很大程度上取决于微加工步骤，这些步骤造成的表面粗糙度可能导致注入其中的乳液劣化。这通常与玻璃清洁方法不兼容。最后，可能难以在这样的材料上进行压电材料的有效键合。

因此，需要一种能够以高可扩展性快速且容易地执行的制造微流体芯片的方法。此外，需要用稳定的材料制造微流体芯片，该材料适合于高产量方法，并且不易围入颗粒。所述微流体芯片必须能够以工业规模使用，并且以与压电材料的键合兼容的材料制成。这必须与用于玻璃的清洁方法兼容，并保持注入其中的乳液的良好质量。

发明人发现了一种用于制造从溶胶-凝胶溶液获得的固体玻璃微流体芯片的具体方法。所述固体玻璃微流体芯片可特别用于筛选免疫细胞，免疫细胞诸如为产生抗体的细胞、T细胞或NK细胞或中性粒细胞。

所述方法适合于高产量筛选，并且所使用的材料是稳定的并且减少了聚结或液滴破裂。“稳定”是指所使用的材料在化学和机械上是稳定的。当然，它不会随着时间的推移而劣化。此外，可以多次适当清洗以用于再使用而没有污染的风险。最后，通过避免所述样本中包含的水(从而避免引起液滴收缩)或油的全蒸发，可以长期存储芯片，特别是包含生物样本的芯片。

发明内容

本发明涉及一种用于制造包含从溶胶-凝胶溶液获得的固体材料的微流体芯片的方法，所述方法依次包括：

a)将由正硅酸乙酯制成的溶胶-凝胶溶液浇铸到模具上，所述模具具有浮雕图案并且在整个模具上具有不同厚度；

b)使所述溶胶-凝胶溶液胶凝；

c)将b)中获得的凝胶脱模并干燥，以获得固体玻璃；和

d)将所述固体玻璃键合到载体上，以获得微流体芯片。

本发明还涉及一种由根据本发明的方法获得的微流体芯片。

本发明还提供了由根据本发明的方法获得的微流体芯片用于筛选蛋白质，优选筛选抗体的用途。

本发明还涉及一种筛选产生目标蛋白质的细胞，优选是筛选免疫细胞的方法，包括以下步骤：

-将包含细胞(该细胞表面或该细胞内表达捕获剂)和由捕获剂涂覆的珠粒之一和产生蛋白质的细胞(优选是免疫细胞，更优选是分泌抗体或细胞因子的细胞)的乳液液滴引入本发明的微流体芯片；

-在允许蛋白质分泌的条件下培养所得芯片；和

-基于特定的光学信号分选产生目标蛋白质的细胞。

所述信号可以是荧光或发光的。例如，在激光激发之后，可以使用诸如光电倍增管或雪崩光电二极管的合适的带通滤波器检测到。

这样的用于分选细胞，优选是分选免疫细胞的方法也被称为“细胞分选(sorter)方法”或“细胞分选(sorting)方法”。

优选地，每个乳液液滴包括(i)单个细胞，优选单个免疫细胞，和(ii)由捕获剂涂覆的单个珠粒或由捕获剂涂覆的磁性珠粒的悬浮液，或表达捕获剂的单个细胞。

本发明还涉及用于识别目标核酸序列的方法，包括以下步骤：

-将包含细胞的乳液液滴引入本发明的微流体芯片中，其中每个液滴包括单个细胞；

-将第二液滴放置在每个乳液液滴上，其中第二液滴包括由捕获剂涂覆的限定数量的珠粒(优选是单个珠粒)和试剂混合物，以获得每个第二液滴和每个乳液液滴的融合，并将目标核酸序列递送在所述融合物中；和

-捕获并可选择地对目标核酸序列进行条形码编码；

-可选择地回收融合的液滴。

这样的方法也被称作“条形码方法”。

具体实施方式

根据本发明的用于制造包含从溶胶-凝胶溶液获得的固体材料的微流体芯片的方法依次包括：

a)将由正硅酸乙酯制成的溶胶-凝胶溶液浇铸到模具上，该模具具有浮雕图案并且在整个模具上具有不同厚度；

b)使溶胶-凝胶溶液胶凝；

c)将b)中获得的凝胶脱模并干燥，以获得固体玻璃；和

d)将所述固体玻璃键合到载体上，以获得微流体芯片。

一种微流体芯片，包括基体和载体，基体和载体共同限定至少一个通道。“微流体”通常是指通道(液滴或流体要在其中循环)的横向尺寸小于一毫米，并且例如在1μm至1mm之间。

在本发明中，微流体芯片的基体对应于从溶胶-凝胶溶液获得的固体材料，即固体玻璃。微流体芯片的载体优选是载玻片或晶片。

微流体芯片通常是包含具有矩形、椭圆形或圆形横截面的通道的块。微流体芯片的厚度通常小于1cm。

通道由在基体或载体中限定的侧壁界定。优选地，侧壁被限定在基体中。实际上，在这种情况下，在上述方法的步骤a)中使用的模具的浮雕图案使微流体芯片的基体成形，该浮雕图案包括凸起，因此步骤b)的凝胶后的溶胶-溶胶溶液包含通道，诸如微通道或纳米通道。

通道在主方向上是拉长的。

通道具有在横向于主方向的平面上测量的高度和宽度。高度和/或宽度小于1mm，优选地在1μm和1mm之间。

例如，通道在横向于主方向的平面中呈现正方形或矩形截面。作为替代方案，通道在横向于主方向的平面中呈现圆形或椭圆形截面。

通道通常包括用于注入流体的入口和用于收集流体的出口。通道通常旨在允许流体沿主方向从入口流向出口。

通道的入口可以连接到流体的储存器，该流体旨在该通道中流动。通道的出口可以连接到收集来自通道的流体的储存器。

微流体芯片可包括多个通道，并且包括通道之间的交汇部。

交汇部可能是发散的，使得到达第一通道的流体在交汇后会分成两个不同的通道。

替代地，交汇部可以是汇聚的，使得两股流体从两个不同的通道到达。

这些交汇部例如是T形交汇部或聚流型交汇部。

例如，交汇部用于帮助载流体中内部流体的液滴的产生，该载流体与内部流体不混溶。

微流体芯片可以进一步包括过滤单元。

微流体芯片可以进一步包括培养室。

微流体芯片通常旨在制备分散在外部流体中的内部流体的连续液滴。液滴包括分散或溶解在内部流体中的至少一种介质，优选地至少包括分散和/或溶解在内部流体中的第一介质、以及分散和/或溶解在内部流体中的第二介质。

微流体芯片可包含一个或多个以下特征，这些特征可单独使用或根据任何技术上可能的组合使用：

-用于引入流体的供应区；

-用于收集流体的收集区；和

-沿主方向延伸的工作通道。

微流体芯片优选用作生物测定系统，其递送液滴，每个液滴包含单个生物实体和能够与该单个生物实体相互作用的至少一个介质。单个生物实体的例子是单个细胞，诸如单个免疫细胞，特别是单个产生抗体的细胞或单个产生细胞因子的细胞。该细胞可以是原核(即细菌)细胞或真核细胞。“免疫细胞”是指产生抗体的细胞(即，B细胞)或产生细胞因子的细胞(诸如T细胞、NK细胞或中性粒细胞)。所述单个细胞可以被溶解或不被溶解。在细胞分选方法中，通常用包含缓冲液的培养基在第一流体的液滴中分离产生蛋白质的细胞。在第二流体中，存在第二介质，该第二介质包括涂覆或嫁接有捕获剂的珠粒或细胞，这种细胞在其膜表面或细胞内表达其捕获剂。将第一流体和第二流体混合，并且通常将其添加到第三流体(诸如亲脂性或亲氟性流体)中，以形成乳液液滴。亲氟流体(第三流体)可以是来自3M Novec公司的HFE氟化油。

在条形码方法中，微流体芯片优选地包括具有捕获系统阵列的腔室，捕获系统允许液滴保持在适当的位置。该腔室通常包括入口和出口。

在细胞分选方法和条形码方法中使用的珠粒可以是磁性珠粒。磁珠粒可以由铁或任何其他磁性材料制成。磁性珠粒之所以有用，是因为它们可以在磁激励下将信号集中，即它们可以形成易于检测的链条(line)。或者，它们可以是水凝胶珠粒。

细胞分选方法可以使用表达捕获剂的细胞代替涂覆有捕获剂的珠粒，表达捕获剂的细胞也称为报告细胞(reporter cell)。所述细胞可以在其表面表达捕获剂，或者可以在所述细胞内表达捕获剂。它们也可以是被诸如荧光抗体的荧光捕获剂标记的细胞。这样的细胞可以是原核或真核细胞。原核细胞特别是细菌细胞。它们可能是野生型或工程型细胞。所谓工程型，是指野生型细胞被人工基因突变修饰。工程型细胞可以是GMO(GeneModifiedOrganism，基因修饰生物体)。报告细胞优选是CHO细胞，诸如CHO-S细胞。

捕获剂包括但不限于抗体、抗体衍生物(诸如scFv)及其抗原结合片段、蛋白质、代谢产物以及核酸序列。在一些实施方式中，将珠粒官能化，使得它们可以与捕获剂共价或非共价结合。在一些实施方式中，特别是对于细胞分选方法，珠粒包含例如共价偶联至珠粒表面的链霉亲和素，珠粒因此被构造成形成具有生物素化组分的复合物，生物素化组分例如为生物素化抗体或其抗原结合片段。在另一个实施方式中，珠粒涂覆有单层链霉亲和素。在一些实施方式中，珠粒在其表面上包含官能化基团或能够被官能化的化学基团。在一个实施方式中，珠粒由至少一种有机聚合物制成，该有机聚合物能够在水中形成水凝胶。所述聚合物可以包含丙烯酰胺、聚乙二醇或丙烯酸酯单体。在一些实施方式中，珠粒可以是亲水的，并且带正电或带负电。在实施方式中，可以向珠粒预加载一种或多种捕获剂到其表面上，使得它们可以与微流体芯片一起使用以捕获目标蛋白质，目标蛋白质诸如为抗体和/或其序列，所述一种或多种捕获剂对于该抗体和/或其序列是特定的。

优选地，在细胞分选方法中，捕获剂是抗体、抗体衍生物或其抗原结合片段。

优选地，在条形码处理方法中，捕获剂是核酸序列。核酸序列是指DNA(包括cDNA)或RNA。优选地，捕获剂是DNA寡核苷酸，诸如包含2至40个核苷酸(nt)、优选5至25个核苷酸作为捕获部分的DNA寡核苷酸。它们以条形码或特定的DNA序列而与功能性DNA相连，用于测序和/或文库扩增。

通常，可以使用的DNA寡核苷酸具有以下结构：

(L)-(T7)-(Sbs12/Sbs3)-(BCD)-(GSPs)

其中：

L是允许例如在曝光下切割条形码序列的连接件，L可以存在或不存在；

T7是体外转录(IVT)序列，可以存在或不存在。其在某些应用中用于IVT，或用作PCR引物；

Sbs12和Sbs3是依诺米那(illumina)测序。它们用于依诺米那(illumina)测序平台的文库制备。它们允许从有义链或反义链开始读取每条DNA链。

BCD是一种条形码索引，用于生成条形码构造的多样性，特别是从包含限定数量的不同的B、限定数量的不同的C和限定数量的不同的D的组合物中获得的条形码。

该条形码序列可能有所不同，因为其长度可以变化并且/或者索引的数量可以变化(例如，可以是ABCDEFG)；和

GSP(基因特异性引物)是用于mRNA捕获的序列。它可以是用于捕获具有相同条形码的VH和VL序列的逆转录(RT)引物，但也可以是更通用的引物。在这样的例子中，存在于第二液滴中的每个珠粒包含具有上述结构的DNA寡核苷酸，其中BCD是单个条形码，GSP是一半的VH引物和一半的VL引物之间的融合序列。

优选地，条形码处理方法使用适于分子生物学技术的试剂混合物。所述分子生物学技术可以是液滴逆转录(dRT)、液滴聚合酶链反应(dPCR)、dRT-PCR、定量液滴RT-PCR(qdRT-PCR)、液滴体外转录(dIVT)、液滴DNA第二链合成(dDNA SSS)、液滴滚环扩增(dRCA)。试剂混合物可以包含引物组，其优选是基因特异性的、序列特异性的，但是也可以适用于随机引物或整个引物(例如基于某些mRNA的多聚腺苷酸拖尾的“全RNA-seq”)。

根据第一实施方式，优选地，微流体芯片是细胞分选仪。在这种情况下，它适用于细胞分选方法。因此，当形成乳液液滴时，使生物实体与被涂覆或嫁接有捕获剂的珠粒接触，或者与在其表面或细胞内表达所述捕获剂的细胞接触。然后基于生物实体或其产物(诸如产生的抗体或细胞因子)与涂覆有或嫁接有捕获剂的珠粒、或细胞(该细胞在其表面或该细胞内表达捕获剂)的结合来识别相关的液滴(即包含诸如产生抗体的细胞或产生细胞因子的细胞的生物实体)。可以回收每个液滴中的单个生物实体(诸如单个产生抗体的细胞或单个产生细胞因子的细胞)并进行进一步分析。

因此，根据本发明的细胞分选方法包括以下步骤：

-引入乳液液滴，该乳液液滴包含产生蛋白质的细胞(优选为免疫细胞，更优选为产生抗体或细胞因子的细胞)以及涂覆有捕获剂的珠粒或在细胞表面或细胞内表达捕获剂的细胞，所述乳液液滴可选地预先大量地培养到本发明的微流体芯片中；和

-基于特定的光学信号分选产生目标蛋白质的细胞。

“预先大量培养”是指在形成乳液液滴之后，将在包含缓冲液的培养基中的包括细胞(诸如免疫细胞，优选产生抗体或细胞因子的细胞)的第一流体、以及包含涂覆或嫁接有捕获剂或一种细胞(该细胞在其膜表面或该细胞内表达捕获剂)的第二流体混合并培养。将第一流体和第二流体添加到第三流体(诸如亲脂性或亲氟性流体)中，以形成乳液液滴。然后，进行培养。培养持续足以允许产生的蛋白质与捕获剂结合的时间，例如持续数小时，例如1小时至6小时。

根据另一个实施方式，根据本发明的细胞分选方法包括以下步骤：

-将包含细胞(在该细胞表面或细胞内表达捕获剂)或涂覆有捕获剂的珠粒或之一以及产生蛋白质的细胞(优选是免疫细胞，更优选是产生抗体或细胞因子的细胞)的乳液液滴引入根据本发明的微流体芯片；

-在允许蛋白质分泌的条件下培养所得芯片；和

-基于特定的光学信号分选产生目标蛋白质的细胞。

根据第二个实施方式，优选地，微流体芯片是用于分离目标核酸序列特别是一些目标DNA序列的阵列。所述液滴阵列包括孔(well)，其中每个孔包括单个生物实体的液滴。所述生物实体可以是细胞，优选是免疫细胞，优选是产生抗体的细胞。

然后，使包含珠粒(优选地包含单个珠粒)和试剂混合物的第二液滴与每个孔接触。生物实体的液滴与包含珠粒的液滴之间发生融合(即混合)。“融合”是指将生物实体的液滴与第二液滴(即包含珠粒)混合，以便形成更大的独特的得到的液滴。所述融合可以通过施加高电压来实现。试剂混合物允许溶解生物实体，特别是目标细胞。由于试剂混合物，融合允许溶解诸如免疫细胞的生物实体，从而使存在于生物实体中的目标核酸与存在于珠粒上的捕获剂之间发生连接。然后由于生物实体的目标核酸序列和涂覆或嫁接有捕获剂的珠粒的结合而识别相关的孔(即包含诸如目标细胞的生物实体)。然后，可以识别和回收每个液滴中的单个生物实体(诸如单个产生抗体的细胞)，并且也可以回收目标核酸序列。

替代地，根据另一个实施方式，在第二种替代物中存在报告细胞，而不是珠粒和试剂混合物。所述报告细胞如上所述，用于细胞分选方法。这将与功能测定相对应：实际上，生物实体与报告细胞发生反应的每个孔将被识别出。

因此，本发明的条形码方法包括：

-将包含细胞的乳液液滴引入本发明的微流体芯片中，其中每个液滴包括单个细胞；

-将第二液滴放在每个乳液液滴上，其中第二液滴包括限定数量的由捕获剂涂覆的珠粒(优选是单个珠粒)和试剂混合物，以使每个第二液滴和每个乳液液滴之间融合，并将目标核酸序列递送进该融合物。通常，如果目标核酸序列存在于细胞中，它将与存在于珠粒上的捕获剂连接；和

-捕获并可选择地对目标核酸序列进行条形码编码；

-然后可选择地回收融合的液滴。

现在将详细描述根据本发明的制造微流体芯片的方法。

“溶胶-凝胶溶液”通常是指包含一种或多种金属或类金属分子前体和一种或多种有机溶剂的溶液。

“呈现浮雕图案并且在整个模具上具有不同的厚度的模具”是指具有浮雕图案的模具，该浮雕图案通常与纳米或微米通道互补(即，其中厚度在整个模具范围内不同)。优选地，模具的浮雕图案包括突起，使得步骤b)的胶凝后的溶胶-凝胶溶液包括微通道或纳米通道。所述模具称为主模具；它是要制备的微流体芯片的模具。优选地，它是具有1μm至1mm高度的浮雕图案的模具。优选地，模具包含环氧型负性近紫外光致抗蚀剂或聚二甲基硅氧烷材料系列的材料。一组常用的环氧型负性近紫外光致抗蚀剂材料是八官能环氧化酚醛清漆树脂，尤其是基于以Shell Chemical的

SU-8环氧树脂制成的SU-8系列光致抗蚀剂的光致抗蚀剂材料。所述直接在溶液中且即用的市售树脂由Microchem出售。SU-8系列光致抗蚀剂材料之所以受欢迎，是因为它可以以相对较低的成本提供相对厚膜(通常为500nm至1mm)的光致抗蚀剂。除了是相对厚膜的光致抗蚀剂材料外，SU-8还因为其相对较高的热稳定性(对于交联或曝光后的光致抗蚀剂材料，玻璃化温度大于200℃)而非常适合用作电镀模具。

通常，根据本发明的方法在步骤a)之前还包括制备模具的步骤。

用于制备模具的方案可以如文件“SU-8 2000，永久性环氧树脂负性光致抗蚀剂，加工指南”中所述(可通过以下链接访问：http://www.microchem.com/pdf/SU-82000DataSheet2025thru2075Ver4.pdf)。

通常，可以使用环氧型负性近紫外光致抗蚀剂系列的材料(即SU-8光致抗蚀剂材料)通过以下步骤制备：

-基体预处理：在施加光致抗蚀剂之前清洁并干燥基体。通常可以使用piranha湿蚀刻(使用H₂SO₄和H₂O₂)清洁基体，然后用去离子水冲洗；或使用反应离子蚀刻(RIE)；

-涂覆：在充分的旋转条件下用光致抗蚀剂涂覆基体；

-边缘珠粒去除(EBR)：在旋转涂覆方法步骤中，光致抗蚀剂的堆积可能发生在基体边缘上。为了最大程度地减少电炉的污染，应去除厚的珠粒。可以通过在顶部或底部的晶片边缘使用一小股溶剂(诸如MicroChem的EBRPG)来完成此操作；

-软烘烤：对流烤箱烘烤(通常在65℃，然后在95℃)的时间取决于要获得的厚度；

-曝光：为了在光致抗蚀剂中获得竖直侧壁，可以使用长波通滤光片消除350nm以下的紫外线。

-曝光后烘烤(PEB)：通常在曝光后直接进行；

-显影：使用乳酸乙酯或双丙酮醇等溶剂进行显影；

-冲洗并干燥；和

-可选择地硬烘烤或去除。

可以使用的模具也可以是PDMS模具。这样的材料更具柔性并且容易剥离。

本发明的方法依次包括：

a)将由正硅酸乙酯制成的溶胶-凝胶溶液浇铸到具有浮雕图案并且在整个模具上具有不同厚度的模具上；

b)使所述溶胶-凝胶溶液胶凝；

c)将b)中获得的凝胶脱模并干燥，以获得固体玻璃；和

d)将所述固体玻璃键合到载体上，以获得微流体芯片。

通常，在步骤a)之前，本发明的方法包括通过以下方法制备溶胶-凝胶溶液的步骤：

i)将正硅酸乙酯(TEOS)与乙醇和水混合；

ii)将盐酸加入步骤i)的混合物中。优选地，TEOS∶乙醇：水：盐酸的摩尔比为约0.8-1.2∶9-11∶2.5-4.5∶0.002-0.005；

iii)在至少60℃的温度下回流步骤ii)的混合物以水解正硅酸乙酯。通常，温度在65℃至100℃之间。优选地，步骤iii)持续1小时至2小时；

iv)在环境温度下冷却步骤iii)的所得混合物；和

v)将氢氧化铵的水溶液加入到步骤iv)的冷却的混合物中，并搅拌以获得溶胶-凝胶溶液。

在Huang&Chou、Ceramics International 29(2003)、485-493(关于二氧化硅膜的旋转涂覆工艺的研究)中代表性地描述了溶胶-凝胶溶液的制备。

以上步骤i)至iii)对应于“溶胶”合成，即对应于水解反应。

以上步骤iv)和v)对应于缩聚反应。

将用TEOS制备的溶胶-凝胶溶液浇铸到所需的模具上；这对应于步骤a)。所述溶液仍然是液体。

将用TEOS制备的溶胶-凝胶溶液浇铸在待制造的物体的模具上，旨在胶凝和干燥后构成微流体芯片。因此，该浇铸步骤或浇注步骤不同于注入步骤。

然后，将所述溶胶-凝胶溶液胶凝(步骤b)。

然后将b)中获得的凝胶脱模并干燥；这是步骤c)。干燥步骤可以根据两种不同的方式进行：

-蒸发干燥：将b)中获得的凝胶一经脱模，就在受控环境(例如氮气)下干燥2-3周；或者

-超临界干燥：将b)中获得的凝胶置于密封室中并使其处于压力下。然后添加二氧化碳，并形成超临界流体(即，同时为液态和气态)。这防止在材料中出现约束，从而防止出现裂纹。

在步骤c)的最后，获得固体玻璃。

然后，将所述固体玻璃键合到载体上，以获得微流体芯片；这是步骤d)。

优选地，步骤d)中使用的载体是载玻片，或由使用溅射技术涂覆有二氧化硅层的材料制成的基体。

优选地，步骤d)包括用于玻璃或由二氧化硅涂覆的基体的阳极键合、或等离子体键合或热键合。

优选地，对于细胞分选仪和细胞分选方法，步骤d)包括用于由二氧化硅涂覆的基体的阳极键合，该阳极键合用诸如铌酸锂或钽酸锂基体的压电材料执行。优选地，步骤d)在室温(约20℃)至400℃之间的温度下进行。

术语“阳极键合”用于表示本发明的固体玻璃基体与玻璃或硅载体的键合，该玻璃或硅载体优选地是具有高含量碱金属氧化物的由二氧化硅涂覆的基体。

当两个基体在接触之后被加热并且施加电场时，发生键合。

在阳极键合期间，氧化物解离，并且移动的碱离子被电场驱动进入玻璃，从而特别在硅-玻璃界面处形成富氧层。氧离子被电场驱动到硅表面并产生硅的氧化。所得的键合强度非常高，并且该方法是不可逆的。

本发明还涉及可通过根据本发明的方法获得的微流体芯片。

所述微流体芯片可用于筛选蛋白质，优选是筛选抗体。优选地，所述微流体芯片是静态液滴阵列或液滴分选仪，优选地是表面声波液滴分选仪。

-最后，本发明还涉及一种筛选产生目标蛋白质的细胞，优选是筛选免疫细胞的方法，该方法包括以下步骤：

-将包含由捕获剂涂覆的珠粒或在细胞表面或细胞内表达捕获剂的细胞中的一者和产生蛋白质的细胞(优选是免疫细胞)的乳液液滴引入本发明的微流体芯片中；

-如果需要，在允许蛋白质分泌的条件下培养所得芯片；和

-基于特定的光学信号分选产生目标蛋白质的细胞。

所述信号可以是荧光或发光的。例如，在激光激发之后，可以使用诸如光电倍增管或雪崩光电二极管的合适的带通滤波器检测到。

优选地，每个乳液液滴包括(i)单个细胞，优选单个免疫细胞，更优选单个产生抗体或产生细胞因子的细胞，和(ii)优选单个由捕获剂涂覆的珠粒或由捕获剂涂覆的磁性珠粒的悬浮液，或单个表达捕获剂的细胞。

替代地，本发明还涉及用于识别目标核酸序列的方法，其包括以下步骤：

-将包含细胞的乳液液滴引入本发明的微流体芯片中，其中每个液滴包括单个细胞；

-将第二液滴放置在每个乳液液滴上，其中第二液滴包括限定数量的由捕获剂涂覆的珠粒(优选是单个珠粒)和试剂混合物，以获得每个第二液滴和每个乳液液滴的融合，并将目标核酸序列递送在所述融合物中。可以通过施加电压来实现融合；和

-捕获并可选择地对目标核酸序列进行条形码编码。

Claims (15)

1.一种用于制造包含从溶胶-凝胶溶液获得的固体材料的微流体芯片的方法，所述方法依次包括：

a)将由正硅酸乙酯制成的溶胶-凝胶溶液浇铸到模具上，所述模具具有浮雕图案并且在整个模具上具有不同厚度；

b)使所述溶胶-凝胶溶液胶凝；

c)将b)中获得的凝胶脱模并干燥，以获得固体玻璃；和

d)将所述固体玻璃键合到载体上，以获得微流体芯片。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述模具包含环氧型负性近紫外光致抗蚀剂系列材料或聚二甲基硅氧烷材料。

3.根据权利要求1至2中任一项所述的方法，还包括在步骤a)之前的制备模具的步骤。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，所述模具的所述浮雕图案包括突起，使得步骤b)的胶凝后的溶胶-凝胶溶液包括微通道或纳米通道。

5.根据权利要求1至4中任一项的方法，其中，步骤d)中使用的载体是载玻片或由用溅射技术涂覆二氧化硅层的材料制成的基体。

6.根据权利要求1至5中任一项的方法，其中，步骤d)包括用于玻璃或由二氧化硅涂覆的基体的阳极键合，或等离子体键合或热键合。

7.根据权利要求6所述的方法，其中，用诸如铌酸锂或钽酸锂基体的压电材料对由二氧化硅涂覆的基体进行阳极键合。

8.根据权利要求1至7中任意一项所述的方法，其中，所述方法还包括，在步骤a)之前，通过以下方法制备溶胶-凝胶溶液的步骤：

i)将正硅酸乙酯与乙醇和水混合；

ii)将盐酸加入步骤i)的混合物中；

iii)在至少60℃的温度下回流步骤ii)的混合物以水解正硅酸乙酯；

iv)在环境温度下冷却步骤iii)的所得混合物；

v)将氢氧化铵的水溶液加入到步骤iv)的冷却的混合物中，并搅拌以获得溶胶-凝胶溶液。

9.通过根据权利要求1至8中任一项所述的方法获得的微流体芯片。

10.根据权利要求9所述的微流体芯片用于筛选蛋白质，优选筛选抗体的用途。

11.根据权利要求10所述的用途，其中，所述微流体芯片是静态液滴阵列或液滴分选仪，优选地是表面声波液滴分选仪。

12.一种筛选产生目标蛋白质的细胞，优选是筛选免疫细胞的方法，包括以下步骤：

-将包含由捕获剂涂覆的珠粒和在细胞表面或细胞内表达捕获剂的细胞中的一者和产生蛋白质的细胞的乳液液滴引入根据权利要求9所述的微流体芯片，所述乳液液滴被可选择地预先大量培养；和

-基于特定的光学信号分选产生目标蛋白质的细胞。

13.一种筛选产生目标蛋白质的细胞，优选是筛选免疫细胞的方法，包括以下步骤：

-将包含由捕获剂涂覆的珠粒和在细胞表面或细胞内表达捕获剂的细胞中的一者和产生蛋白质的细胞的乳液液滴引入根据权利要求9所述的微流体芯片中；

-在允许蛋白质分泌的条件下培养所得芯片；和

-基于特定的光学信号分选产生目标蛋白质的细胞。

14.根据权利要求12或13所述的方法，其中，每个乳液液滴包括(i)单个细胞，和(ii)涂覆有捕获剂的单个珠粒或涂覆有捕获剂的磁性珠粒的悬浮液，或表达捕获剂的单个细胞。

15.一种用于识别目标核酸序列的方法，包括以下步骤：

-将包含细胞的乳液液滴引入根据权利要求9所述的微流体芯片中，其中每个液滴包括单个细胞；

-将第二液滴放置在每个乳液液滴上，其中第二液滴包含限定数量的由捕获剂涂覆的珠粒以及试剂混合物，以获得每个第二液滴和每个乳液液滴之间的融合，并将目标核酸序列递送在融合物中，其中由捕获剂涂覆的珠粒优选是单个珠粒；和

-捕获并可选择地对目标核酸序列进行条形码编码；

-可选择地回收融合的液滴。