JP2023554399A - マイクロ流体方法及びシステム - Google Patents
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- C12Q2563/159—Microreactors, e.g. emulsion PCR or sequencing, droplet PCR, microcapsules, i.e. non-liquid containers with a range of different permeability's for different reaction components
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
- C12Q2563/179—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties the label being a nucleic acid
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2565/00—Nucleic acid analysis characterised by mode or means of detection
- C12Q2565/60—Detection means characterised by use of a special device
- C12Q2565/629—Detection means characterised by use of a special device being a microfluidic device
Abstract
本発明は、マイクロ流体システムに関し、システムは、a)オリゴヌクレオチドの少なくとも第1の群を含む固体支持体を含み、i.前記群の各オリゴヌクレオチドは、第1の種類、第2の種類及び/または更なる種類の核酸配列を含み、ii.前記第1の種類の核酸配列はバーコード配列であり、iii.同じバーコード配列を含むオリゴヌクレオチドは、前記固体支持体上のオリゴヌクレオチドの群にまとめられ、iv.第1のオリゴヌクレオチド群及び更なるオリゴヌクレオチド群は前記固体支持体上で空間的に分離されており、b)前記固体支持体上のオリゴヌクレオチド群のうちの前記1つ以上の群は、マイクロ流体システムの別個のリザーバー内にあり、c)1つ以上のリザーバーは、チャネルを介して流体、細胞、化学物質及び/または微小液滴にアクセス可能であり、d)前記固体支持体上にオリゴヌクレオチドの群を含む各リザーバーはまた、マイクロ流体液滴のためのトラップである。【選択図】図1
Description
本発明は分子生物学の分野に属し、マイクロ流体デバイス内の液滴を使用して表現型を遺伝子型に割り当てるための方法に関する。本発明はまた、マイクロ流体工学の分野に属し、マイクロ流体デバイス、その製造方法、及び生物学的アッセイを実施するためのその使用を包含する。
単細胞解析法における最近の進歩、例えば、Klein(Klein et al.2015,Cell 161(5):1187-1201)及びMacosko(Macosko et al.2015,Cell 161(5):1202-1214)によって開発された単一細胞RNA-seq法、またはRotem(Rotem et al.2015,Nat.Biotechnol.33(11):1165-1172)によって考案された単一細胞エピジェネティクスChIP-seq法により、対応するバルク法よりも高い処理量で細胞集団の解剖が可能になる(Jaitin et al.2014,Sciences 343(6172):776-779)。しかし、シークエンシングデータでは細胞または細胞系のエンドポイント測定のみが可能であり、得られた遺伝情報を補完及び増強するために含まれる、細胞の動態データまたは表現型に関する情報を含める必要性が高まっている。
機能アッセイの基礎となる方法は大量に十分に確立されており、Agrestiにより単一細胞分析方法に適応されている(Agresti et al.2010,PNAS 107(9):4004-4009)。液滴マイクロ流体工学は、表現型アッセイを構築するための単一細胞カプセル化、液滴選別、液滴融合などの要素を使用したハイスループットスクリーニングなどの複数の課題に対処できる、一連の方法を提供する。例えば、Mazutisは、免疫グロブリンを捕捉する磁気ビーズを使用して、目的の標的に対する抗体を産生するB細胞を含む液滴を選択するための方法を記載している(Mazutis et al.2013,Nat.Prot.8:870-891)。前記方法のバリエーションはEyerによって公開されており、単一の磁性ビーズが複数の磁性ナノ粒子に置き換えられ、すべての細胞が確実に分析しやすくなる(Eyer et al.2017,Nat.Biotechnol.35(10):977-982)。これら2つの例は、液滴内の抗体の結合事象をハイスループットで実証する。
創薬のための理想的なスクリーニングシステムでは、目的の表現型の選択は単一工程のプロセスではなく、様々な表現型アッセイの組み合わせに基づく、通常は、エンドポイント測定もしくは動力学的いずれかの結合及び/または機能の読み出し値に基づく表現型の段階的な選択からなる。
すべての表現型スクリーニングにおける重要な工程は、レポーター系(例えば、抗体、化学染料、または遺伝的にコード化された蛍光タグ)の選択である。蛍光顕微鏡では、各細胞において、比較的少数のレポーター系のみが同時に監視できる。レポーター系を多重化する及び/または追加の反復実験を実行することで、細胞応答を調べて有用な情報を提供するために使用される、読み出し値の数を増やすことができる。ただし、レポーター系の数を増やすと、スクリーニングにかかるコストと時間が増加し得る。
更に、細胞間相互作用/認識及び/または化合物の機能の表現型機能に関する第1の工程でハイスループットで情報を提供し、遺伝子型解析の第2の工程で単一細胞レベルで情報を提供するには、表現型と遺伝子型の両方を単一細胞レベルで情報に基づいて結合させる必要がある。
マイクロ流体工学は、様々な範囲の生物学的及び化学的アッセイをハイスループットで実行するための強力な技術として登場した。この技術は、バルク溶液をピコからナノリットルサイズの多数の独立した区画またはマイクロリアクターに分割することにより、複雑な試料のハイスループット分析を可能にする。
しかしながら、当技術分野で公知の方法を使用することによって、個々の試料の分析後の回収を達成することは困難である。更に、これらのデバイス内での試薬の混合には複雑な構造が必要であるか、または区画化の前に一括で行われることが多く、それにより、初期反応生成物が開始標的と共局在化することが妨げられ得る。
実際、表現型スクリーニングと単一細胞レベルでの遺伝子型解析を組み合わせたマイクロ流体方法は、液滴の識別精度に欠けている。特に、単一細胞特異的表現型と共に単一細胞特異的遺伝子型を回復することは非常に困難であるため、任意選択で機能的読み出し値と組み合わせて、目的の表現型を有する細胞をスクリーニングし、特定の細胞遺伝子型情報を回復するための方法が非常に望ましい。
本明細書に開示される方法は、当技術分野で公知のマイクロ流体方法に影響を及ぼす上記の問題を解決することを目的としている。
本発明者らは、本明細書に開示される方法を実行するためのマイクロ流体デバイスを開発し、このデバイスでは、単一細胞液滴が個々の区画に捕捉される。次に、単一細胞液滴は、表現型情報(タンパク質発現レベル、細胞経路の活性化/活性、イオンチャネル/GPCR活性)と遺伝子型またはエピジェネティック情報を結合する他の液滴と選択的に融合され、これにより、目的の表現型を有する単一細胞の遺伝子型を決定することが可能になる。
本発明は、マイクロ流体システムに関し、システムは、
a)オリゴヌクレオチドの少なくとも第1の群を含む固体支持体を含み、
i.前記群の各オリゴヌクレオチドは、第1の種類、第2の種類及び/または更なる種類の核酸配列を含み、
ii.前記第1の種類の核酸配列はバーコード配列であり、
iii.同じバーコード配列を含むオリゴヌクレオチドは、前記固体支持体上のオリゴヌクレオチドの群にまとめられ、
iv.第1のオリゴヌクレオチド群及び更なるオリゴヌクレオチド群は前記固体支持体上で空間的に分離されており、
b)前記固体支持体上のオリゴヌクレオチド群のうちの前記1つ以上の群は、マイクロ流体システムの別個のリザーバー内にあり、
c)1つ以上のリザーバーは、チャネルを介して流体、細胞、化学物質及び/または微小液滴にアクセス可能であり、
d)前記固体支持体上にオリゴヌクレオチドの群を含む各リザーバーはまた、マイクロ流体液滴のためのトラップである。
a)オリゴヌクレオチドの少なくとも第1の群を含む固体支持体を含み、
i.前記群の各オリゴヌクレオチドは、第1の種類、第2の種類及び/または更なる種類の核酸配列を含み、
ii.前記第1の種類の核酸配列はバーコード配列であり、
iii.同じバーコード配列を含むオリゴヌクレオチドは、前記固体支持体上のオリゴヌクレオチドの群にまとめられ、
iv.第1のオリゴヌクレオチド群及び更なるオリゴヌクレオチド群は前記固体支持体上で空間的に分離されており、
b)前記固体支持体上のオリゴヌクレオチド群のうちの前記1つ以上の群は、マイクロ流体システムの別個のリザーバー内にあり、
c)1つ以上のリザーバーは、チャネルを介して流体、細胞、化学物質及び/または微小液滴にアクセス可能であり、
d)前記固体支持体上にオリゴヌクレオチドの群を含む各リザーバーはまた、マイクロ流体液滴のためのトラップである。
本発明はまた、オリゴヌクレオチドを細胞に付着させる方法にも関し、方法は、
a)本発明によるマイクロ流体システムを提供することと、
b)第1の細胞を第1の液滴にカプセル化することと、
c)前記細胞を前記リザーバー内に捕捉することと、
d)溶解組成物を含む第2の液滴を前記第1の液滴と融合させ、それによって前記固体支持体のオリゴヌクレオチドが前記細胞内の核酸に付着できるようにすることと、を含む。
a)本発明によるマイクロ流体システムを提供することと、
b)第1の細胞を第1の液滴にカプセル化することと、
c)前記細胞を前記リザーバー内に捕捉することと、
d)溶解組成物を含む第2の液滴を前記第1の液滴と融合させ、それによって前記固体支持体のオリゴヌクレオチドが前記細胞内の核酸に付着できるようにすることと、を含む。
本発明は更に、単一細胞の表現型及び/または遺伝子型を決定するための方法に関し、方法は、
a)少なくとも1つのマイクロ流体チャネルと、複数のリザーバーを含む少なくともコレクターシステムとを備えるマイクロ流体デバイスを提供することと、
b)第1の種類の複数の細胞のうちの少なくとも1つの細胞を第1の種類の液滴に別々にカプセル化することと、
任意選択で、複数の第2の種類の細胞からの第2の種類の細胞を第1の種類の液滴のそれぞれに共カプセル化することと、
c)マイクロ流体デバイスのマイクロ流体チャネル内に第1の種類の複数の液滴を流し、マイクロ流体デバイスの各リザーバー内に第1の種類の液滴を捕捉し、任意選択で、リザーバー内に含まれる液滴内の表現型を分析することと、
d)マイクロ流体チャネル内に第2の種類の複数の液滴を流し、各リザーバー内に第2の種類の第2の液滴を捕捉することと、
e)リザーバー内で第1の種類の液滴と第2の種類の液滴を融合させることと、
f)e)で得られた融合液滴内で少なくとも1つの反応を実行し、反応の読み出し値を決定することと、を含む。
a)少なくとも1つのマイクロ流体チャネルと、複数のリザーバーを含む少なくともコレクターシステムとを備えるマイクロ流体デバイスを提供することと、
b)第1の種類の複数の細胞のうちの少なくとも1つの細胞を第1の種類の液滴に別々にカプセル化することと、
任意選択で、複数の第2の種類の細胞からの第2の種類の細胞を第1の種類の液滴のそれぞれに共カプセル化することと、
c)マイクロ流体デバイスのマイクロ流体チャネル内に第1の種類の複数の液滴を流し、マイクロ流体デバイスの各リザーバー内に第1の種類の液滴を捕捉し、任意選択で、リザーバー内に含まれる液滴内の表現型を分析することと、
d)マイクロ流体チャネル内に第2の種類の複数の液滴を流し、各リザーバー内に第2の種類の第2の液滴を捕捉することと、
e)リザーバー内で第1の種類の液滴と第2の種類の液滴を融合させることと、
f)e)で得られた融合液滴内で少なくとも1つの反応を実行し、反応の読み出し値を決定することと、を含む。
本発明は更に、本発明によるシステムを製造する方法に関する。
本発明はまた、本発明のマイクロ流体システムと、任意選択で、本発明の方法を実施するための説明書とを含む、キットにも関する。
本発明は、マイクロ流体システムに関し、システムは、
a)オリゴヌクレオチドの少なくとも第1の群を含む固体支持体を含み、
i.前記群の各オリゴヌクレオチドは、第1の種類、第2の種類及び/または更なる種類の核酸配列を含み、
ii.前記第1の種類の核酸配列はバーコード配列であり、
iii.同じバーコード配列を含むオリゴヌクレオチドは、前記固体支持体上のオリゴヌクレオチドの群にまとめられ、
iv.第1のオリゴヌクレオチド群及び更なるオリゴヌクレオチド群は前記固体支持体上で空間的に分離されており、
b)前記固体支持体上のオリゴヌクレオチド群のうちの前記1つ以上の群は、マイクロ流体システムの別個のリザーバー内にあり、
c)1つ以上のリザーバーは、チャネルを介して流体、細胞、化学物質及び/または微小液滴にアクセス可能であり、
d)前記固体支持体上にオリゴヌクレオチドの群を含む各リザーバーはまた、マイクロ流体液滴のためのトラップである。
a)オリゴヌクレオチドの少なくとも第1の群を含む固体支持体を含み、
i.前記群の各オリゴヌクレオチドは、第1の種類、第2の種類及び/または更なる種類の核酸配列を含み、
ii.前記第1の種類の核酸配列はバーコード配列であり、
iii.同じバーコード配列を含むオリゴヌクレオチドは、前記固体支持体上のオリゴヌクレオチドの群にまとめられ、
iv.第1のオリゴヌクレオチド群及び更なるオリゴヌクレオチド群は前記固体支持体上で空間的に分離されており、
b)前記固体支持体上のオリゴヌクレオチド群のうちの前記1つ以上の群は、マイクロ流体システムの別個のリザーバー内にあり、
c)1つ以上のリザーバーは、チャネルを介して流体、細胞、化学物質及び/または微小液滴にアクセス可能であり、
d)前記固体支持体上にオリゴヌクレオチドの群を含む各リザーバーはまた、マイクロ流体液滴のためのトラップである。
本発明の文脈において、「マイクロ流体システム」という用語は、少なくとも1つのマイクロ流体チャネルを含むデバイスを指す。前記チャネルは、材料(ガラス、シリコン、セラミック紙、ヒドロゲル、またはPDMS、TPE、PS、PEGDA、PFEP/PFA/PFPE、PU、PMMA、PC、COPもしくはCOC及び前記材料の複合材などのポリマー)へのミリング、エッチング、アブレーション、エンボス加工または成形を含む、当技術分野で公知の任意の方法によって作製することができる。
マイクロ流体システムはまた、選別システムを備えていてもよい。マイクロ流体細胞選別システムは当業者に公知であり、例えばWyatt Schieldsによって記載されている(Wyatt Schields et al.2015,Lab Chip 15(5):1230-1249)。
本発明の文脈において、「オリゴヌクレオチド」という用語は、リボ核酸(RNA)もしくはデオキシリボ核酸(DNA)のいずれかのオリゴマーまたはポリマー、ならびに非天然オリゴヌクレオチドを指す。非天然オリゴヌクレオチドは、天然には存在しない核酸塩基配列を含むオリゴマーもしくはポリマー、または天然に存在する核酸塩基、糖もしくは糖間結合の機能的等価物を含む種である。
一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、第1の種類、第2の種類及び/または第3の種類の群から選択される1つ以上の核酸配列を含み得る。一実施形態では、第1の種類の核酸配列はバーコード配列であり得る。本明細書で使用される場合、バーコード配列は核酸分子を同定するために使用され、シークエンシングにより目的の核酸分子に結合した特定のバーコードが明らかになり得る。本発明の文脈において、目的のオリゴヌクレオチドを同定するには、バーコード配列の少なくとも一部が配列特異的イベントにおいて認識されれば十分である。
本発明によるシステムでは、各群のバーコード配列は既知であり、固体支持体上の位置は既知である。
本発明によるシステムでは、システムの少なくとも一部は光学的に透明であり、前記リザーバー内に捕捉された細胞(複数可)の光学的分析を可能にする。理想的には、透明部分はオリゴヌクレオチド群に隣接している。
本発明によるシステムでは、オリゴヌクレオチドの各群は、104~1011個の間のオリゴヌクレオチドを含む。群が約109(+/-25%)個を有する場合が好ましい。
本発明によるシステムでは、細胞トラップは、以下の約10μm~200μm(+/-25%)の寸法の空洞である。この寸法は、1つの細胞または2つの細胞、いくつかの実施形態では3つ以上の細胞を含む、好ましくは細菌のような小さな細胞と神経細胞のような大きな細胞を含む液滴を収容するように設定される。
本発明の文脈において、「細胞」という用語は、任意の真核細胞を指す。真核細胞には、上皮細胞、免疫細胞(リンパ球、好中球及び単球/マクロファージなど)、造血細胞、骨髄細胞、骨芽細胞、心筋細胞、肝細胞及び神経細胞が含まれるが、これらに限定されない。また、本明細書で使用する場合、特に明記しない限り、「細胞」という用語は「単一細胞」を指す。
本発明の文脈において、「リザーバー(複数可)」という用語は、材料がデバイス内で所定の位置に一時的にまたは永続的に保存/配置されるような、材料(例えば、流体、細胞、粒子、液滴)の任意の物理的位置を指す。リザーバーは、材料の流動、接続、相互作用、接触、相互の通信を妨げ得るか、または妨げないこともある。
本発明の一実施形態では、固体支持体上のオリゴヌクレオチド群は物理的にリザーバー内にあるのではなく、リザーバーに対応して固体支持体上に位置すると解釈されるべきであることが理解される。したがって、オリゴヌクレオチド群を含む前記固体支持体上にはリザーバーは存在しない。これはまた、本明細書に提供される図からも明らかである。
本発明の別の実施形態では、オリゴヌクレオチド群はリザーバー内に物理的に想到され得る。
本発明によるシステムでは、オリゴヌクレオチド群の空間的分離は少なくとも100nmであり、1,000μm以下(+/-25%)である。
本発明者は、この空間的分離が、スポットされた異なるDNAまたは異なるリザーバー(液滴)間の汚染を避けるために不可欠であることを見出した。このような汚染により、表現型と遺伝子型の連鎖の誤った割り当て、または複数の液滴への割り当てが生じ、その結果、表現型/遺伝子型の連鎖を正確に特定できなくなる。また、考慮すべき別のパラメータは液滴のサイズである。これに関して、特許請求の範囲よりも空間的分離を減少させると、逆転写(RT)反応の効率など前記液滴内で起こる化学的-機械的-物理的事象または反応が損なわれることになる。
本発明によるシステムでは、群内のオリゴヌクレオチドは、ユニバーサル配列であり得る第2の種類の核酸配列と、ハイブリダイズ配列またはプライマー配列であり得る更なる配列の種類と、ハイブリダイズ配列による更なる配列の種類との核酸配列を含む。各群のオリゴヌクレオチドは同一である。図5を参照のこと。通常、それらは5’プライム末端に付着している。理想的には、オリゴヌクレオチドは、i)バーコーディング、ii)プライミング、またはiii)ハイブリダイズなどの異なる目的を果たす異なる配列部分を有する。
本発明はまた、オリゴヌクレオチドを細胞の生体分子に付着させる方法にも関し、方法は、
a)本発明によるマイクロ流体システムを提供することと、
b)第1の細胞を第1の液滴にカプセル化することと、
c)前記細胞液滴を前記リザーバー内に捕捉することと、
d)溶解組成物を含む第2の液滴を前記第1の液滴と融合させ、それによって前記固体支持体のオリゴヌクレオチドが前記細胞内の核酸に付着できるようにすることと、を含む。
a)本発明によるマイクロ流体システムを提供することと、
b)第1の細胞を第1の液滴にカプセル化することと、
c)前記細胞液滴を前記リザーバー内に捕捉することと、
d)溶解組成物を含む第2の液滴を前記第1の液滴と融合させ、それによって前記固体支持体のオリゴヌクレオチドが前記細胞内の核酸に付着できるようにすることと、を含む。
厳密に言えば、オリゴヌクレオチドは細胞表面に付着していない。それは、細胞内の核酸及び/または細胞内の生体分子に付着する。細胞をオリゴヌクレオチドの近くに導く。本明細書で使用する場合、「細胞内の生体分子にオリゴヌクレオチドを付着させる」という表現は、細胞内の選択された標的生体分子にオリゴヌクレオチドを「結合」または「ハイブリダイズ」するプロセスを指す。本明細書で使用される場合、「生体分子」という用語は、任意のオリゴヌクレオチド、一本鎖または二本鎖のDNAまたはRNAを指す。これらのオリゴヌクレオチドは、次いで、前記細胞内の生体分子、好ましくは核酸に結合する。核酸は、DNA、RNA、tRNA、mRNA、ゲノムDNA、リボソームRNA、クロマチンなどから選択され得る。細胞は、結合の過程で溶解(dissolved)/溶解(lysed)する場合もあれば、溶解しない場合もある。オリゴヌクレオチドが細胞由来の核酸に結合する好ましい実施形態では、細胞は溶解され、次いで結合された核酸は更に分析される。
本明細書において「液滴」とは、一般に、体積の尺度を指す。本発明の文脈において、「液滴」とは、第2の流体によって取り囲まれた第1の流体の隔離された部分を指す。本発明のプロセスとの関連で使用される「液滴」という用語には、単一細胞、試薬もしくは融合液滴、または複数の前記液滴を含む液滴などの第1の種類の液滴、第2の種類の液滴、第3の種類の液滴、第4の種類の液滴が含まれる。
「液滴」は、5nL未満、例えば4nL未満、3nL未満、好ましくは3nL未満の平均体積を有し得る。いくつかの実施形態では、平均体積は、3nL未満、2.5nL未満、2nL未満、1.5nL未満、1nL未満、0.5nL未満(例えば、0.1nL~3nL、0.5nL~3nL、1nL~3nL)、通常、1pL、10pL、20pL、30pL、50pL、0.1nL、0.5nL、1nL、1.2nL、1.4nL、1.6nL、1.8nL、2.0nL、2.2nL、2.4nL、2.6nL、2.8nL、3nLである。
したがって、「融合液滴」は、10nL未満の平均体積を有し得る。いくつかの実施形態では、平均体積は、9nL未満、8nL未満、7nL未満、6nL未満、5nL未満、4nL未満、3nL未満、2nL未満、1nL未満、0.5nL未満、例えば、0.1nL~10nL、0.1nL~8nL、0.1nL~6nL、0.1nL~5nL(例えば、0.1nL~3nL、0.5nL~5nL、0.5nL~3nL、1nL~3nL)、通常、0.1nL、0.5nL、1nL、1.2nL、1.4nL、1.6nL、1.8nL、2.0nL、2.2nL、2.4nL、2.6nL、2.8nL、3nL、4nLまたは5nL(例えば、11pL~8000pL)である。
第1の液滴と第2の液滴の融合が起こった後、細胞間相互作用、1つ以上の物質への曝露、1つ以上の染料もしくは1つ以上の抗体への曝露、細胞溶解、核酸ライゲーション、核酸増幅、核酸ハイブリダイゼーション、核酸シークエンシング及び/またはレポーターもしくは生存率アッセイを含む群から選択される反応工程が実行されることが好ましい。
これが本発明の本質である。単一細胞がトラップ内に配置されると、それを分析することができる。分析は、(1)顕微鏡読み出し値を使用した細胞(複数可)の表現型分析、及び(2)固体支持体に結合し、単一細胞の核酸に付着できるオリゴヌクレオチドの空間バーコードによって支援される。本発明の文脈において、「空間バーコード」という用語は、マイクロ流体チップまたはスライドの表面上のバーコードの特定の位置を指す。
好ましくはかつ更には、1つ以上のリザーバー内の1つ以上の細胞の表現型が分析され、
a.液滴を融合する前、
b.液滴を融合した後、
c.請求項4による反応の前、または、
d.請求項4による反応の後に前記表現型分析が行われる。
a.液滴を融合する前、
b.液滴を融合した後、
c.請求項4による反応の前、または、
d.請求項4による反応の後に前記表現型分析が行われる。
好ましくは、前記固体支持体に付着したオリゴヌクレオチドのバーコードは、特定のリザーバー内の特定の細胞を識別するために使用される。オリゴヌクレオチドはまた、PCRなどの反応にも使用され得る。この場合、増幅産物には、単一細胞からのバーコード及び配列が含まれる。次に、細胞の表現型をバーコードに結合し、それによって固体支持体上の位置を結合することができる。
理想的には、表現型の分析は、蛍光撮像、明視野顕微鏡法、蛍光顕微鏡法、共焦点顕微鏡法、タイムラプス分析、シークエンシング、qPCR、等温増幅、及び、例えば、RTqPCRの群から選択される少なくとも1つの方法を含む。
本発明は更に、単一細胞の表現型及び/または遺伝子型を決定するための方法に関し、方法は、
a)少なくとも1つのマイクロ流体チャネルと、複数のリザーバーを含む少なくともコレクターシステムとを備えるマイクロ流体システムを提供することと、
b)第1の種類の複数の細胞のうちの少なくとも1つの細胞を第1の種類の液滴に別々にカプセル化することと、
任意選択で、複数の第2の種類の細胞からの第2の種類の細胞を第1の種類の液滴のそれぞれに共カプセル化することと、
c)マイクロ流体デバイスのマイクロ流体チャネル内に第1の種類の複数の液滴を流し、マイクロ流体デバイスの各リザーバー内に第1の種類の液滴を捕捉し、任意選択で、リザーバー内に含まれる液滴内の表現型を分析することと、
d)マイクロ流体チャネル内に第2の種類の複数の液滴を流し、各リザーバー内に第2の種類の第2の液滴を捕捉することと、
e)リザーバー内で第1の種類の液滴を第2の種類の液滴と融合させることと、
f)e)で得られた融合液滴内で少なくとも1つの反応を実行し、反応の読み出し値を決定することと、を含む。
a)少なくとも1つのマイクロ流体チャネルと、複数のリザーバーを含む少なくともコレクターシステムとを備えるマイクロ流体システムを提供することと、
b)第1の種類の複数の細胞のうちの少なくとも1つの細胞を第1の種類の液滴に別々にカプセル化することと、
任意選択で、複数の第2の種類の細胞からの第2の種類の細胞を第1の種類の液滴のそれぞれに共カプセル化することと、
c)マイクロ流体デバイスのマイクロ流体チャネル内に第1の種類の複数の液滴を流し、マイクロ流体デバイスの各リザーバー内に第1の種類の液滴を捕捉し、任意選択で、リザーバー内に含まれる液滴内の表現型を分析することと、
d)マイクロ流体チャネル内に第2の種類の複数の液滴を流し、各リザーバー内に第2の種類の第2の液滴を捕捉することと、
e)リザーバー内で第1の種類の液滴を第2の種類の液滴と融合させることと、
f)e)で得られた融合液滴内で少なくとも1つの反応を実行し、反応の読み出し値を決定することと、を含む。
本明細書に開示される、遺伝子型を目的の所与の表現型に割り当てるためのマイクロ流体方法は、当技術分野で公知の方法に比べていくつかの利点を提示する。本発明による方法の1つの利点は、前記方法が、個々の各細胞の正確な表現型/遺伝子型の関係を保持しながら、相互作用、認識、標識、染色、撮像及び/または顕微鏡法に基づく表現型(アゴニスト及び/またはアンタゴニストアッセイのための機能的読み出し値を含むが、これらに限定されない)評価、その後に続く遺伝子型アッセイ(内部メッセンジャー分子の測定を含む)を可能にすることである。本方法の更なる利点は、2段階の表現型測定を使用することによって信頼性の向上を提供することである。最後に、本方法は、第1の表現型液滴に第2の表現型液滴を添加することにより、様々な機能アッセイを実行するのに適応できるため、優れた多用途性により特徴付けられる。
前述の利点は、本発明を特徴付ける態様及び実施形態において以下に開示される。本発明の実施態様は、実施例及び図の項で提供される。
本発明の一態様によれば、少なくとも1つの液滴において遺伝子型を目的の表現型に割り当てるためのマイクロ流体方法が提供され、方法は、第1の種類の複数の細胞のうちの少なくとも1つの細胞を第1の種類の複数の液滴内にカプセル化する工程を含み、第1の種類の各液滴は単一細胞を含むか、または細胞を含まない。任意選択で、第2の種類の細胞は、第1の種類の液滴内で第1の種類の細胞と共に共カプセル化され得る。本発明による方法は、第1の種類の単一細胞、及び任意選択で、追加で第2の種類の単一細胞を含む第1の種類のそのような液滴を、マイクロ流体デバイスのチャネル内に注入及び/または流すことを更に含む。マイクロ流体デバイスは、複数のリザーバーを含む少なくとも1つのコレクターシステムを更に備える。そうして、第1の種類の液滴は、そのようなリザーバー内に別々に捕捉され得る。任意選択で、撮像または顕微鏡法を、限定ではなく使用して、第1の種類の液滴をリザーバー内で分析し、第1の種類の細胞または第1及び第2の種類の細胞の表現型を決定することができる。本発明の方法による表現型を決定するための更なる方法は、本明細書に記載される。
続いて、1つ以上の反応を実行するための試薬を含む第2の種類の液滴は、マイクロ流体デバイスのチャネルに注入及び/または流され、その結果、第2の種類の液滴は、マイクロ流体デバイスのリザーバーのそれぞれの内部に別々に捕捉され得る。したがって、マイクロ流体デバイスの各リザーバーは、第1の種類の1つの液滴と第2の種類の1つの液滴を含む。第1の種類の液滴は、当技術分野で公知の方法に従って、第2の種類の液滴と融合(fused)または融合(merged)され得る。前記液滴の融合後、1つ以上の反応が開始または起こり得、その結果、検出可能な1つ以上の読み出し値またはシグナルが得られる。このような読み出し値は、遺伝子型判定反応、表現型判定反応または両方の組み合わせであり得る。したがって、本発明の一実施形態では、第2の液滴は、遺伝子型判定及び/または表現型判定反応に必要な試薬を含む。
マイクロ流体デバイスのリザーバーは、底部に及び固体支持体に接続された複数のオリゴヌクレオチドを含み得る。このようなオリゴヌクレオチドは、少なくとも第1の群に分類することができ、各群は、デバイスの他のリザーバーに含まれる他の群から空間的に分離されている。同じリザーバー内に含まれるオリゴヌクレオチドの群は、第1の種類の同じ核酸配列を含む可能性があり、これはバーコード配列であり得る。マイクロ流体デバイスの異なるリザーバーは、同じまたは異なるバーコード配列を含む可能性がある。一実施形態では、各リザーバーは、前記リザーバーに固有のバーコードを有するオリゴヌクレオチドを含み、同じ特定のリザーバー内に含まれるか、またはその中に位置する前記オリゴヌクレオチドに付着したオリゴヌクレオチド及び/または核酸の同定を可能にする。したがって、本発明による方法は、特定のリザーバーと特定のバーコードとの関連付け、したがって前記リザーバー内で検出された細胞の特定の表現型との関連付けを容易にする。したがって、特定のリザーバー内に捕捉された細胞の遺伝子型が決定された場合、検出されたバーコード配列を特定のリザーバーで検出された表現型に関連付けることができる。
当業者であれば、マイクロ流体液滴を調製するための技術を知っているはずである。マイクロ流体液滴内に細胞をカプセル化する技術は、例えば、Mazutis,et al.2013,Nat.Protocol 8:870-891に記載されている。一例では、液滴は、注入前に別個のマイクロ流体デバイス内で調製される。
本発明の一態様による方法を実行するために、マイクロ流体チップは、複数のリザーバー、トラップまたは空洞を含む少なくとも1つのコレクターシステムを更に備える。本発明の文脈において、「リザーバー」、「トラップ」及び「空洞」という用語は、本明細書では互換可能に使用され得る。本発明の文脈において、少なくとも1つの液滴は、浮力、流体力学的または物理的な力によって、前記複数のリザーバーのうちの1つのリザーバー内に移動する。好ましくは、前記液滴収集工程は、浮力によって実行される。
本発明の一態様による方法を実行するためのマイクロ流体チップの更なる特徴は、この項の後半で提供される。
本明細書に開示される方法は、第1の種類の単一細胞、及び、任意選択で、第2及び/または第3の種類の単一細胞を含む液滴を流動させることを包含する。細胞型は、形態学的または表現型の特徴に基づいて細胞を識別するために使用される分類である。本明細書で使用される場合、「流動させる」という用語は、単一細胞を含むマイクロ流体チップ内を流れる複数の液滴を指す。前記細胞は、それらの細胞型、特定の遺伝的または遺伝子発現の違い、それらの起源または特定の細胞機能に応じて、第1の種類、第2の種類または第3の種類であり得る。
本明細書に開示される方法では、第1の種類の液滴は、第1の種類のカプセル化細胞、または第1及び第2の種類の共カプセル化細胞を含み得る。
更なる実施形態では、液滴は細胞を含まないが、細胞またはその画分に由来する生体分子を含む。
第2の種類の液滴は、第1の種類の液滴を第2の種類の液滴と融合させることによって取得され得る、融合した液滴内の反応または検出可能な事象を実行、誘発、可能化または支援するための試薬を含んでもよい。
本発明の文脈において、第1の種類の細胞は、細菌細胞(例えば、E.coli及びB.subtilis)であってもよい。それは、これらに限定されないが、上皮細胞、免疫細胞(例えば、リンパ球、好中球及び単球/マクロファージ)、造血細胞、骨髄細胞、骨芽細胞、心筋細胞、肝細胞及び神経細胞、酵母(例えば、Saccharomyces及びPichia)のような真核生物であってもよい。それは昆虫細胞であってもよい。それは、真核細胞もしくは原核細胞、またはウイルス、または擬似粒子(例えば、DNA形成粒子、DNA複合体またはDNA凝集体としての小分子凝集体)であってもよい。ここには制限はない。好ましい細胞には、B細胞、T細胞、NK細胞、NKT細胞、マクロファージまたは樹状細胞などの免疫細胞が含まれる。
本発明の文脈において、目的の表現型は、表面マーカーの存在、表面マーカーの組成の変化、活性化または遮断活性、細胞内修飾、代謝産物、ペプチド、タンパク質などの分子の産生、細胞生存率、細胞相互作用、細胞置換などの細胞挙動であり得る。
本発明の文脈において、目的の遺伝子型は、転写物mRNA、tRNA、siRNA、miRNA、piRNA、ゲノムDNA、ミトコンドリアDNAなどのDNA、修飾DNAなどのエピゲノミクス、クロマチン構造、修飾RNA、またはそれらの分子の構造組織であり得る。
別の実施形態では、第1の種類の細胞はレポーター細胞であり得る。それとは異なり、第2の種類の細胞は、分泌細胞、好ましくは抗体分泌細胞であり得、前記抗体は、前記レポーター細胞によって提示される膜標的に対するものである。したがって、本発明の文脈において、第1または第2の種類の細胞は、第1の表現型を有し得る。同様に、第3の種類の細胞は、第2の表現型を有し得る。
本発明の一態様の別の実施形態によれば、第1の種類の細胞は抗体分泌細胞であり得、第2の種類の細胞はレポーター細胞であり得る。本明細書で使用する場合、「レポーター細胞」という用語は、最終的にレポーター系に作用する前記薬剤の機能的効果を指す、レポーター遺伝子、タンパク質もしくは脂質、または化学化合物を含む細胞を指す。
本発明の一態様の別の実施形態によれば、第1の種類の細胞はT細胞であり得、第2の種類の細胞は抗体提示細胞であり得る。
本明細書で使用される場合、「レポーター細胞」という用語は、発現すると、例えば、生物学的アッセイ、免疫アッセイ、放射免疫アッセイによって、または比色法、蛍光法、化学発光法によって容易に測定可能なレポーターシグナルを生成するレポーター遺伝子、タンパク質、脂質または化学化合物を含む細胞を指す。
本発明の一態様の一実施形態によれば、細胞液滴を含む、または共カプセル化された細胞液滴を含む単一細胞は、10pL~10nLの範囲の体積を有する。
本発明による方法の一実施形態では、液滴に含まれる第1の種類の各細胞は、分泌細胞用のカルセインAM及びレポーター細胞用のCellTracker Redなどの標識システムを使用することによって、液滴に含まれる第2の種類の別の細胞から区別され得る。更なる選択手段は、二次的な蛍光標識検出試薬、AlexaFluor647標識、Fc特異的抗IgG F(ab’)2(赤色蛍光)、または間接的検出(例えば、ストレプトアビジンにより、例えばビオチンと結合した試薬)を使用することによって表され得、レポーター細胞上の標的への免疫グロブリンの結合を視覚化し得る。
本発明の一実施形態では、細胞間相互作用、例えば、細胞上の膜に提示された標的に対する抗体を分泌するT細胞または形質芽細胞と共カプセル化された抗原提示細胞の複雑な分析を、ハイスループット様式で行うことができる。
重要なのは、細胞アッセイを液滴中で実行し、限定されないが、カルシウム流、サイクリックAMP、ベータ-アレスチン動員、内部移行、サイトカイン分泌、ケモカイン分泌、受容体二量体化、アクチン重合、細胞分裂、細胞周期の遮断もしくはリン酸化、MAPキナーゼの活性化、アポトーシス、壊死、顆粒、二多量体化アッセイ、細胞の表面及び/または内部での特定の分子の過剰発現及び提示を含む、化合物によって誘導される機能的応答を測定する。
分泌細胞及びレポーター細胞は共カプセル化され得、前記共カプセル化された細胞の数は、ポアソン分布を使用して推定され得る。本発明の文脈において、共カプセル化プロセスは、レポーター細胞のポアソン分布のラムダ値を0.5より大きくして、液滴内への分泌細胞及びレポーター細胞の50%を超える共カプセル化率を達成することによって実行される。あるいは、特別に設計されたデバイスを使用して、同じ結果またはより高いパフォーマンスを達成することもできる。
本発明の文脈において、第1の種類の液滴中の第1の種類の細胞、もしくは第1及び第2の種類の細胞のカプセル化または共カプセル化は、分析が実行される同じチップ内でもしくはオフチップで、または別のチップ内でもしくはマイクロ流体デバイス内で実行され得る。オフチップとは、マイクロ流体チップの外側の分離された領域を指し得る。結果として、一実施形態では、複数の液滴をオフチップ、例えば、試験管に保存し、前記複数の液滴をマイクロ流体チップ内に再注入することによって操作または分析することができる。
本発明による方法は、少なくとも1つのインキュベーション工程を含んでもよく、それは、第1もしくは第2の検出可能な事象または反応の発生を可能にするようにタイミングを調整することができる。
本明細書で使用される場合、「検出可能な事象」、「検出可能な反応」または「反応」という用語は、観察及び/または検出され得る任意の化学的-機械的-物理的事象または反応を指す。表現型アッセイに応じて、定性的及び/または定量的であり得る任意の適切なアッセイ法を使用して、選択されたパラメータについて少なくとも1つの単一細胞をアッセイすることができる。適切な検出方法には、分光学的方法、電気的方法、流体力学的方法、撮像方法、顕微鏡的方法、レポーターアッセイ、発光もしくは蛍光を検出するための方法、及び/または生物学的方法が含まれ得る。「検出可能な事象」、「検出可能な反応」、「反応」または「アッセイ」という用語は、本明細書では互換可能に使用され得る。
反応または化学的-機械的-物理的事象は、色素もしくは当業者に公知の他の任意の試薬による細胞の染色もしくは染色の不在、増幅反応、リアルタイムもしくはqPCR反応、逆転写反応、ライゲーション、生存率アッセイもしくは毒性アッセイ、シークエンシング反応、抗体の検出及び/または抗原との結合、蛍光反応もしくはレポーターアッセイ、死滅アッセイ、分子の分泌、細胞間相互作用、細胞から細胞への物質の交換、形態反応の変化、粘度及び/または凝集の測定、分子生成物の合成、蛍光の発光などであり得る。
上で報告したように、本明細書に開示される方法の利点の1つは、その多用途性にある。したがって、第2の反応または反応工程に使用される試薬を含む第3の種類の液滴の更なる流れも、マイクロ流体チップ内に注入され、少なくとも1つの細胞を含み、コレクターシステムの空洞またはリザーバー内に収集される少なくとも1つの液滴と接触し、第1の表現型及び第2の表現型を含む少なくとも1つの融合液滴を生成することができる。
本発明の一態様の別の実施形態によれば、第3の種類の単一細胞液滴は、10pL~10nL、好ましくは50pL~1nLの範囲の体積を有する。
本発明の一態様の一実施形態によれば、融合液滴は、20pL~10nL、好ましくは50pL~1nLの範囲の体積を有する。
本発明の一態様の別の実施形態によれば、第2の種類または第3の種類の単一細胞液滴は、細胞を染色するための1つ以上の色素、蛍光基質を含むシークエンシング反応用の試薬、逆転写試薬、溶解緩衝液、PCRもしくはqPCR試薬、レポーター及び/または生存率アッセイ用の試薬、及び/または抗体の結合を検出するための試薬などを含んでもよい。
シークエンシング及び/または逆転写反応は、溶解細胞のゲノム全体もしくはトランスクリプトームを表す遺伝子、またはエフェクター機能の指標として使用されるRNAもしくはDNAのパネル、またはRNAもしくDNAのランダムなセット、またはエピジェネティック情報(タンパク質、DNA、RNA及び構造的配置)、RNAとDNAの組み合わせ、前記細胞からもしくは前記区画からのタンパク質を分析することができる。
第1の表現型を有する細胞、及び、任意選択で、リザーバー内に収集または捕捉された第2の表現型を有する共カプセル化された細胞も含む第1の種類の液滴は、任意選択で、撮像され得、その後、遺伝子型判定反応を実行するための試薬を含む第2の種類の液滴の流れによって接触され得、それによって、第2の種類の液滴が前記リザーバー内に捕捉され、その後前記第1の種類の液滴と融合するのを促進する。第1の種類の液滴と第2の種類の液滴とが融合した後、遺伝子型判定作用が起こり得る。
本発明の一実施形態によれば、第2の種類の液滴は、少なくとも第1の反応のための試薬を含むことができる。別の実施形態では、第2の種類の液滴は、第1及び第2の反応のための試薬を含むことができる。別の実施形態では、第2の種類の液滴は、第1、第2及び少なくとも第3の反応のための試薬を含むことができる。第1、第2及び更なる任意の反応は、融合した液滴内で連続した順番でまたは並行して実行することができる。
本発明の一実施形態によれば、第3の種類の液滴は、少なくとも第2の反応のための試薬を含むことができる。前記第3の種類の液滴は、マイクロ流体チャネルを通って、両方とも同じリザーバー内に捕捉された、第1の種類の液滴と第2の種類の液滴を融合させることによって得られた融合液滴を含む、リザーバーに流すことができる。前記第3の種類の液滴は、その後、前記融合液滴内で第1及び/または第2の反応が発生した後、前記融合液滴を含む前記リザーバー内に捕捉され得る。前記第3の種類の液滴は、前記リザーバー内で前記「融合液滴」と融合させることができ、第2及び/または第3の反応は起こり得る。
本発明の別の実施形態によれば、第2の種類の液滴は、クロマチン消化のための試薬(MNAse、DNAse、タグマンターゼを含むが、これらに限定されない)を含むことができ、第3の種類の液滴は、リガーゼ(または、トランスポザーゼ)を含むシークエンシング反応のための試薬及び緩衝液試薬を含むことができ、その結果、前記液滴が、バーコード化DNAがスポットされた表面または固体支持体に接触すると、目的のクロマチン断片の捕捉が可能になる。これらのクロマチン断片は、ヌクレオソームのモノ、ジ、トリまたはアレイを表し得る。それらは、10bp~数Mbの長さの消化されたDNAを表し得る。
本発明の別の実施形態では、目的の表現型は、レポーター細胞からの下流シグナル伝達カスケードの活性化/阻害を含む、エフェクター機能(結合、交差反応性、特異性、アゴニスト、アンタゴニスト、アロステリック調節因子)を有する抗体の産生;それぞれT細胞及びAPCからのTCR-MHCペプチド複合体によって誘導されるサイトカイン及び/または顆粒(例えば、パーフォリン、グランザイム)の産生及び/または細胞表面マーカー(例えば、CD69、CD137、CD40L、OX40、PD1)の発現の誘導を含み得、それは、細胞代謝(例えば、インターロイキン、サイトカイン、ケモカインの産生、アポトーシスまたは壊死)の活性化/阻害を含み得る。
遺伝子型判定反応を実施するための試薬は、当業者に公知である。一般に、前記試薬は、蛍光基質、逆転写試薬及び溶解緩衝液、ならびにバーコード化ライブラリーの任意の供給源、オリゴヌクレオチド、プライマー、バーコード、ポリメラーゼ、リガーゼ、トランスポザーゼ及び増幅試薬を含み得るが、これらに限定されない。本明細書で使用する場合、「遺伝子型判定」という用語は、生化学的方法を使用して単一細胞の核酸配列を決定するプロセス、及び/または細胞ゲノム/トランスクリプトームの構造的特徴を決定するプロセスを指す。
液滴を融合するための方法もまた、例えばMazutisによって記載されているように、当技術分野で公知である(Mazutis et al.2012,Lab Chip 12,1800-1806)。前記方法は、ペルフルオロオクタノールなどの界面活性剤の添加、特殊なマイクロ流体チャネル形状の提供、及び/または電場もしくは音響波の適用を含むことができる。本発明の文脈において、融合工程は、電界を適用することによって実行されることが好ましい。融合工程は、チップの所定の領域で実行され、前記所定の領域に接触する液滴を選択的に融合することができる。「融合」及び「融合する」という用語は、本明細書では互換可能に使用され得る。
本発明の文脈において、液滴融合は、2kHz~40kHzの範囲の周波数、及び500V~20000Vの範囲の電圧を有する電界を、前記事象に関与した2つの液滴間で80%~100%の融合効率を達成するのに必要な時間印加することによって達成される。例えば、液滴間の表面張力、界面活性剤の濃度、融合する液滴の体積などに応じて、より高いまたはより低い周波数及び電圧も同様に適用でき得る。
他の実施形態によれば、融合は、レーザー/光誘起、化学的及び音響融合によって実行されるが、これらに限定されない。本発明の一態様の一実施形態によれば、融合工程(i)は、複数の電極を備える電気的構成によって実行される。本発明の文脈において、前記複数の電極は、好ましくは、厚さ300~600オングストロームのインジウムスズ酸化物から行及び列形式でガラスアレイチップ上に作製される。電極は、フォトリソグラフィー、及びガラスチップ上にインジウムスズ酸化物をスパッタリングすることによって構造化することができる。本発明の一態様の更なる実施形態によれば、融合工程(i)は、マイクロ流体システムの上側に行形式で及び下側に列形式で配置され、またはその逆で配置された複数の電極を含む電気的配置によって実行される。集中電場を生成するための例示的なデバイスは、帯電防止ガンであってもよい。
本発明者らは、行インデックスと列インデックスの定義された組み合わせを活性化にすることによって、液滴を選択的に融合できることを見出した。この手順は、スクリーニングプロセスに追加の選択工程を提供するため、特に有利である。
また、液滴の選択的融合は、潜在的に目的の表現型を有し、遺伝子型情報が望まれる第2または第3の液滴内容物を第1の液滴に放出及び/またはアクセス可能にするために使用される。更に、例えば、その後のシークエンシング及びクローニング、発現及び検証の更なる処理のための機能的抗体の選択により、二次スクリーニングに望ましい特性を備えた真のヒットを得る確率が高まる。
液滴融合に続いて、限定されないが、細胞または細胞の成分の蛍光染色、シークエンシングまたは配列捕捉反応、増幅またはライゲーション反応、レポーターアッセイなどの様々な1つ以上の反応は、前記液滴内で開始及び/または実行され得る。
本発明による第1及び/または第2の検出可能な事象の検出は、染色、色素、標識、酵素、基質、補助因子及び/または特異的結合パートナー(SBP)の使用を含み得る。検出しようとする目的の表現型に応じて、当業者であればどの方法が適し得るかを知っている。本発明の文脈において、第2の検出可能な事象の検出は、好ましくは、各リザーバーについて、少なくとも1つのリザーバーに位置する少なくとも1つの融合液滴に含まれる目的の表現型のマッピングをもたらす分光学的方法を使用することによって実行される。
本発明の一態様の別の実施形態によれば、融合工程(i)はエレクトロウェッティングによって制御される。
本明細書で使用する「エレクトロウェッティング」という用語は、前記液滴の動き及び/または形状を制御するために、チップ表面に対する液滴の濡れ性を変えるための電場の使用を指す。本発明の文脈において、エレクトロウェッティングを使用して、ポンプ、バルブ、チャネル及び/または他の類似の流体処理機構を利用する必要なく、チップ表面上の融合液滴の広がりを制御することができる。エレクトロウェッティングの例は、例えば、Pollack et al.2000,Applied Physics Letters,77,1725(100mMのKCl溶液の液滴(0.7~1.0μl)を40~80Vの電圧で隣接する電極間に移送し、最大20Hzの電極切り替え速度と平均速度30mm/秒で液滴の反復移送を達成した、個別のマイクロ液滴の迅速操作用マイクロアクチュエータを記載する);Fouillet et al.,Proceedings of ASME ICNMM2006 4 International Conference on Nanochannels,Microchannels and Minichannels June19-21,2006,Limerick,Ireland;Paper No.ICNMM2006-96020(64nlのマイクロ流体液滴内でのリアルタイムPCR(ポリメラーゼ連鎖反応)における誘電体エレクトロウェッティング(EWOD)の使用を記載する)に見出すことができる。
エレクトロウェッティングによって融合液滴の挙動を制御することは、マイクロ流体チップの表面にスポットされたバーコードヌクレオチド配列の液滴内への組み込みを可能にし得るため、重要である。液滴は、スポットされたDNAを含むスライドと親水性接触して入る。次に、液滴の内容物はスポットされたDNAと接触し、反応を引き起こすことができる。
いくつかの実施形態では、融合液滴は、スポットされたDNAに含まれる特定のDNA部位を切断することができる特異的な酵素を含む。この反応は、融合液滴内のバーコード化されたDNAを放出するために使用される。
一態様では、本発明は、2つの入口及び1つの出口、2,000個の空間バーコード(最大200k)ならびに対応するリザーバー(場合によっては、デバイスに統合された液滴メーカー設計及びノズルを含む)を含む、マイクロ流体チップまたはデバイスを提供する。
本発明の文脈において、マイクロ流体チップまたはデバイスは、異なる入口及び出口、ならびに入口及び出口の異なる組み合わせを含んでもよい。したがって、マイクロ流体チップまたはデバイスは、少なくとも1つの入口及び1つの出口を備え得る。
本明細書で使用される場合、「対応」という用語は、バーコードを含むスポットのチップ表面上の決定された位置を指す。本発明の文脈において、前記位置は、好ましくは、リザーバーの反対側のチップ表面の領域上に画定される。
別の実施形態によれば、各スポットは105を超えるオリゴヌクレオチド密度を含む。
別の実施形態によれば、各スポットは、10~200μmの範囲、好ましくは50~150μmの範囲、より好ましくは60~80μmの範囲の直径を有する。
本明細書で使用される場合、「スポット」という用語は、マイクロ流体チップの第1及び/または第2の表面の画定された領域を指し、ここで、第2の液滴は第1の液滴と接触し、流体の物理的または化学的パラメータ、例えば、温度またはイオン力を制御することによって、マイクロ流体チップの第1の表面及び/または前記第2の表面上に配置される複数の電極を活性化することによって合体/融合事象が引き起こされる。
一実施形態では、電場を使用して、第1の種類の少なくとも1つの液滴は、第2の種類の少なくとも1つの液滴と融合される。別の実施形態では、融合工程により、第1の種類の液滴と第2の種類の液滴との間の融合効率が80%~100%、好ましくは90%~100%となる。
本明細書に開示されるマイクロ流体チップは、選択されたマイクロ流体液滴の合体によってマイクロ流体チップの別個の異なる領域で反応を区画化するという利点を提供する。したがって、本発明によるマイクロ流体チップは、チップの異なる領域で同時に起こり得る生物学的アッセイの改善された制御を実現する。
ポリジメチルシロキサン(PDMS)は、ベースエラストマー及び硬化剤を含む2液性ポリマーである。PDMSの標準混合比は、ベースエラストマー10部及び硬化剤1部である。一実施形態では、第1のポリマー溶液は、エラストマーと硬化剤を5:1の比率で含む。本発明者らは、この比率が金型に望ましい機械的特性を与えることを見出した。
本発明による電気的構成を使用して液滴が融合すると、任意の適切な方法によってオリゴヌクレオチドをチップ表面から切断することができる。好ましくは、オリゴヌクレオチドは光切断によって切断される。
一実施形態では、バーコード配列は、マイクロ流体デバイスの1つ以上のリザーバーに固有であり得、したがって、それぞれのリザーバー内に捕捉され分析される単一細胞の識別を容易にし得る。マイクロ流体デバイスの固体支持体上の特定の位置にスポットされたバーコードをカスタマイズし、特異的に選択することによって、本方法は、前記特定の位置で検出された特定の表現型の同定、及び本明細書に記載の分析方法によって取得された遺伝情報との関連付けを容易にする。したがって、マイクロ流体デバイスの特定のリザーバー内に捕捉された単一細胞の表現型は、前記単一細胞の遺伝子型に関連付けることができる。
本明細書で使用される「核酸」という用語は、一般に、例えば天然に存在するプリンまたはDNAもしくはRNAで見出されるピリミジン塩基などの少なくとも1つの核酸塩基を含む、DNA、RNA、miRNA、またはその誘導体もしくは模倣物の少なくとも1つの分子または鎖を指す。「核酸」という用語は、「オリゴヌクレオチド」という用語を包含する。本明細書の核酸はまた、1つ以上のタンパク質に付着してもよい。
本明細書における「RNA」とは、mRNA、tRNA、rRNA、触媒RNA、siRNA、miRNA、piRNA、ncRNA、lncRNA及びアンチセンスRNAなどの機能性RNAを指すが、これらに限定されない。好ましい一実施形態では、RNAはmRNAを指す。
「オリゴヌクレオチド」という用語は、長さが約3~約500核酸塩基の少なくとも1つの分子を指す。例えば、オリゴヌクレオチドは、少なくとも3核酸塩基、少なくとも10核酸塩基、少なくとも30核酸塩基、少なくとも50核酸塩基、少なくとも100核酸塩基の長さを有し得る。場合によっては、オリゴヌクレオチドは、100核酸塩基以下、50核酸塩基以下などの長さを有し得る。これらのいずれかの組み合わせも可能であり、例えば、オリゴヌクレオチドの長さは、3~300核酸塩基、好ましくは3~200核酸塩基、より好ましくは3~100核酸塩基の間であり得る。
液滴中で実施される場合、本発明による方法は、リザーバー内で行われた反応工程の後に、チャネルの出口で融合した液滴を回収または収集する工程を更に含む。
別の態様によれば、本発明によるマイクロ流体システムを製造する方法が本明細書に開示され、方法は、
a.流体デバイスの設計を含むマスクの生成、
b.マスクに印刷された凹デザインを凸複製するための樹脂、好ましくはSU8の光活性化、
c.非光活性化樹脂用の適切な溶媒を使用して余分な樹脂を除去、
d.樹脂、好ましくはSU8型上のマイクロ流体システムのポリマー成形(PDMS)、
e.固化のためのポリマー反応、通常はPDMS重合、
f.成形し、固化したポリマーを型からはずすこと、
g.固化ポリマー(PDMS)上にホットエンボス加工されたCOC、
h.COCを型からはずすこと、
i.好ましくは熱シーリング、両面テープまたは任意の他のシーリング技術を使用して、オリゴを含むアレイとCOC流体部分とを組み立てることの工程を含む。
a.流体デバイスの設計を含むマスクの生成、
b.マスクに印刷された凹デザインを凸複製するための樹脂、好ましくはSU8の光活性化、
c.非光活性化樹脂用の適切な溶媒を使用して余分な樹脂を除去、
d.樹脂、好ましくはSU8型上のマイクロ流体システムのポリマー成形(PDMS)、
e.固化のためのポリマー反応、通常はPDMS重合、
f.成形し、固化したポリマーを型からはずすこと、
g.固化ポリマー(PDMS)上にホットエンボス加工されたCOC、
h.COCを型からはずすこと、
i.好ましくは熱シーリング、両面テープまたは任意の他のシーリング技術を使用して、オリゴを含むアレイとCOC流体部分とを組み立てることの工程を含む。
モデル2つの細胞株Jurkat(T細胞型)及びRamos(B細胞)から細胞配列を捕捉する。
Jurkat細胞とRamos細胞をカプセル化し選別するために、特許出願第WO2018167218A1号に記載されているように、Arbor bioscienceが提供するマイクロ流体チャンバーと予めスポットされたスライドのアセンブリで逆転写(RT)が実行された。
プロトコル
1 細胞の調製
- Jurkat細胞及びRamos細胞を収集し、1mLの1×PBSで2回、300gで6分間スピン洗浄し、その後、細胞を500μLの1×PBSに再懸濁する。
- CellTrace FarRed(0.5μL)でJurkat細胞を標識する。
- CellTrace Far Red+Yellow(0.25μL+0.25μL)でRamos細胞を標識する。
- 遮光して室温で30分間インキュベートする。
- 10%HI-FBSを含むRPMI培地を添加し、1×PBSで2回、回転及び洗浄する。
- Jurkat細胞を30μLのPBSに再懸濁し、Ramos細胞を200μLのPBSに再懸濁する。
- 細胞を数える:
Jurkat:4mLn/mL
Ramos:70mLn/mL
- 細胞混合物の調製(λ=1):
- 統合された液滴ジェネレーターとソーターを使用してパラメータにより細胞をカプセル化し、選別する。
水相:50μL/時、油1:500μL/時、油2(スペーサー):600μL/時。
選別パラメータ:赤色チャネル、6000Hz振幅、300V、200μs遅延、2ms選別時間に基づく選別。
- 約30,000個の液滴が選別されたら、収集出口をチャンバーに接続し、廃棄チャネルをEppendorfチューブで塞いで、水相を停止する。チャンバーを反転し、チューブ内で上昇する液滴をチャンバーの内部に到達するまで収集し、その後、チャンバーを顕微鏡台上に配置して、充填を観察する。
- オイル流量を約300μL/時に減少させる。
- ほとんどの液滴トラップが占有されたら、残りの液滴とクランプ出口を洗い流し、チャンバーを撮像ステーションに移動し、明視野、TRITC及びCy5チャネルで撮像する:Jurkat細胞-赤色のみ、Ramos-黄色(赤では低いが、それでも赤色で検出可能)。
1 細胞の調製
- Jurkat細胞及びRamos細胞を収集し、1mLの1×PBSで2回、300gで6分間スピン洗浄し、その後、細胞を500μLの1×PBSに再懸濁する。
- CellTrace FarRed(0.5μL)でJurkat細胞を標識する。
- CellTrace Far Red+Yellow(0.25μL+0.25μL)でRamos細胞を標識する。
- 遮光して室温で30分間インキュベートする。
- 10%HI-FBSを含むRPMI培地を添加し、1×PBSで2回、回転及び洗浄する。
- Jurkat細胞を30μLのPBSに再懸濁し、Ramos細胞を200μLのPBSに再懸濁する。
- 細胞を数える:
Jurkat:4mLn/mL
Ramos:70mLn/mL
- 細胞混合物の調製(λ=1):
水相:50μL/時、油1:500μL/時、油2(スペーサー):600μL/時。
選別パラメータ:赤色チャネル、6000Hz振幅、300V、200μs遅延、2ms選別時間に基づく選別。
- 約30,000個の液滴が選別されたら、収集出口をチャンバーに接続し、廃棄チャネルをEppendorfチューブで塞いで、水相を停止する。チャンバーを反転し、チューブ内で上昇する液滴をチャンバーの内部に到達するまで収集し、その後、チャンバーを顕微鏡台上に配置して、充填を観察する。
- オイル流量を約300μL/時に減少させる。
- ほとんどの液滴トラップが占有されたら、残りの液滴とクランプ出口を洗い流し、チャンバーを撮像ステーションに移動し、明視野、TRITC及びCy5チャネルで撮像する:Jurkat細胞-赤色のみ、Ramos-黄色(赤では低いが、それでも赤色で検出可能)。
2 RT混合:
- 液滴が出口の端に到達するまで、200μL/時+600μL/時の水及び油の流量でカプセル化する。
- チップ出口を流体チャンバー(本発明に従って組み立てられたチップ)に接続し、液滴がチップの中央に到達するまで油流量を1500μL/時に増加させる(水流を停止する)。
- 油流量を200μL/時に下げて、不要な液滴を洗い流す。
チャンバー内に余分な液滴がなくなったら、帯電防止ガンで液滴を融合させ、1分間トリガーし、その後200μL/時で10%PFOを用いて液滴を表面に融合させる。
- 融合前:
- 1.5mLのEppendorfチューブでチューブをクランプし、サーマルインキュベーター(プレートアダプター付き)に移す。
- インキュベーションプログラムの実行:37℃で10分、52℃で1.5時間、4℃で1時間。
- 100μLのTE緩衝液、100μLの10%PFO及び100μLのTE緩衝液、その後20μL水にAMPure1.0×を注入することにより、チャンバーからcDNAを溶出する。
- チップ出口を流体チャンバー(本発明に従って組み立てられたチップ)に接続し、液滴がチップの中央に到達するまで油流量を1500μL/時に増加させる(水流を停止する)。
- 油流量を200μL/時に下げて、不要な液滴を洗い流す。
チャンバー内に余分な液滴がなくなったら、帯電防止ガンで液滴を融合させ、1分間トリガーし、その後200μL/時で10%PFOを用いて液滴を表面に融合させる。
- 融合前:
- 1.5mLのEppendorfチューブでチューブをクランプし、サーマルインキュベーター(プレートアダプター付き)に移す。
- インキュベーションプログラムの実行:37℃で10分、52℃で1.5時間、4℃で1時間。
- 100μLのTE緩衝液、100μLの10%PFO及び100μLのTE緩衝液、その後20μL水にAMPure1.0×を注入することにより、チャンバーからcDNAを溶出する。
上記の工程は図7にも示されている。
Claims (15)
- マイクロ流体システムであって、前記システムは、
v.オリゴヌクレオチドの少なくとも第1の群を含む固体支持体を含み、
i.前記群の各オリゴヌクレオチドは、第1の種類、第2の種類及び/または更なる種類の核酸配列を含み、
ii.前記第1の種類の核酸配列はバーコード配列であり、
iii.同じバーコード配列を含むオリゴヌクレオチドは、前記固体支持体上のオリゴヌクレオチドの群にまとめられ、
iv.前記第1のオリゴヌクレオチド群及び前記更なるオリゴヌクレオチド群は前記固体支持体上で空間的に分離されており、
vi.前記固体支持体上のオリゴヌクレオチド群のうちの前記1つ以上の群は、前記マイクロ流体システムの別個のリザーバー内にあり、
vii.前記1つ以上のリザーバーは、チャネルを介して流体、細胞、化学物質及び/または微小液滴にアクセス可能であり、
viii.前記固体支持体上にオリゴヌクレオチドの群を含む各リザーバーはまた、マイクロ流体液滴のためのトラップである、前記システム。 - 前記各群の前記バーコード配列は既知であり、前記固体支持体上の位置は既知である、請求項1に記載のシステム。
- 前記システムの少なくとも一部は光学的に透明であり、前記リザーバー内に捕捉された細胞の光学的分析を可能にする、請求項1または2に記載のシステム。
- 前記オリゴヌクレオチドの各群は、104~1011個の間のオリゴヌクレオチドの分子を含む、請求項1~3に記載のシステム。
- 前記細胞トラップは、以下の10及び100μmの寸法の空洞である、請求項1~4に記載のシステム。
- オリゴヌクレオチド群の各空間的分離は少なくとも100nmであり、1,000μm以下である、請求項1~5に記載のシステム。
- 前記群内の前記オリゴヌクレオチドは、ユニバーサル配列であり得る第2の種類の核酸配列と、ハイブリダイズ配列による更なる配列の種類との核酸配列を含む、請求項1~6に記載のシステム。
- オリゴヌクレオチドを細胞、前記細胞の生体分子、または好ましくは前記細胞に含まれる核酸に付着させる方法であって、前記方法は、
a)請求項1~7のいずれかに記載のマイクロ流体システムを提供することと、
b)第1の細胞を第1の液滴にカプセル化することと、
c)前記細胞を前記リザーバー内に捕捉することと、
d)溶解組成物を含む第2の液滴を前記第1の液滴と融合させ、それによって前記固体支持体のオリゴヌクレオチドが前記細胞内の核酸に付着できるようにすることと、を含む、前記方法。 - 前記第1の液滴と前記第2の液滴の前記融合が起こった後、細胞間相互作用、1つ以上の物質への曝露、1つ以上の染料もしくは1つ以上の抗体への曝露、細胞溶解、核酸ライゲーション、核酸増幅、核酸ハイブリダイゼーション、核酸シークエンシング及び/またはレポーターもしくは生存率アッセイを含む群から選択される、反応工程が実行される、請求項8に記載の方法。
- 更には、前記1つ以上のリザーバー内の1つ以上の細胞の表現型が分析され、
a.前記液滴を融合する前、
b.前記液滴を融合した後、
c.請求項9による反応の前、または、
d.請求項9による反応の後に、前記表現型分析は行われる、請求項8に記載の方法。 - 前記固体支持体に付着した前記オリゴヌクレオチドの前記バーコードは、特定のリザーバー内の特定の細胞を識別するために使用される、請求項8~10に記載の方法。
- 前記固体支持体に付着した前記オリゴヌクレオチドは、請求項9に記載の反応工程で使用される、請求項8~11に記載の方法。
- 前記表現型の分析は、蛍光撮像、明視野顕微鏡法、蛍光顕微鏡法、共焦点顕微鏡法、シークエンシング、qPCRの群から選択される少なくとも1つの方法を含む、請求項10に記載の方法。
- 請求項1~7に記載のマイクロ流体システムと、任意選択で、請求項8~13に記載の方法を実行するための説明書と、を含むキット。
- 請求項1~7に記載のマイクロ流体システムの製造方法であって、前記方法は、
a.前記流体デバイスの設計を含むマスクの生成、
b.前記マスクに印刷された凹デザインを凸複製するための樹脂、好ましくはSU8の光活性化、
c.非光活性化樹脂用の適切な溶媒を使用して余分な樹脂を除去、
d.前記樹脂、好ましくはSU8型上の前記マイクロ流体システムのポリマー成形(PDMS)、
e.固化のためのポリマー反応、通常はPDMS重合、
f.前記成形し、固化したポリマーを型からはずすこと、
g.固化ポリマー(PDMS)上にホットエンボス加工されたCOC、
h.COCを型からはずすこと、
i.好ましくは熱シーリング、両面テープまたは任意の他のシーリング技術を使用して、オリゴを含む前記アレイと前記COC流体部分とを組み立てることの工程を含む、前記方法。
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