CN109722385B - 一种操控和配对单微粒的微流控芯片及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于操控和配对单微粒的微流控芯片。所述芯片，包括通道层和控制层。所述的通道层包括多个捕获和转移单微粒的单元，每个单元由捕获流道，捕获腔室，捕获缝隙，转移流道，配对腔室，配对缝隙组成。所述的控制层位于捕获流道和配对流道的下方，与捕获流道和配对流道垂直并由隔膜隔离开。本芯片可高效率，精确操控单微粒的捕获和转移，并且经过不同轮数的单微粒捕获和转移后，可实现高通量，高效率的单微粒配对，且配对微粒的数量和种类可控。可广泛应用于单细胞的隔离与培养，单细胞异质性分析，多细胞共培养，多细胞相互作用及潜在机理的揭示等。

Description

一种操控和配对单微粒的微流控芯片及其应用

技术领域

本发明涉及一种操控和配对单颗粒的微流控芯片，其可应用于单细胞的隔离与培养，单细胞异质性分析，多细胞共培养，多细胞相互作用及潜在机理的揭示等。

背景技术

微流控技术由于具有微型化，集成化，高通量，精确操控微流体等优势，在物理，化学，生物，工程科学等领域得到越来越广泛的应用，其中一个重要的应用便是实现对单微粒的精确操控以及配对。以单细胞为例，细胞是生物体结构和功能的基本单位，多细胞生物的功能发挥离不开单细胞间的相互作用。因此，对细胞的全面准确认识，不仅需要从单细胞水平进行异质性分析，同时也需要深入探究多细胞间的复杂相互作用，而实现单细胞分析，多细胞相互作用的首要条件，便是建立对单细胞精确操控，配对的微流控平台。现有的微流控平台大多是基于细胞群的共培养，观察的是细胞的群体行为，无法在单细胞尺度上了解细胞间的相互作用模式。虽然也有基于流体力学的单细胞配对平台，但是目前的配对平台大多是基于两个细胞，对于数量更多，种类更多的多细胞配对，存在隔离和配对过程操作困难或者效率低的问题。比如将微流控技术和光场，磁场，声场，电场等结合起来，虽然可以实现多细胞配对，但是细胞种类缺乏选择性，并且操作繁琐，设备要求高。其他像微孔阵列，液滴体系等虽然能够实现大规模配对，并且能够兼容不同尺寸的细胞，但是由于存在泊松分布，所以很难实现特定数量和特定种类的多细胞配对。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种操控和配对单微粒的微流控芯片，该芯片可以简便高效的捕获和转移单微粒，实现不同数量，不同种类单微粒的配对，并且能够精确控制微环境。

为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种用于操控和配对单微粒的微流控芯片，其特征在于，包括通道层和控制层；其中，通道层设有多个单微粒捕获和转移单元；每个单元包括捕获流道，捕获腔室，捕获缝隙，转移流道，配对腔室，配对缝隙；捕获流道设有U形弯，U形弯两臂的端部之间连通形成捕获缝隙，捕获缝隙的进口端处设捕获腔室；在U形弯的上游的捕获流道，还设有一分支回路，所述的配对腔室位于该分支回路上，配对腔室一端设转移流道，并通过转移流道并入捕获流道主路，另一端设配对缝隙，配对缝隙再通过一连接管并入捕获流道主路；其中，转移流道并入捕获流道的第一交叉口，位于连接管并入捕获流道的第二交叉口的下游，捕获缝隙和配对缝隙的宽度小于捕获的单微粒直径；

所述的控制层包括捕获隔离流道和转移隔离流道，捕获隔离流道包括多个捕获隔离单元，每个多个捕获隔离单元设至少一捕获流道隔离阀，捕获流道隔离阀位于捕获流道的下方，第一交叉口和第二交叉口之间，和捕获流道之间由隔膜隔离；

转移隔离流道设多个转移隔离单元，每个转移隔离单元包括至少两个转移流道隔离阀，其中一个转移流道隔离阀位于转移流道下方和转移流道之间由隔膜隔离；另一个位于连接管下方，和连接管之间由隔膜隔离；

捕获流道设至少一样品入口以及至少一样品出口；捕获隔离流道和转移隔离流道分别包括一个入口。

在本发明中，所述的多个单微粒捕获和转移单元之间，可以采用串联连接，也可以采用并联方式连接，还可以是串联、并联混合方式连接。

在本发明中，多个转移隔离单元之间，可以采用串联、并联或串联并联混合方式连接；多个转移隔离单元之间，同样可以采用串联、并联或串联并联混合方式连接。

优选地，捕获流道设至少两个样品入口以及至少两个样品出口，不同样品进口供不同细胞进入。

优选地，所述的微流控芯片还包括载片，所述的载片位于控制层下方。

本发明的一个优选的实施方式中，通道的尺寸由具体使用和分析的微粒大小决定。一般的，捕获缝隙和配对缝隙的宽度可以是5-1000微米，例如：10微米，20微米，50微米，80微米，100微米，200微米，300微米或者400微米；深度可以是5-1000微米，例如10微米，20微米，50微米，80微米，100微米，200微米，300微米或者400微米。

本发明的一个优选的实施方式中，所述的微粒的直径可以是1-1000um，例如5微米，10微米，15微米，20微米，30微米，70微米，80微米或者90微米。

本发明的微流控芯片所用捕获层和载片材料可以是硅片，玻璃，聚甲基丙烯酸甲酯，聚乙烯，聚丙烯，聚氯乙烯和聚酯等，控制层的材料可以是聚甲基丙烯酸甲酯，聚乙烯，聚丙烯，聚氯乙烯和聚酯等。

本发明的一个优选的实施方式中，所用通道层和控制层的材料是聚二甲基硅氧烷PDMS，载片材料是玻璃。

本发明的一个优选的实施方式中，微粒通入的流速为0.005ml/h-10ml/h，例如0.01ml/h.0.05ml/h.0.1ml/h.0.2ml/h.0.5ml/h.0.8ml/h.1ml/h以及2ml/h。

本发明的一个优选的实施方式中，隔离泵所充满的物质可以为水溶液，油或者空气，采用控制注射泵的压力，控制隔离泵的压力。

本发明的一个优选的实施方式中，所述的微流控芯片基本工作流程为：

步骤A：在转移隔离流道入口注满溶液，增加注射泵压力，转移隔离阀形变，挤压转移流道最上层，直到转移流道被完全阻断开，从捕获流道入口用注射泵通入细胞悬浮液，当单细胞进入捕获单元时，因为流体流经捕获流道U型部分受到的阻力大于流经捕获腔室和捕获缝隙受到的阻力，因此细胞会先进入捕获腔室，由于捕获缝隙小于细胞，细胞被卡在捕获缝隙前，同时堵住捕获缝隙。此时，流经捕获腔室的流体阻力大大增加，后续的细胞无法再次进入该捕获腔室，只能通过U型捕获流道进入下一个捕获单元，这样就实现了单细胞捕获。在后续的单元中重复该细胞捕获过程，即可实现高通量单细胞的捕获。

步骤B：保持转捕获隔离阀关闭状态，即捕获隔离阀挤压捕获流道最上层，直到捕获流道被完全阻断开，保持样品进样隔离阀关闭状态，即样品进样隔离阀挤压入口处的捕获流道最上层，直到捕获流道被完全阻断开，拔去样品入口管子，在出口用注射泵通入细胞培养基，打开样品进样隔离阀，使捕获流道处于流通状态，同时打开转移隔离阀的压力，使细胞转移流道处于流通状态，当培养基进入捕获腔室时，捕获的单细胞会随着培养基在转移流道内的流通，被分别转移到各自对应的配对腔室。关闭转移隔离阀，即转移隔离阀挤压转移流道最上层，细胞转移流道被完全阻断开，打开捕获隔离阀，即撤掉捕获隔离阀内的压力。

步骤C：与步骤A相同，再次在捕获流道入口用注射泵通入细胞悬浮液，实现第二种细胞的高通量捕获，并与步骤B类似，实现第二种细胞的转移，至此，实现了两种细胞的配对。

步骤D：进行多细胞共培养。

按照类似的流程，重复步骤A和B，可以配对第三种，第四种细胞等，从而进行更多种细胞的共培养。

由于采用了以上技术方案，本发明具有如下的有益效果：

1.本发明采用微流控技术，具有高通量，易集成，易自动化，操作简便，消耗试剂少，节约成本的优点，

2.采用捕获流道，捕获腔室，捕获缝隙，转移流道，配对腔室，配对缝隙配合，基于流体力学捕获单微粒，克服了泊松分布，单微粒捕获效率高。

3.基于流体流动控制单微粒转移，操作简便且效率高，

4.经过几轮单微粒的捕获和转移后，实现单微粒的精确配对，即配对单微粒的数量和种类可控。

5.能够精确控制单微粒或配对多微粒的微环境，实现长期动态监控。

4.能够在单细胞尺度上进行单细胞分析，并且能够研究多细胞间的相互作用，并揭示其潜在的生物机理。

附图说明

图1细胞捕获和配对单元俯视图(含通道层和控制层)

图2细胞捕获和配对单元通道层示意图

图3细胞捕获和配对单元控制层示意图

图4芯片整体俯视图

图5芯片通道层整体俯视图

图6芯片控制层整体俯视图

图7芯片剖视图

A通道层

B控制层

C载片

1.捕获流道

2.捕获腔室

3.捕获缝隙

4.转移流道

5.配对腔室

6.配对缝隙

7.捕获流道隔离阀

8.转移流道隔离阀

9.第一样品入口

10.第二样品入口

11.第一样品出口

12.第二样品出口

13.第一样品进样隔离阀

14.第二样品进样隔离阀

15.捕获隔离流道入口

16.转移隔离流道入口

17.捕获隔离流道

18.转移隔离流道

19连接管

20隔膜

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式，以操控和配对单细胞为例，对本发明做进一步详细说明。

实施例1

如图7所示，本发明用于操控和配对单微粒的芯片，包括通道层A，控制层B和载片C三部分，其中，通道层A位于最上层，控制层B位于中间，载片位于最下层。

其中通道层A包括多个单微粒捕获和转移单元,在本实施例中，这些单元之间采用串联方式连接(如图4和图5所示)。在其它的实施例中，这些单元之间也可以采用并联或是串并联混合方式连接。

参见图1至图6，每个单元包括捕获流道1，捕获腔室2，捕获缝隙3，转移流道4，配对腔室5和配对缝隙6。在图1中，捕获流道1的流向为从左至右。

捕获腔室2位于捕获流道1内，该处形成U形弯，U形弯两臂的端部之间连通形成捕获缝隙3，捕获缝隙3的进口端附近即捕获腔室2。在U形弯上游的捕获流道1上，还设有一分支回路，所述的配对腔室5位于该分支回路上，配对腔室5一端设转移流道4，并通过转移流道4并入捕获流道主路，另一端设配对缝隙6，配对缝隙6再通过一连接管19并入捕获流道1主路；其中，转移流道4并入捕获流道1交叉口(第一交叉口m)，位于连接管并入捕获流道的交叉口(第二交叉口n)的下游。该转移流道4直径大于待捕获的单颗粒的直径。

捕获流道1，捕获腔室2，捕获缝隙3用于单微粒捕获，转移流道4，配对腔室5，配对缝隙6用于单微粒配对。前一单元的捕获流道右端连接后一单元捕获流道的左端。最前面的捕获单元，入口端连接有两个样品入口，即第一样品入口9和第二样品入口10，最后面的捕获流道，出口端连接有两个样品出口，即第一样品出口11和第二样品出口12。

捕获腔室2和捕获缝隙3位于捕获流道中U型部分的两臂之间，捕获流道1和转移流道4的宽度大于待捕获的单微粒的直径，捕获缝隙3和配对缝隙6的宽度小于待捕获的单微粒的直径。

控制层B同样包括多个单元，每个单元由捕获隔离流道17，捕获流道隔离阀7和转移隔离流道18，转移流道隔离阀8等组成，控制层还包括样品进样隔离阀(13和14)。

其中捕获流道隔离阀7和捕获隔离流道17连通，位于第一交叉口m和第二交叉口n之间的捕获流道1下方，和捕获流道1之间由隔膜20隔开。

转移流道隔离阀8具有两个，都和转移隔离流道18连通，其中一个转移流道隔离阀8位于转移流道4下方，另一个位于连接管19下方，和转移流道或连接管之间分别由隔膜20隔开。

在本实施例中，多个单元的捕获隔离流道17前后串联形成一排，多排的单元具有一共同的捕获隔离流道入口15；多个单元的转移隔离流道18前后串联形成一排，多排的第一具有一共通的转移隔离流道入口16，捕获隔离流道17和转移隔离流道18的总体布置方向相反，如图6所示。两个样品进样隔离阀(13/14)，分别位于两个样品入口(第一样品入口9和第二样品入口10)的下方。捕获隔离流道和转移隔离流道，样品进样隔离阀分别含有一个入口。

作为本发明的优选实施方式，所述的捕获流道，配对流道宽度为30微米，深度为28微米，捕获腔室的长度为14微米，宽度为14微米，捕获缝隙长度为15um，宽度为10微米，捕获和转移单元为160个。

作为本发明的优选实施方式，所用的细胞为K562细胞，细胞直径为10-20微米。

为本发明的优选实施方式，控制层中所述的隔离流道宽度为30um，高度为18um。

作为本发明的优选实施方式，所述的所有入口均为圆柱形孔，直径为1.00毫米。

作为本发明的优选实施方式，所述的捕获层和控制层的材料均为聚二甲基硅氧烷PDMS。

作为本发明的优选实施方式，所述的载片材料为玻璃。

作为本发明的优选实施方式，隔离流道充满水溶液，通过控制注射泵的驱动压力，控制隔离阀的驱动压力。

作为本发明的优选实施方式，所选用的细胞流速为0.05ml/h。

精确操控和配对单细胞的具体工作过程为:

步骤A：在转移隔离流道入口注满溶液，增加注射泵压力，转移隔离阀形变，挤压转移流道最上层，直到转移流道被完全阻断开，从捕获流道入口用注射泵通入细胞悬浮液，当单细胞进入捕获单元时，因为流体流经捕获流道U型部分受到的阻力大于流经捕获腔室和捕获缝隙受到的阻力，因此细胞会先进入捕获腔室，由于捕获缝隙小于细胞，细胞被卡在捕获缝隙前，同时堵住捕获缝隙。此时，流经捕获腔室的流体流阻力大大增加，后续的细胞无法再次进入该捕获腔室，只能通过U型捕获流道进入下一个捕获单元，这样就实现了单细胞捕获。在后续的单元中重复该细胞捕获过程，即可实现高通量单细胞的捕获。

步骤B：保持转捕获隔离阀关闭状态，即捕获隔离阀挤压捕获流道最上层，直到捕获流道被完全阻断开，保持样品进样隔离阀关闭状态，即样品进样隔离阀挤压入口处的捕获流道最上层，直到捕获流道被完全阻断开，拔去入口管子，在出口用注射泵通入细胞培养基，打开样品进样隔离阀，使捕获流道处于流通状态，同时打开转移隔离阀的压力，使细胞转移流道处于流通状态，当培养基进入捕获腔室时，捕获的单细胞会随着培养基在转移流道内的流通，被分别转移到各自对应的配对腔室。关闭转移隔离阀，即转移隔离阀挤压转移流道最上层，细胞转移流道被完全阻断开，打开捕获隔离阀，即撤掉捕获隔离阀内的压力。

步骤C：与步骤A相同，再次在捕获流道入口用注射泵通入细胞悬浮液，实现第二种细胞的高通量捕获，并与步骤B类似，实现第二种细胞的转移，至此，实现了两种细胞的配对。按照类似的流程，可以配对第三种，第四种细胞等。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细特征以及详细方法，但本发明并不局限于上述详细特征以及详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细特征以及详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明白，对本发明的任何改进，对本发明选用组分的等效替换、具体方式的选择等，均属于本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种用于操控和配对单微粒的微流控芯片，其特征在于，包括通道层和控制层；其中，通道层设有多个单微粒捕获和转移单元；每个单元包括捕获流道，捕获腔室，捕获缝隙，转移流道，配对腔室，配对缝隙；捕获流道设有U形弯，U形弯两臂的端部之间连通形成捕获缝隙，捕获缝隙的进口端处设捕获腔室；在U形弯的上游的捕获流道，还设有一分支回路，所述的配对腔室位于该分支回路上，配对腔室一端设转移流道，并通过转移流道并入捕获流道主路，另一端设配对缝隙，配对缝隙再通过一连接管并入捕获流道主路；其中，转移流道并入捕获流道的第一交叉口，位于连接管并入捕获流道的第二交叉口的下游，捕获缝隙和配对缝隙的宽度小于待捕获的单微粒直径；

所述的控制层包括捕获隔离流道和转移隔离流道，捕获隔离流道设多个捕获隔离单元，每个捕获隔离单元包括至少一捕获流道隔离阀，捕获流道隔离阀位于捕获流道的下方，第一交叉口和第二交叉口之间，和捕获流道之间由隔膜隔离；

转移隔离流道设多个转移隔离单元，每个转移隔离单元包括至少两个转移流道隔离阀，其中至少一个转移流道隔离阀位于转移流道下方，和转移流道之间由隔膜隔离；至少一个位于连接管下方，和连接管之间由隔膜隔离；

捕获流道设至少一样品入口以及至少一样品出口；捕获隔离流道和转移隔离流道分别设一入口。

2.根据权利要求1所述的一种用于操控和配对单微粒的微流控芯片，其特征在于，所述的多个单微粒捕获和转移单元之间，采用串联、并联或串联并联混合方式连接。

3.根据权利要求1所述的一种用于操控和配对单微粒的微流控芯片，其特征在于，捕获流道设至少两个样品入口以及至少两个样品出口。

4.根据权利要求1所述的一种用于操控和配对单微粒的微流控芯片，其特征在于，还包括载片，所述的载片位于控制层下方。

5.根据权利要求1所述的一种用于操控和配对单微粒的微流控芯片，其特征在于，所述的捕获流道和转移流道的宽度为5-1000微米，深度为5-1000微米；捕获缝隙和转移缝隙的宽度为5-300微米，深度为5-300微米。

6.根据权利要求1所述的一种用于操控和配对单微粒的微流控芯片，其特征在于，多个转移隔离单元之间，采用串联、并联或串联并联混合方式连接；多个转移隔离单元之间，采用串联、并联或串联并联混合方式连接。

7.根据权利要求1所述的一种用于操控和配对单微粒的微流控芯片，其特征在于，捕获隔离流道和转移隔离流道内充有水溶液，油或者空气，通过注射泵来控制隔离流道的压力。

8.如权利要求1至7任一项所述的一种用于操控和配对单微粒的微流控芯片的用途，用于单细胞的隔离与培养，单细胞异质性分析，多细胞共培养或多细胞相互作用研究，所述应用不用于诊断和治疗。

9.一种多细胞共培养方法，采用权利要求1至7任一项所述的微流控芯片，包括如下步骤：

步骤A：在转移隔离流道入口注满溶液，增加注射泵压力，转移隔离阀形变，挤压转移流道最上层，直到转移流道被完全阻断开，从捕获流道入口用注射泵通入细胞悬浮液，进行单细胞捕获；

步骤B：保持转捕获隔离阀关闭状态，即捕获隔离阀挤压捕获流道最上层，直到捕获流道被完全阻断开，保持样品进样隔离阀关闭状态，即样品进样隔离阀挤压入口处的捕获流道最上层，直到捕获流道被完全阻断开，打开入口，在出口通入细胞培养基，打开样品进样隔离阀，使捕获流道处于流通状态，同时打开转移隔离阀的压力，使细胞转移流道处于流通状态；当培养基进入捕获腔室时，捕获的单细胞会随着培养基在转移流道内的流通，被分别转移到各自对应的配对腔室；关闭转移隔离阀，即转移隔离阀挤压转移流道最上层，细胞转移流道被完全阻断开，打开捕获隔离阀，即撤掉捕获隔离阀内的压力；

步骤C：与步骤A相同，再次在捕获流道入口用注射泵通入细胞悬浮液，实现第二种细胞的捕获，以及进行步骤B，实现第二种细胞的转移；

步骤D：进行多细胞共培养。

10.如权利要求9所述的一种多细胞共培养方法，其特征在于，步骤D之前，重复步骤A和B一次或多次，加入第三种或更多种细胞。

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