CN111220800A - 一种基于微流控液滴技术的外泌体检测芯片 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种基于微流控液滴技术的外泌体检测芯片，该微流控芯片主要由上层通道层和底层无结构层组成；上层通道层由四个入口、四个出口、三个S形混合通道、五个T形通道、一个Y形通道以及三个磁铁坑组成。本发明通过将样品引入与染色检测集中在同一块芯片上，并通过使用微流控液滴技术，缩小反应体系，优化了外泌体提取检测步骤，极大地提高了外泌体的检测效率，并且简化了人工操作的程序，取得了较好的外泌体检测效果。

Description

一种基于微流控液滴技术的外泌体检测芯片

技术领域

本发明涉及外泌体分离与检测领域，尤其涉及一种基于微流控液滴技术的外泌体检测芯片。

背景技术

外泌体是细胞经过“内吞-融合-外排”等一系列调整过程而形成的细胞外纳米级囊泡。其在人体内分布广泛，人体的尿液、汗液、血液、乳汁等均含有外泌体。外泌体在人体内的角色主要扮演两个角色，第一种是有免疫活性的外泌体，其主要在抗原呈递和共刺激中发挥作用，具有信息传递功能。第二种为含有数量可观的RNA并介导细胞间的遗传物质交流的外泌体，具有物质传递功能。随着研究的深入，人们发现外泌体在适应性免疫、炎症过程、胚胎形成、肿瘤的发生与发展过程中均发挥了重要的作用。就肿瘤来说，一百多年前，经过解剖人们发现特定的肿瘤细胞总是倾向于转移到特定的组织器官，并由此提出了著名的“种子与土壤”转移假说，认为肿瘤细胞只能在适宜的组织器官环境中才能形成转移灶。随着技术的发展肿瘤的转移机制在不断被完善，人们发现肿瘤可以通过分泌外泌体主动改变转移灶微环境，外泌体可以通过调节免疫功能，促进肿瘤血管新生以及肿瘤转移，或者直接作用于肿瘤细胞影响肿瘤进展。因此，对外泌体进行研究，有望为我们在肿瘤早期诊断和抑制肿瘤的发展等方面提供一个新思路。

想要对外泌体进行研究，首要问题便是如何将外泌体从样本中分离出来。微流控芯片技术是21世纪非常重要的一个技术，其具有的微型、自动、使用试剂微量、高通量、可实现多功能集成等特点使其成为了进行外泌体研究的潜在平台。微流控芯片液滴技术是一种全新的在微流控芯片上发展起来的操纵微小体积液体的技术。因为微流控液滴技术具有体积小、样品无扩散、反应条件稳定、样品间交叉污染少以及混合迅速等优点，已经在物理、化学、生物如细胞研究、材料制备、化学反应等多个领域获得了应用。液滴的形成主要有T型通道及流动聚焦两种方式。随着微流控液滴技术通量的不断提高，样品引入、液滴融合、分裂、分选、捕获、存储、检测技术的不断发展，液滴微流控技术将会获得越来越广泛的应用。液滴微流控技术有望成为化学和生物领域部分研究的新的平台，为外泌体研究与检测打开一个新思路。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于微流控液滴技术的外泌体检测芯片。

一种基于微流控液滴技术的外泌体检测芯片，该微流控芯片主要由上层通道层和底层无结构层组成；

上层通道层由四个入口、四个出口、三个S形混合通道、五个T形通道、一个Y形通道以及三个磁铁坑组成；

四个入口分别为进样入口、油相入口、一抗入口以及二抗入口；四个出口为3个废液出口和一个最终样品出口；三个S形混合通道为样品与磁珠混合通道，样品与一抗混合通道以及样品与二抗混合通道；五个T形通道三个为液滴分裂通道，两个为液滴生成通道；一个Y形通道为液滴生成通道；

其中进样入口和油相入口分别在Y形通道的两个叉支上，通过Y形通道和样品与磁珠混合通道相连；样品与磁珠混合通道下连一个T形的液滴分裂通道，该T形分裂通道一边连接一个废液池，一边通过一T形液滴生成通道和一抗入口及样品与一抗混合通道相连；样品与一抗混合通道下连一个T形液滴分裂通道，该T形分裂通道一边连接一个废液池，一边通过一T形液滴生成通道和二抗入口及样品与二抗混合通道相连；样品与二抗混合通道下连一个T形液滴分裂通道，该T形液滴分裂通道一边连接一个废液池，一边和最终样品出口相连；三个磁铁坑都在T形分裂通道连接混合通道那边的上面，每个磁铁坑里有一个直径2mm，高2mm的圆柱形小磁铁。

所述上层通道层高度为100μm-1mm；所述混合通道宽度为200μm-1mm；所述T形分裂通道垂直通道宽度为200μm-1mm，其余两个通道宽度为垂直通道尺寸的1/3-1/2；所述T形液滴生成通道，连T形液滴分裂通道和混合通道的通道宽度为200μm-1mm，连接进样口的通道宽度为其余通道宽度的1/3-1/2；所述Y形通道连接油相入口的通道宽度为200μm-1mm，连接进样入口通道宽度为油相入口的1/3-1/2，连接混合通道的通道宽度为200μm-1mm；其余通道宽度为200μm-1mm；所述磁铁坑距离T形液滴分裂通道分裂点横向和纵向尺寸均为1mm-3mm。

所述微流控芯片按照以下步骤进行制备：使用autoCAD软件画出掩膜，使用SU8胶制备上层通道层模板，使用混合好的PDMS(PDMS：引发剂＝5:1-20:1)进行倒模，在进口、出口位置打孔，并在适当的位置使用直径2mm的打孔器，打出磁铁坑；使用氧等离子设备将上层通道层和底层无结构层封接，在磁铁坑中放入磁铁。

所述基于微流控液滴技术的外泌体检测芯片在使用前需要进行疏水修饰，方法为将芯片置于真空干燥机中抽真空至少15min，接着向所有通道中加入含2％-5％十八烷基三氯硅烷的十六烷，室温孵育3-6分钟；吸干通道中液体，先后使用乙醇和水清洗通道至少5min，将芯片置于80℃烘箱1h以上，备用。

所述基于微流控液滴技术的外泌体检测芯片在使用时需先将免疫磁珠和样品预混后再进行分离与检测，所用链酶亲和素免疫磁珠捕获前需进行修饰，其修饰步骤为：使用2μg/ml-10μg/ml的生物素化的EpCAM与免疫磁珠混合，4℃过夜孵育，取出后用PBS清洗三次以上，之后将其和待检测样品混合，4℃孵育一小时以上，备用。

所述基于微流控液滴技术的外泌体检测芯片在使用时油相入口流速为1μL/min-40μL/min，进样入口流速为油相入口的1/4-1/8，一抗入口和二抗入口流速为进样入口的1/3-2/3。

本发明的优点：

1、本发明借助微流控液滴技术，减小了反应体系，节省了试剂用量，节约了反应时间。

2、本发明将样品引入，一抗孵育，二抗孵育集中在一块芯片上，优化了外泌体检测流程。

3、本发明通过磁铁对磁珠的磁力作用，使得在液滴分裂时磁珠会分裂到偏向磁铁那端的液滴中，从而将样品和其它物质分开，简化了人工操作步骤，减少误差，实现了传统方法很难实现的时空分辨率。

附图说明

图1是基于微流控液滴技术的外泌体检测芯片掩膜示意图；

图2是Y形液滴生成通道原理示意图；

图3是T形液滴分裂通道原理示意图；

图4是T形液滴生成通道原理示意图。

其中：1.进样入口 2.Y形通道 3.S形混合通道 4.T形液滴分裂通道 5.T形液滴产生通道 6.一抗入口 7.二抗入口 8.最终样品出口 9.油相入口 10.废液出口 11.磁珠12.小磁体“→”.液体流向

具体实施方式

下面将通过具体实施例对本发明做进一步说明，但并不因此而限制本发明。

实施例1

一种基于微流控液滴技术的外泌体检测芯片的制备

使用autoCAD软件画出如图1所示掩膜图形；使用SU8胶制备上层通道层模板；使用混合好的PDMS(PDMS：引发剂＝10:1)进行倒模；在进口、出口位置打孔，并在适当的位置使用直径2mm的打孔器，打出磁铁坑；使用氧等离子设备将上层通道层和底层无结构层封接，在磁铁坑中放入磁铁，备用。

该微流控芯片如图1、图2所示主要由上层通道层和底层无结构层组成；

上层通道层由四个入口、四个出口、三个S形混合通道、五个T形通道、一个Y形通道以及三个磁铁坑组成；四个入口分别为进样入口1、油相入口9、一抗入口6以及二抗入口7；四个出口为3个废液出口10和一个最终样品出口8；三个S形混合通道3为样品与磁珠混合通道，样品与一抗混合通道以及样品与二抗混合通道；五个T形通道三个为液滴分裂通道4，两个为液滴生成通道5；一个Y形通道为液滴生成通道2；

其中进样入口和油相入口分别在Y形通道的两个叉支上，通过Y形通道和样品与磁珠混合通道相连；样品与磁珠混合通道下连一个T形的液滴分裂通道，该T形分裂通道一边连接一个废液池，一边通过一T形液滴生成通道和一抗入口及样品与一抗混合通道相连；样品与一抗混合通道下连一个T形液滴分裂通道，该T形分裂通道一边连接一个废液池，一边通过一T形液滴生成通道和二抗入口及样品与二抗混合通道相连；样品与二抗混合通道下连一个T形液滴分裂通道，该T形液滴分裂通道一边连接一个废液池，一边和最终样品出口相连；三个磁铁坑12都在T形分裂通道连接混合通道那边的上面，每个磁铁坑里有一个直径2mm，高2mm的圆柱形小磁铁。

Y形液滴生成通道原理示意图如图2所示，T形液滴分裂通道原理示意图如图3所示，T形液滴生成通道原理示意图如图4所示。

所述上层通道层高度为200μm；所述混合通道宽度为400μm；所述T形液滴分裂通道垂直通道宽度为400μm，其余两个通道宽度为垂直通道尺寸的150μm；所述T形液滴生成通道，连T形液滴分裂通道和混合通道的通道宽度为400μm，连接进样口的通道宽度为其余通道宽度的150μm；所述Y形通道连接油相入口的通道宽度为300μm，连接进样入口通道宽度为油相入口的100μm，连接混合通道的通道宽度为400μm；其余通道宽度为400μm；所述磁铁坑距离T形液滴分裂通道分裂点横向和纵向尺寸均为3mm。

制作好的芯片使用含5％十八烷基三氯硅烷的十六烷，室温孵育三分钟。吸干通道中液体，先后使用乙醇和水清洗通道5min，将芯片置于80℃烘箱1h。修饰好的芯片将四个入口通过聚四氟乙烯管接入相应的注射器，使用注射泵控制注射器流速，将3个废液出口通过聚四氟乙烯管导入废液桶，最终样品出口通过聚四氟乙烯管导入到收集管中。使用时先打开油相对应的注射泵，使芯片内充满油相液体，再依次打开进样注射泵、一抗注射泵和二抗注射泵。样品收集完成后，使用离心机离心，移去上层液体，留下底部磁珠，再使用PBS离心清洗三次后，将磁珠用PBS重悬，便可滴于载玻片上观测。

该基于微流控液滴技术的外泌体检测芯片可以通过改变修饰磁珠的抗体以及检测所用的抗体满足不同的目的。如想要检测特定的蛋白时，可以使用相应的蛋白进行检测，从而得到表达该蛋白的外泌体的相对含量。

Claims (7)

1.一种基于微流控液滴技术的外泌体检测芯片，其特征在于：该微流控芯片主要由上层通道层和底层无结构层组成；

上层通道层由四个入口、四个出口、三个S形混合通道、五个T形通道、一个Y形通道以及三个磁铁坑组成；

四个入口分别为进样入口、油相入口、一抗入口以及二抗入口；四个出口为3个废液出口和一个最终样品出口；三个S形混合通道为样品与磁珠混合通道，样品与一抗混合通道以及样品与二抗混合通道；五个T形通道三个为液滴分裂通道，两个为液滴生成通道；一个Y形通道为液滴生成通道；

其中进样入口和油相入口分别在Y形通道的两个叉支上，通过Y形通道和样品与磁珠混合通道相连；样品与磁珠混合通道下连一个T形的液滴分裂通道，该T形分裂通道一边连接一个废液池，一边通过一T形液滴生成通道和一抗入口及样品与一抗混合通道相连；样品与一抗混合通道下连一个T形液滴分裂通道，该T形分裂通道一边连接一个废液池，一边通过一T形液滴生成通道和二抗入口及样品与二抗混合通道相连；样品与二抗混合通道下连一个T形液滴分裂通道，该T形液滴分裂通道一边连接一个废液池，一边和最终样品出口相连；三个磁铁坑都在T形分裂通道连接混合通道那边的上面，每个磁铁坑里有一个直径2mm，高2mm的圆柱形小磁铁。

2.按照权利要求1所述基于微流控液滴技术的外泌体检测芯片，其特征在于：所述上层通道层高度为100μm-1mm；所述混合通道宽度为200μm-1mm；

所述T形分裂通道垂直通道宽度为200μm-1mm，其余两个通道宽度为垂直通道尺寸的1/3-1/2；

所述T形液滴生成通道，连T形液滴分裂通道和混合通道的通道宽度为200μm-1mm，连接进样口的通道宽度为其余通道宽度的1/3-1/2；

所述Y形通道连接油相入口的通道宽度为200μm-1mm，连接进样入口通道宽度为油相入口的1/3-1/2，连接混合通道的通道宽度为200μm-1mm；其余通道宽度为200μm-1mm；所述磁铁坑距离T形液滴分裂通道分裂点横向和纵向尺寸均为1mm-3mm。

3.按照权利要求1所述基于微流控液滴技术的外泌体检测芯片的制备方法，其特征在于：按照以下步骤进行：使用autoCAD软件画出掩膜，使用SU8胶制备上层通道层模板，使用混合好的PDMS(PDMS：引发剂＝5:1-20:1)进行倒模，在进口、出口位置打孔，并在适当的位置使用直径2mm的打孔器，打出磁铁坑；使用氧等离子设备将上层通道层和底层无结构层封接，在磁铁坑中放入磁铁。

4.一种如权利要求1所述的基于微流控液滴技术的外泌体检测芯片的应用。

5.按照权利要求1所述基于微流控液滴技术的外泌体检测芯片的应用，其特征在于：使用前需要进行疏水修饰，方法为将芯片置于真空干燥机中抽真空至少15min，接着向所有通道中加入含2％-5％十八烷基三氯硅烷的十六烷，室温孵育3-6分钟；吸干通道中液体，先后使用乙醇和水清洗通道至少5min，将芯片置于80℃烘箱1h以上，备用。

6.按照权利要求1所述基于微流控液滴技术的外泌体检测芯片的应用，其特征在于：使用时需先将免疫磁珠和样品预混后再进行分离与检测，所用链酶亲和素免疫磁珠捕获前需进行修饰，其修饰步骤为：使用2μg/ml-10μg/ml的生物素化的EpCAM与免疫磁珠混合，4℃过夜孵育，取出后用PBS清洗三次以上，之后将其和待检测样品混合，4℃孵育一小时以上，备用。

7.按照权利要求1所述基于微流控液滴技术的外泌体检测芯片的应用，其特征在于：使用时油相入口流速为1μL/min-40μL/min，进样入口流速为油相入口的1/4-1/8，一抗入口和二抗入口流速为进样入口的1/3-2/3。

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