CN105441309B - 循环式单细胞捕获转移芯片 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种循环式单细胞捕获转移芯片，包括液流层和微泵；其中液流层包含：环状液流管道，包含用以截留流经所述液流管道的液流内的单个细胞的若干微筛，并且在所述微筛上、下游还分别设有一第二微阀；与所述液流管道连通的液流输入管道、液流输出管道，且所述液流输入管道和液流输出管道上还分别设有第一微阀；载流管道，用以提供载流从所述液流管道的分布有所述微筛的区域通过，并将微筛捕获的单细胞从液流管道内冲洗出；而微泵系用以驱使液流在所述液流管道内单向循环流动。利用本发明的芯片可以将捕获的单细胞从捕获位置准确转移到芯片其他特定位置或导出芯片外，摆脱了空间位置限制，能够进行多样的单细胞培养和分析研究。

Description

循环式单细胞捕获转移芯片

技术领域

本发明属于微流控技术领域，特别是涉及一种循环式单细胞捕获转移芯片。

背景技术

随着生物技术研究手段的不断发展，生物学的研究层面正从细胞种群向单细胞层面深化拓展。每个细胞在时空上都是独一无二的，尽管它们可能来自同一祖先，但是不同的时空环境决定了它们各自特异的遗传表达，从而产生了不同的生物性状，这对于进化、耐药性、基因表达等研究具有重要价值。然而基于细胞种群的分析方法往往会掩盖群体内不同细胞间出现的差异，忽略这些少量但重要的信息。因此迫切需要研发基于单细胞的培养及分析方法，用来研究不同细胞个体间的差异性，了解细胞的遗传与代谢机制。

从大量细胞中获得单个细胞是进行单细胞培养与分析的第一步。传统的单细胞获取方法常采用对细胞群进行大量稀释或者显微操作的方法来进行。整个操作步骤复杂繁琐，单细胞获得效率低。微流控技术是上世纪九十年代在分析化学领域发展起来的，它以微管道网络微结构特征，通过微加工技术将微管道、微泵、微阀、微储液器、微检测元件等功能元器件像集成电路一样，集成在芯片材料上。微流控技术在分离捕获单细胞方面很高的效率，通过在芯片上制作微孔、微筛、微电极等结构，能够在较短时间捕获大量单细胞，在单细胞捕获培养研究方面已经有多个成功的应用范例。

已公开的技术文献（Lab Chip, 2012, 12, 765）公开了一种基于微筛的单细胞捕获芯片，该芯片具有多个串联圆形腔室，每个腔室中央有一对由两个微柱组成的微筛结构。当细胞注入腔室时，单个细胞会被阻滞于微筛处，从而被捕获，进而微筛外围的上方的圆形微阀通过加压，阀膜向下方的液体管道弯曲形变，将微筛区域与外界液体管道隔离，形成一独立腔室，捕获的单细胞即在其中培养生长。该芯片在输入细胞数量为10000~25000个条件下，约有75%的微筛能够捕获到单细胞。捕获后的单细胞停留在微柱附近，在被环状微阀隔离成一独立微腔中进行分析或培养。

该芯片由于需要细胞与液流管道中的微筛接触才能捕获单个细胞，因此捕获成功很大程度上取决于细胞与微筛接触的机率。然而由于微筛的横向直径很小，大部分细胞与微筛接触的机率很小，大都会绕过微筛，最后流出芯片。为了能够实现一定的被捕获单细胞数量，需要输入较多量的细胞，在该文献中，细胞数量约为10000~25000个，细胞输入数量需求高，这对于一些数量少的细胞样品而言，难以适用；同时，该芯片上捕获到单细胞的微筛仅占70%，捕获适用的细胞直径在10~15微米，小于此直径范围的细胞对液体流场更为敏感，捕获难度更大，捕获效率更低，为了获得尽可能多的单细胞，需要进一步提升微筛捕获效率，并能够适用于直径更小的细胞；另外，该方案中，细胞被捕获后，即被隔离在捕获点附件区域进行培养或分析，无法将被捕获细胞分别转移到其他区域或导出芯片，因此单细胞空间位置的限制阻碍使分析或培养策略单一化，无法适应多样的研究需求。本发明因此而来。

发明内容

本发明的目的在于提出一种捕获单个细胞的循环式单细胞捕获转移芯片，该芯片通过液体循环流动，从中捕获单个细胞的芯片方案，通过该芯片，能够从注入的少量细胞中捕获得到多个单细胞；另外将各单细胞分别输入到特定位置或容器中，进行分析或培养等后续操作。

为了解决现有技术中的这些问题，本发明提供的技术方案是：

一种循环式单细胞捕获转移芯片，包括：

液流层，包含：

环状液流管道，其中设有用以截留流经所述液流管道的液流内的单个细胞的一个以上微筛，并且在所述液流管道上于所述微筛上、下游还分别设有至少一第二微阀，用以将所述液流管道内分布有所述微筛的区域与其余区域隔离，

与所述液流管道连通的液流输入管道、液流输出管道，且所述液流输入管道和液流输出管道上还分别设有至少一第一微阀，

载流管道，用以提供载流从所述液流管道的分布有所述微筛的区域通过，并将微筛捕获的单细胞从液流管道内冲洗出，所述载流管道包括与所述液流管道连通的载流输入管道、载流输出管道；

微泵，至少用以驱使液流在所述液流管道内单向循环流动。

进一步的，所述微筛包括连接在液流管道管壁上的一个以上微柱组，所述微柱组包括一个以上微柱，且其中一个微柱与液流管道管壁之间或其中两个微柱之间形成有能够阻滞单个细胞但使液流中的液体通过的间隙。

进一步的，所述芯片包括设于所述液流层上的弹性膜层，所述弹性膜层包括弹性膜，所述微筛包括连接在所述弹性膜暴露于所述液流管道内的局部表面上的一个以上微柱组，所述微柱组包括两个以上微柱，且其中两个微柱之间形成有能够阻滞单个细胞但使液流中的液体通过的间隙。

进一步的，所述微柱的形状可选自但不限于圆柱形、长方体、梯台、圆锥体、开放式槽型结构（例如新月形结构）的任一种或者两种以上的任意组合。

进一步的，所述芯片还包括设置在所述液流层上的弹性膜层和设置在所述弹性膜层上的气动控制层，所述弹性膜层包括弹性膜，所述微泵包括分布于所述气动控制层内的两条以上第三气动控制管道，当在设定时段向其中两条以上第三气动控制管道内分别输入具有不同压力的流体时，该两条以上第三气动控制管道能够分别驱使所述弹性膜的不同局部区域产生不同程度的形变和/或位移，从而在液流管道内产生能够驱使液流单向流动的力。

进一步的，所述液流管道内沿液流流动方向分布有复数个微筛组，每一微筛组包含一个以上微筛，且每一微筛组上、下游均设有一第二微阀。

进一步的，所述第一微阀或第二微阀包括能够驱使弹性膜的局部区域挤压液流输入管道和/或液流输出管道，从而在所述液流输入管道和/或液流输出管道内的选定位置阻断液流的驱动机构。

进一步的，所述驱动机构至少选自电致动机构、磁致动机构、光致动机构、液压驱动机构或气动机构。

进一步的，所述第一微阀包括分布于所述气动控制层内的至少一第一气动控制管道或至少一第二气动控制管道，当向所述第一气动控制管道或第二气动控制管道内输入具有设定压力的流体时，所述第一气动控制管道或第二气动控制管道能够驱使所述弹性膜的局部区域挤压液流输入管道和/或液流输出管道，从而在所述液流输入管道和/或液流输出管道内的选定位置阻断液流。

进一步的，所述第二微阀包括分布于所述气动控制层内的一条以上叉形气动控制管道，当向所述叉形气动控制管道输入具有设定压力的流体时，所述第六气动控制管道的不同叉指部能够分别驱使所述弹性膜的不同局部区域挤压所述液流管道，从而在所述液流管道内的不同选定位置阻断液流。

进一步的，所述载流管道上还设有第三微阀，所述第三微阀包括分布于所述气动控制层内的至少一第四气动控制管道和至少一第五气动控制管道，当向所述第四气动控制管道或第五气动控制管道内输入具有设定压力的流体时，所述第四气动控制管道或第五气动控制管道能够驱使所述弹性膜的局部区域挤压载流输入管道和/或载流输出管道，从而在所述载流输入管道和/或载流输出管道内的选定位置阻断载流。

进一步的，所述第四气动控制管道和第五气动控制管道也可一体设置，即，以一条与载流输入管道、载流输出管道均交叉的气动控制管道实现载流输入管道、载流输出管道的启闭控制。

进一步的，在所述液流管道内分布有所述微筛的区域内，载流的流动方向与所述液流的流动方向交叉。

该芯片的单细胞捕获原理在于，将一定量的细胞注入环状闭合的循环液流管道后，位于液流输入输出管道及载流输入管道上的微阀关闭，将环状闭合的循环液流管道与外界隔离封闭，开启微泵后，细胞在微泵的作用下随液流在环状闭合的循环液流管道内单向循环流动，部分细胞被位于环状闭合的循环液流管道上的微柱阻挡而被捕获，当有足够数量的微柱捕获到单细胞后，停止微泵，关闭位于环状闭合的循环液流管道上的微阀，将捕获的单细胞彼此隔离，然后开启载流输入输出管路上的微阀，注入载流，将单细胞从微柱上冲出，沿载流输入管路转移到特定的芯片区域或导出到芯片外部，以备后续培养或分析操作。

本发明技术方案中进行单细胞捕获时，具有微筛的液流管道为一环状闭合管道，其中的液流在微泵的驱动下单向循环流动，直至有较多数量的微筛捕获到单细胞。

本发明气动控制管道可以将循环液流管道围成一独立区域，区域内含有一个或多个单细胞捕获微柱，且至少有一条载液输入和一条载液输出管路，可位于环状闭合管道同一侧或者分布于两侧，实现载流冲出捕获的单细胞。

本发明的芯片中，由于细胞随液流在环状管路中循环流动，捕获过程中，细胞始终分布在具有微筛的环状管路中，每个细胞有多次机会经过同一微筛捕获区域，被微筛阻滞而捕获的概率大大增加，因此输入细胞的需求数量仅~4000个，显著少于对比文献，而捕获有单细胞的微筛数量比例达到90%，捕获效率高于对比文献。

本发明的芯片中，通过微阀将单细胞捕获和细胞转移过程进行两种独立的空间分隔，通过注入与捕获时液流方向相交叉的载流，将捕获的单细胞从微柱上冲出，并随载流输入到各特定芯片区域或导出芯片外，摆脱了培养和检测的空间限制，能够进行多样的单细胞培养和分析研究。

环状闭合管道俯视形状可为圆形、方形或任意闭合形状，微泵不限于一组，也可为多组，微柱结构不限于圆柱形，可为长方体、梯台、圆锥等，每组数量也不限于两个，也可为三个或以上，仅需能够阻滞细胞，而允许液流通过。

相对于现有技术中的方案，本发明的优点是：

本发明技术方案将细胞悬液注入循环液流管道（环状管路）后封闭，并使其循环流动，其中的细胞能够多次经过分布于环状管路中的微筛而不流出芯片，增加了微筛接触的机会，提高单细胞捕获率，单细胞捕获完成后，通过平面交叉液流管路的流向切换，将捕获的细胞从被捕获区域转移到芯片其他区域或导出芯片。采用该方案，不仅减少了细胞输入所需的数量，同时捕获到单细胞的微筛数量比例也得到提高，当输入细胞数量在4000个左右，直径4~6微米时，捕获到单细胞的微筛数量比例可达90%，与对比文献相比，适用的细胞直径更小，同时单细胞捕获率较高。捕获的单细胞从捕获位置转移到芯片其他特定位置或导出芯片外，摆脱了空间位置限制，能够进行多样的单细胞培养和分析研究。

附图说明

下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：

图1为本发明实施例1循环式单细胞捕获转移芯片的俯视示意图；

图2是图1中1B区域循环式单细胞捕获转移芯片局部放大示意图；

图3是图2所示沿线1C的循环式单细胞捕获转移芯片剖面结构示意图；

图4是本发明实施例循环式单细胞捕获转移芯片俯视示意图；

图5是图4中2B区域循环式单细胞捕获转移芯片局部放大示意图；

图6是图5所示沿线2C的循环式单细胞捕获转移芯片剖面结构示意图；

其中，110为液流层；120为气动控制层；130为弹性膜；1101、1102、1103、1104、1105为液流管道；1201、1202、1203、1204、1205、1206为气动控制管道；1301为微柱；1000为捕获的单细胞。

具体实施方式

以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限于限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体厂家的条件做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。

实施例1

图1~3是本发明实施例1循环式单细胞捕获转移芯片的结构示意图，该芯片由三个上下层叠的结构层组成。底层是液流层110，上层是气动控制层120，两层之间有弹性膜130相隔。液流层110中有环状闭合的循环液流管道1101，液流输入管道1102，液流输出管道1103，载流输入管道1104，载流输出管道1105，各管道宽100微米，高20微米，液流输入管道1102、液流输出管道1103、载流输入管道1104一端均有接口与芯片外连通，载流输出管道1105有一端与芯片上的其他腔室或与通向芯片外的接口相连。在液流管道1101底部有多组突起的微柱1301，每个微柱直径10微米，高15微米，微柱间隙5微米，以阻拦单细胞1000。气动控制层120中有气动控制管道1201、1202、1203、1204、1205、1206，除叉形气动控制管道1206外，其余气动控制管道宽均为100微米。其中第一气动控制管道1202在液流输入管道1102上方穿越，第二气动控制管道1203在液流输出管道1103上方穿越，第四气动控制管道1204在载流输入管道1104上方穿越，第五气动控制管道1205在载流输出管道1104上方穿越。气动控制管道均与外界相连，当向气动控制管道中注入高压气体，气动控制管道下的弹性膜会向下发生弯曲，挤压弹性膜下方的液流管道，当撤去高压气体时，弹性膜回复。此即为微流控技术领域公知的微阀。叉形气动控制管道1206为一段粗细交替间隔的叉指状管道，较细的管道部分穿越载液输入管道1104上方，较粗的管道部分穿越环状闭合的循环液流管道1101上方。向气动控制管道1206中充入高压气体时，不能截止载液输入管道1104中的液流，但可以截止下方环状闭合的循环液流管道1101的相应区域液流。第三气动控制管道1201为两根或三根平行的管道，通过按特定时序依次加压，可以挤压下方环状闭合的循环液流管道1101中的液体单向流动，此即为微流控技术领域公知的微泵。

将一定量的细胞注入环状闭合的循环液流管道后，位于液流输入输出管道及载流输入管道上的微阀关闭，将环状闭合的循环液流管道与外界隔离封闭，开启微泵后，细胞在微泵的作用下随液流在环状闭合的循环液流管道内单向循环流动，部分细胞被位于环状闭合的循环液流管道上的微柱阻挡而被捕获，当有足够数量的微柱捕获到单细胞后，停止微泵，关闭位于环状闭合的循环液流管道上的微阀，将捕获的单细胞彼此隔离，然后开启载流输入输出管路上的微阀，注入载流，将单细胞从微柱上冲出，沿载流输入管路转移到特定的芯片区域或导出到芯片外部，以备后续培养或分析操作。

结合附图1~3，向第四气动控制通道1204、第五气动控制通道1205中充入高压气体，截止载液输入管道1104和输出管道1105，然后将细胞悬液注入液流输入管道1102使液体充满环状闭合的循环液流管道1101，部分悬液从液流输出管道1103中流出，然后向第一气动控制管道1202、第二气动控制管道1203中充入高压流体，截止液流管道1102、1103，向第三气动控制管道1201中按特定时序依次加压，驱动下方环状闭合的循环液流管道1101中的液体单向流动，待有足够数量的微筛1301捕获到单细胞后，撤去第三气动控制管道1201、第一气动控制管道1202、第二气动控制管道1203中气压，通过液流输入管道1102或液流输出管道1103中注入清洗液，确保清洗液在环状闭合的循环液流管道中的主要流向与微泵循环时的液流方向相同，将多余未捕获的细胞冲出，向叉形气动控制管道1206充入高压气体，将捕获的单细胞1000彼此分隔，撤去第四气动控制管道1204、第五气动控制管道1205中气压，向载流输入管道1104注入载液，将单细胞从微柱上冲出被随液流沿载流输出管道1105进入芯片中的其他区域或连通外界的接口而被导出芯片。

本实施例中循环液流管道可以为环形液流管道；其中环形可以是方环形或者圆环形。

实施例2

图4~6是本发明实施例2循环式单细胞捕获转移芯片的结构示意图，该芯片由三个上下层叠的结构层组成。底层是液流层110，上层是气动控制层120，两层之间有弹性膜130相隔。液流层110中有环状闭合的循环液流管道1101，液流输入管道1102，液流输出管道1103，载流输入管道1104，载流输出管道1105，各管道宽100微米，高20微米，液流输入管道1102、液流输出管道1103、载流输入管道1104一端均有接口与芯片外连通，载流输出管道1105有一端与芯片上的其他腔室或与通向芯片外的接口相连。在液流管道1101底部有多组突起的微柱1301，每个微柱直径10微米，高15微米，微柱间隙5微米，以阻拦单细胞1000。气动控制层120中有气动控制管道1201、1202、1203、1204、1206，除叉形气动控制管道1206外，其余气动控制管道宽均为100微米。其中第一气动控制管道1202在液流输入管道1102上方穿越，第二气动控制管道1203在液流输出管道1103上方穿越，第四气动控制管道1204在载流输入管道1104、载流输出管道1105上方穿越。气动控制管道均与外界相连，当向气动控制管道中注入高压气体，气动控制管道下的弹性膜会向下发生弯曲，挤压弹性膜下方的液流管道，当撤去高压气体时，弹性膜回复。此即为微流控技术领域公知的微阀。叉形气动控制管道1206为一段叉指状管道，叉指部分管道穿越环状闭合的循环液流管道1101上方。气动控制管道1201为两根或三根平行的管道，通过按特定时序依次加压，可以挤压下方环状闭合的循环液流管道1101中的液体单向流动，此即为微流控技术领域公知的微泵。由于本实施例的载流输入管道和载流输出管道位于循环液流管道的同一侧，因此，可以采用同一个气动控制管道来控制连通。即该情况下等同于第四气动控制管道和第五气动控制管道为同一个气动控制管道。

结合附图4~6，向气动控制通道1204中充入高压气体，截止载液输入管道1104和输出管道1105，然后将细胞悬液注入液流输入管道1102使液体充满环状闭合的循环液流管道1101，部分悬液从液流输出管道1103中流出，然后向气动控制管道1202、1203中充入高压流体，截止液流管道1102、1103，向气动控制管道1201中按特定时序依次加压，驱动下方环状闭合的循环液流管道1101中的液体单向流动，待有足够数量的微筛1301捕获到单细胞后，撤去气动控制管道1201、1202、1203中气压，通过液流输入管道1102或液流输出管道1103中注入清洗液，确保清洗液在环状闭合的循环液流管道中的主要流向与微泵循环时的液流方向相同，将多余未捕获的细胞冲出，向气动控制管道1206充入高压气体，将捕获的单细胞1000彼此分隔，撤去气动控制管道1204中气压，向载流输入管道1104注入载液，将单细胞从微柱上冲出被随液流沿载流输出管道1105进入芯片中的其他区域或连通外界的接口而被导出芯片。

上述实例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人是能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种循环式单细胞捕获转移芯片，其特征在于包括：

液流层，包含：

环状液流管道，其中设有用以截留流经所述液流管道的液流内的单个细胞的一个以上微筛，并且在所述液流管道上于所述微筛上、下游还分别设有至少一第二微阀，用以将所述液流管道内分布有所述微筛的区域与其余区域隔离，

与所述液流管道连通的液流输入管道、液流输出管道，且所述液流输入管道和液流输出管道上还分别设有至少一第一微阀，

载流管道，用以提供载流从所述液流管道的分布有所述微筛的区域通过，并将微筛捕获的单细胞从液流管道内冲洗出，所述载流管道包括与所述液流管道连通的载流输入管道、载流输出管道；

弹性膜层，其设于所述液流层上；

微泵，至少用以驱使液流在所述液流管道内单向循环流动；以及

设置在所述弹性膜层上的气动控制层；

所述弹性膜层包括弹性膜，所述微筛包括连接在所述弹性膜暴露于所述液流管道内的局部表面上的一个以上微柱组，所述微柱组包括两个以上微柱，且其中两个微柱之间形成有能够阻滞单个细胞但使液流中的液体通过的间隙，所述微泵包括分布于所述气动控制层内的两条以上第三气动控制管道，当在设定时段向其中两条以上第三气动控制管道内分别输入具有不同压力的流体时，该两条以上第三气动控制管道能够分别驱使所述弹性膜的不同局部区域产生不同程度的形变和/或位移，从而在液流管道内产生能够驱使液流单向流动的力。

2.根据权利要求1所述的循环式单细胞捕获转移芯片，其特征在于：所述微柱的形状选自圆柱形、长方体、梯台、圆锥体、开放式槽型结构的任一种或者两种以上的任意组合。

3.根据权利要求1所述的循环式单细胞捕获转移芯片，其特征在于：所述液流管道内沿液流流动方向分布有复数个微筛组，每一微筛组包含一个以上微筛，且每一微筛组上、下游均设有一第二微阀。

4.根据权利要求1所述的循环式单细胞捕获转移芯片，其特征在于：所述第一微阀或第二微阀包括能够驱使弹性膜的局部区域挤压液流输入管道和/或液流输出管道，从而在所述液流输入管道和/或液流输出管道内的选定位置阻断液流的驱动机构。

5.根据权利要求4所述的循环式单细胞捕获转移芯片，其特征在于：所述驱动机构选自电致动机构、磁致动机构、光致动机构、液压驱动机构或气动机构。

6.根据权利要求4所述的循环式单细胞捕获转移芯片，其特征在于：所述第一微阀包括分布于所述气动控制层内的至少一第一气动控制管道或至少一第二气动控制管道，当向所述第一气动控制管道或第二气动控制管道内输入具有设定压力的流体时，所述第一气动控制管道或第二气动控制管道能够驱使所述弹性膜的局部区域挤压液流输入管道和/或液流输出管道，从而在所述液流输入管道和/或液流输出管道内的选定位置阻断液流。

7.根据权利要求4所述的循环式单细胞捕获转移芯片，其特征在于：所述第二微阀包括分布于所述气动控制层内的一条以上叉形气动控制管道，当向所述叉形气动控制管道输入具有设定压力的流体时，所述叉形气动控制管道的不同叉指部能够分别驱使所述弹性膜的不同局部区域挤压所述液流管道，从而在所述液流管道内的不同选定位置阻断液流。

8.根据权利要求4所述的循环式单细胞捕获转移芯片，其特征在于：所述载流管道上还设有第三微阀，所述第三微阀包括分布于所述气动控制层内的至少一第四气动控制管道和至少一第五气动控制管道，当向所述第四气动控制管道或第五气动控制管道内输入具有设定压力的流体时，所述第四气动控制管道或第五气动控制管道能够驱使所述弹性膜的局部区域挤压载流输入管道和/或载流输出管道，从而在所述载流输入管道和/或载流输出管道内的选定位置阻断载流。

9.根据权利要求8所述的循环式单细胞捕获转移芯片，其特征在于：所述第四气动控制管道和第五气动控制管道一体设置。

10.根据权利要求1所述的循环式单细胞捕获转移芯片，其特征在于：在所述液流管道内分布有所述微筛的区域内，载流的流动方向与所述液流的流动方向交叉。