CN102586226B - 一种基于连续液滴操控的微流控芯片核酸纯化平台 - Google Patents

Abstract

本发明的目的是提供一种适于高通量研究要求的基于连续液滴操控的微流控芯片核酸纯化平台；其特征在于：该平台是由一个液滴生成区1、二个溶液添加区4、三个液滴混合区2、三个液滴分裂区3及相应的进样入口、出口6、磁铁池9组成；其中进样入口由四个水相进样入口8.1、8.2、8.3、8.4，三个油相进样入口7.1、7.2、7.3组成；出口由三个废液池5.1、5.2、5.3，收集池6组成；磁铁池9内放置磁铁；该平台由上下两层（聚二甲基硅氧烷）PDMS通过等离子体封接，并将磁铁放置在封接好的平台磁铁池9内而成，其中上层PDMS含有通道、液池，下层PDMS基板用于封闭通道和液池。

Description

一种基于连续液滴操控的微流控芯片核酸纯化平台

技术领域

本发明涉及微流控芯片技术，特别提供了一种基于连续液滴操控的微流控芯片液滴核酸纯化平台。

背景技术

从生物样品中提取核酸是分子生物学和遗传学等生命科学研究领域中的一项基本技术。核酸纯化的传统方法如酚-氯仿抽提法,存在着有机溶剂毒性大、所需时间长、难以实现微型化、自动化操作等缺点。而近年来发展起来的以玻璃粉、离子交换树脂、硅胶（含磁性硅胶）等为吸附材料的核酸固相萃取法,不仅可以避免使用毒性强的有机溶剂,而且能大幅度提高提取效率，但仍存在着纯化时间长（几十分钟）、耗试剂量大（μL-mL级）等缺点。

微流控芯片是一个新兴的技术平台，是在一块几平方厘米的芯片上，由网络化的微通道控制流体，完成常规化学或生物实验室的各种操作。微液滴（droplet）是新近在微流控芯片上发展起来的一种操控微小体积液体的技术，是将微通道中的液滴作为微反应器。微液滴用于反应具有如下优点：降低样品或试剂消耗；实现快速混合，缩短反应时间；具有高通量分析的潜能等。目前已有很多基于微流控芯片的液滴操作技术单元报导，如液滴生成、液滴分裂、液滴融合/试剂添加、液滴混合，并应用于酶反应动力学研究、蛋白质结晶、微球合成等方面。而大部分研究工作包含连续的多步的反应步骤，如废液的去除、反应液的添加等，这就需要将上述操作单元通过有效的方法集成于同一块微流控芯片以实现连续的多步反应目的。

已有的此类研究工作，是将含反应液的液滴滴加芯片的表面，通过移动磁铁控制液滴中磁珠的移动，磁珠带动少量的溶液离开原液滴（为液滴分裂过程）并与另一液滴融合（为液滴融合过程），如此循环可实现多步反应的目的。它的主要缺点是不能在线高通量的生成液滴、操控液滴，因而不能连续的高通量的处理样本即一次只能处理一个样本。

人们迫切希望获得一个基于连续液滴操控的微流控芯片平台来实现在线的多步实验，如核酸纯化过程。而该平台的搭建并不能简单的组合现有的液滴操作单元来实现，如现有液滴分裂技术中液滴分裂比例建立在分裂区至出口的通道阻力比例，而在涉及多步液滴操控中，每个液滴操控单元对其压力比例都造成不稳定的干扰（随液滴的状态变化），从而造成不稳定的液滴分裂；在每次液滴分裂后，油相也被同比例分裂，造成液滴间的间距变小，使得后续的液滴操控比较困难。

发明内容

本发明的目的是提供一种适于高通量研究要求的基于连续液滴操控的微流控芯片核酸纯化平台；具体涉及含反应物和磁珠的液滴的形成、每个纯化步骤中试剂的添加及废液去除以及过程中的控制技术。

我们首次将液滴生成单元、不对称（含体积不对称和内含物不对称）液滴分裂单元和溶液添加单元等多个液滴操作单元集成于同一微流控芯片中。其中溶液添加单元用于向液滴中添加下一个反应液（即纯化过程中所需的清洗缓冲液和洗脱缓冲液），液滴分裂单元用于废液的去除，此步骤（溶液添加-液滴分裂）重复进行，即实现连续的多步液滴操纵过程。将磁铁放置于液滴分裂单元里，用以操纵液滴分裂时功能化磁珠在子液滴中的分配，而功能化的磁珠能选择性的吸附或释放特定的生物分子如DNA、RNA。如此，本发明的基于连续液滴操控的微流控芯片平台可用以核酸的纯化过程。

本发明提供了一种基于连续液滴操控的微流控芯片核酸纯化平台，其特征在于：该平台是由一个液滴生成区1、二个溶液添加区4、三个液滴混合区2、三个液滴分裂区3及相应的进样入口、出口、磁铁池9组成； 

其中进样入口由四个水相进样入口8.1、8.2、8.3、8.4，三个油相进样入口7.1、7.2、7.3组成；出口由三个废液池5.1、5.2、5.3，收集池6组成；磁铁池9内放置磁铁；

液滴生成区1、液滴混合区2与液滴分裂区3依次排列为一次液滴生成-废液去除单元，每个区之间依靠通道直接连接；

溶液添加区4、液滴混合区2与液滴分裂区3依次排列为一次溶液添加-废液去除单元，每个区之间依靠通道直接连接；

所述基于连续液滴操控的微流控芯片核酸纯化平台含一个液滴生成-废液去除单元、两个溶液添加-废液去除单元，每个单元之间依靠通道直接连接；无其它特殊结构；

该平台由上下两层PDMS（聚二甲基硅氧烷）通过等离子体封接，并将磁铁放置在封接好的平台磁铁池9内而成，其中上层PDMS含有通道、液池，下层PDMS基板用于封闭通道和液池。 

本发明提供的一种基于连续液滴操控的微流控芯片核酸纯化平台，其液滴生成区是由磁珠溶液入口8.2、样本及结合缓冲液入口8.1、油相入口7.1及相应的通道组成。磁珠溶液和样本及结合缓冲液平行进入通道后，在油相的剪切力下，产生含磁珠、样本、结合缓冲液的液滴。

本发明提供的一种基于连续液滴操控的微流控芯片核酸纯化平台，其液滴分裂区3是由T型分裂通道3.1、连接分裂通道出口的细通道组3.2、磁铁池9及磁铁池9内放置的磁铁组成。所述的细通道组由1-10根细通道组成，用于平衡T型通道两个出口的压力，而不受其它液滴分裂/溶液添加单元的干扰。

本发明提供的一种基于连续液滴操控的微流控芯片核酸纯化平台，其T型分裂通道3.1的两个出口到细通道组3.2之间的长度不等，造成T型通道的两端压力不等，因而实现体积不对称的液滴分裂，即液滴分裂产生的两个子液滴的体积不一样。

本发明提供的一种基于连续液滴操控的微流控芯片核酸纯化平台，其磁铁用于吸引液滴中的磁珠，让其聚集在有磁铁的一侧，并在液滴分裂时分配到有磁铁的一侧的子液滴中从而实现内含物不对称的液滴分裂。

本发明提供的一种基于连续液滴操控的微流控芯片核酸纯化平台，其溶液添加区4由连接油相入口7.2或7.3的油相添加通道4.1和连接水相入口8.3或8.4的水相添加通道4.2组成。

本发明提供的一种基于连续液滴操控的微流控芯片核酸纯化平台，其油相添加通道4.1为双T型，分别向分裂通道3.1的两个出口端通道同时添加油相以增大液滴间的距离利于后续液滴的操控，于液滴内的纯化过程无关。

本发明提供的一种基于连续液滴操控的微流控芯片核酸纯化平台，其水相添加通道4.2为T型，水相进入通道后，直接和液滴融合，实现溶液添加的过程。

本发明提供的一种基于连续液滴操控的微流控芯片核酸纯化平台，其液滴混合区2由逶迤型的通道组成。

本发明的优点：

1、本发明首次将多个液滴生成单元、液滴分裂单元、溶液添加单元及液滴混合单元集成于同一微流控芯片平台，用以实现多步的液滴操纵过程；

2、本发明首次实现了体积不对称和内含物不对称的液滴分裂，使基于磁珠的在线高通量的液滴固相萃取(SPE)成为可能；

3、液滴可高通量的产生、操纵，该平台具有高通量处理样本的潜力；

4、本发明具有纯化时间短（对每个液滴的核酸纯化过程约1min）、耗试剂量少（液滴为pL-nL级）的优点。

附图说明

图1为基于连续液滴操控的微流控芯片核酸纯化平台的俯视图，含液滴生成区1，液滴混合区2，液滴分裂区3，溶液添加区4，废液池5.1、5.2、5.3，收集池6，水相进样入口8.1、8.2、8.3、8.4，油相进样入口7.1、7.2、7.3，装有磁铁的磁铁池9；

图2为基于连续液滴操控的微流控芯片核酸纯化平台的剖面图；

图3为基于连续液滴操控的微流控芯片核酸纯化平台DNA纯化原理图；

为清楚说明其纯化过程，省略油相的添加等与纯化过程无关的部分。纯化过程包括以下三个步骤：(1)结合步骤，样本及结合缓冲液（水相入口8.1）和磁珠（水相入口8.2）并行进入通道，并在油相（油相入口7.1）的流体剪切力作用下，生成液滴，液滴在经过逶迤型通道时得到混合，其中样本中的DNA结合在磁珠上，而其它的杂质如蛋白质、细胞碎片则保存自由状态。在第一次分裂时，大部分的废液被去除至废液池5.1，结合了DNA磁珠被保留并进行下一步操作；(2)清洗步骤，清洗缓冲液（水相入口8.3）进入，并添加入上个步骤的液滴，经过液滴混合、液滴分裂继续去除样本中的杂质至废液池5.2，结合了DNA的磁珠被保留并进行下一步操作；(3)洗脱步骤，洗脱缓冲液（水相入口8.4）加入液滴中，使DNA从磁珠上解脱下来，经过液滴分裂后在收集池6中收集，而磁珠则流向废液池5.3；

图4在此平台上DNA纯化过程中涉及的连续液滴操控图；(a)含磁珠、样本和结合缓冲液的液滴生成和混合； (b)废液的去除（第一次液滴分裂）；(c)清洗缓冲液的添加（第一次溶液添加）；(d) 废液的去除（第二次液滴分裂）；(e) 洗脱缓冲液的添加（第二次溶液添加）；(f) 废液的去除（第三次液滴分裂）；

图5乙肝病毒血清样本DNA纯化的收集液进行PCR扩增的产物电泳图。

具体实施方式

下面的实施例将对本发明予以进一步的说明，但并不因此而限制本发明。

实施例1  λ-DNA标准品的提取

本实施例所用基于连续液滴操控的微流控芯片核酸纯化平台俯视图如图1所示，由一个液滴生成区1、二个溶液添加区4、三个液滴混合区2、三个液滴分裂区3及相应的进样入口、出口、磁铁池9组成。

其液滴生成区1是由磁珠溶液入口8.2、样本及结合缓冲液入口8.1、油相入口7.1及相应的通道组成。液滴分裂区3是由T型分裂通道3.1、连接分裂通道出口的细通道组3.2、磁铁池9及磁铁池9内放置的磁铁组成，其中T型分裂通道3.1的两个出口到细通道组3.2之间的长度不等。溶液添加区4由连接油相入口7.2或7.3的油相添加通道4.1和连接水相入口8.3或8.4的水相添加通道4.2组成，其中油相添加通道4.1为双T型，分别向分裂通道3.1的两个出口端通道同时添加油相以增大液滴间的距离利于后续液滴的操控，水相添加通道4.2为T型，水相进入通道后，直接和液滴融合，实现溶液添加的过程。液滴混合区2由逶迤型的通道组成。出口由三个废液池5.1、5.2、5.3，收集池6组成。

液滴生成区1、液滴混合区2与液滴分裂区3依次排列为一次液滴生成-废液去除单元，每个区之间依靠通道直接连接；溶液添加区4、液滴混合区2与液滴分裂区3依次排列为一次溶液添加-废液去除单元，每个区之间依靠通道直接连接；

该平台由上下两层PDMS通过等离子体封接（如图2所示），并将磁铁放置在封接好的平台磁铁池9内而成，其中上层PDMS含有通道、液池，下层PDMS基板用于封闭通道和液池。 

将装有相应样本/试剂/油相的注射器通过塑料管分别连接图1所示芯片的各油相和水相入口进样（油相从油相入口7.1、7.2、7.3进样，磁珠从水相入口8.2进样，含样本的结合缓冲液从水相入口8.1进样，清洗缓冲液从水相入口8.3进样，洗脱缓冲液从水相入口8.4进样），使用注射泵推动进样。λ-DNA标准品加入结合缓冲液中，使其终浓度为1ng/μL。使用的各油相和水相如下：油相为添加1%span80的矿物油；磁珠溶液为25mg/mL二氧化硅包被的超顺磁磁珠（直径180nm大小）；结合缓冲液为硫氰酸胍溶液（5M硫氰酸胍，20 mM EDTA, 1% Triton X-100，0.1 M Tris, pH 6.4）；清洗缓冲液为80%乙醇；洗脱缓冲液为TE缓冲液（PH7.5）。设定流速如下：液滴生成取的油相和溶液添加区的油相分别为0.42??L/min，0.17??L/min，0.17??L/min；磁珠溶液，样本及结合缓冲液，清洗缓冲液，洗脱缓冲液分别为0.08??L/min，0.17??L/min，0.20??L/min和0.10??L/min。

液滴稳定生成、分裂和溶液添加，在此平台上DNA纯化过程中涉及的连续液滴操控图见图4，(a)含磁珠、样本和结合缓冲液的液滴生成和混合； (b)废液的去除（第一次液滴分裂）；(c)清洗缓冲液的添加（第一次溶液添加）；(d) 废液的去除（第二次液滴分裂）；(e) 洗脱缓冲液的添加（第二次溶液添加）；(f) 废液的去除（第三次液滴分裂）。单个液滴完成DNA纯化过程耗时约1min。为计算平均提取效率，收集一段时间内提取物进行定量分析。测定提取效率为46%。 

实例2  乙肝患者血清样本中乙肝病毒DNA的提取

所用基于连续液滴操控的微流控芯片核酸纯化平台及DNA纯化方法同实施例1，HBV 血清（含阴性和阳性血清样本）预先进行蛋白酶K消化处理后从结合缓冲液入口处进样（血清：蛋白酶K：结合缓冲液为1:1:20，37°C孵育 30min）。PCR扩增的引物由大连宝生物公司合成，扩增HBV S蛋白区基因组序列（全长1170bp），其229bp-HBV引物序列是上游引物（位置：586-607）5’- GACTCGTGGTGGACTTCTCTCA-3’ 和下游引物（位置：793-814）5’- GAGGACAAACGGGCAACATACC-3’，扩增的产物为229bp（序列为GACTC GTGGTGGACT TCTCTCAATT TTCTAGGGGG AACTACCGTG TGTCTTGGCC AAAATTCGCA GTCCCCAACC TCCAATCACT CACCAACCTC TTGTCCTCCA ACTTGTCCTG GTTATCGCTG GATGTGTCTG CGGCGTTTTA TCATCTTCCT CTTCATCCTG CTGCTATGCC TCATCTTCTT GTTGGTTCTT CTGGACTATC AGGGTATGTT GCCCGTTTGT CCTC）。PCR扩增的条件为95??C 5min预变性， 30个温度循环（95??C变性 30s，56??C退火30 s, 72??C延伸 30 s），最后72??C 延伸10 min。PCR产物进行PMMA芯片电泳鉴定，电泳缓冲液为 0.5% HPMC-4000，0.1% PVP，6% mannitol 的 1× TBE缓冲液，预先添加1mM GeneFinder^TM做DNA染色。在200V/cm场强下分离，3.5cm处检测。如图5所示，阳性血清样本提取物PCR结果可见229bp的产物，阴性样本则无产物。提示该基于连续液滴操控的微流控芯片核酸纯化平台可提取足够适用于后续分析的DNA量，而去除样本中其它影响PCR反应的杂质。

SEQUENCE LISTING

<110>  中国科学院大连化学物理研究所

<120>  一种基于连续液滴操控的微流控芯片核酸纯化平台

<130>  无

<160>  4    

<170>  PatentIn version 3.5

<210>  1

<211>  1170

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

<220>

<223>  由大连宝生物公司合成

<400>  1

atggggcaga atctttccac cagcaatcct ctgggattct ttcccgacca ccagttggat     60

ccagccttca gagcaaacac cgcaaatcca gattgggatt tcaatcccaa caaggacacc  120

tggccagacg ccaacaaggt aggagctgga gcattcgggc tgggattcac cccaccgcac 180

ggaggccttt tggggtggag ccctcaggct cagggcatac tacaaacctt gccagcaaat  240

ccgcctcctg ccactaccaa tcgccagtca ggaaggcaac ctacccctct gtctccacct   300

ttgagaaaca ctcatccgca ggccatgcag tggaactcca caaccttcca tcaaactcta  360

caagatccca gagtgagagg cctgtatttt cctgctggtg gctccagttc aggaacagta  420

aaccctgttc cgactactgt ctctcacata tcgtcaatct tctcgaggat tggggaccct    480

gcgctgaaca tggagaacat cacatcagga ttcctaggac ccctgctcgt gttacaggcg  540

gggtttttct tgttgacaag aatcctcaca ataccgcaga gtctagactc gtggtggact   600

tctctcaatt ttctaggggg aactaccgtg tgtcttggcc aaaattcgca gtccccaacc   660

tccaatcact caccaacctc ttgtcctcca acttgtcctg gttatcgctg gatgtgtctg    720

cggcgtttta tcatcttcct cttcatcctg ctgctatgcc tcatcttctt gttggttctt       780

ctggactatc agggtatgtt gcccgtttgt cctctaattc caggatcgtc aaccaccagc   840

acgggaccat gcaggacctg cacgactcct gctcaaggaa cctctatgta tccctcctgt  900

tgctgtacca aaccttcgga cggaaattgc acctgtattc ccatcccatc atcctgggct   960

ttcggaaaat tcctatggga gtgggcctca gcccgtttct cctggctcag tttactagtg   1020

ccctttgttc agtggttcgt aggactttcc cccactgttt ggctttcagt tatatggatg     1080

atgtggaatt gggggccaag tctgtacaac atcttgagtc actttatacc gctgttacca   1140

attttctttt gtctttgggt atacatttaa                                1170

 

 

<210>  2

<211>  22

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

<220>

<223>  由大连宝生物公司合成

<400>  2

gactcgtggt ggacttctct ca                                  22

 

 

<210>  3

<211>  22

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

<220>

<223>  由大连宝生物公司合成

<400>  3

gaggacaaac gggcaacata cc                                   22

 

 

<210>  4

<211>  229

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

<220>

<223>  由大连宝生物公司合成

<400>  4

gactcgtggt ggacttctct caattttcta gggggaacta ccgtgtgtct tggccaaaat      60

tcgcagtccc caacctccaa tcactcacca acctcttgtc ctccaacttg tcctggttat     120

cgctggatgt gtctgcggcg ttttatcatc ttcctcttca tcctgctgct atgcctcatc      180

ttcttgttgg ttcttctgga ctatcagggt atgttgcccg tttgtcctc                229

 

Claims (1)

1.一种基于连续液滴操控的微流控芯片核酸纯化平台，其特征在于：该平台是由一个液滴生成区（1）、二个溶液添加区（4）、三个液滴混合区（2）、三个液滴分裂区（3）及相应的进样入口、出口、磁铁池（9）组成；

其中进样入口由四个水相进样入口（8.1）、（8.2）、（8.3）、（8.4），三个油相进样入口（7.1）、（7.2）、（7.3）组成；出口由三个废液池（5.1）、（5.2）、（5.3），收集池（6）组成；磁铁池(9)内放置磁铁；

其液滴生成区（1）是由磁珠溶液入口（8.2）、样本及结合缓冲液入口（8.1）、油相入口（7.1）及相应的通道组成；液滴分裂区（3）是由T型分裂通道（3.1）、连接分裂通道出口的细通道组（3.2）、磁铁池（9）及磁铁池（9）内放置的磁铁组成，其中T型分裂通道（3.1）的两个出口到细通道组（3.2）之间的长度不等；溶液添加区（4）由连接油相入口（7.2）或（7.3）的油相添加通道（4.1）和连接水相入口（8.3）或（8.4）的水相添加通道（4.2）组成，其中油相添加通道（4.1）为双T型，分别向分裂通道（3.1）的两个出口端通道同时添加油相以增大液滴间的距离利于后续液滴的操控，水相添加通道（4.2）为T型，水相进入通道后，直接和液滴融合，实现溶液添加的过程；液滴混合区（2）由逶迤型的通道组成；

液滴生成区（1）、液滴混合区（2）与液滴分裂区（3）依次排列为一次液滴生成-废液去除单元，每个区之间依靠通道直接连接；

溶液添加区（4）、液滴混合区（2）与液滴分裂区（3）依次排列为一次溶液添加-废液去除单元，每个区之间依靠通道直接连接；

所述基于连续液滴操控的微流控芯片核酸纯化平台含一个液滴生成-废液去除单元、两个溶液添加-废液去除单元，每个单元之间依靠通道直接连接；

该平台由上下两层PDMS通过等离子体封接，并将磁铁放置在封接好的平台磁铁池(9)内而成，其中上层PDMS含有通道、液池，下层PDMS基板用于封闭通道和液池。

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