CN113070107B - 一种用于精准组装单微粒的微流控芯片及单微粒组装方法 - Google Patents
一种用于精准组装单微粒的微流控芯片及单微粒组装方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于精准组装单微粒的微流控芯片及单微粒组装方法。所述微流控芯片结构包括通道层和封闭层。其中通道层结构包含两条并行独立的通道,分别含有捕获通道、环形旁路、组装腔室。其操作步骤包括:(1)进行单微粒的捕获(2)通过反向通溶液,转移单微粒到组装腔体(3)经过多次的捕获和转移,实现多细胞的组装。该芯片基于流体力学原理可以实现高效的单细胞捕获,通过流体流向的控制,操纵单微粒的组装,经过多次重复捕获和组装,即可实现精准的单微粒组装。该发明可应用于单细胞RNA测序、单细胞共培养、细胞分泌蛋白检测、单细胞相互作用分析等研究应用领域。
Description
技术领域
本发明涉及一种精准组装单微粒的微流控芯片,其可应用于单细胞RNA测序、单细胞共培养、细胞分泌蛋白检测、单细胞相互作用分析等领域。
背景技术
单微粒组装对于研究微粒性质和功能具有重要意义,以单细胞为例,细胞存在着很强的异质性,传统基于群体细胞的分析往往掩盖了细胞间的异质性,而获得平均的表达信息,而很多时候是个性化的单细胞功能对生理以及疾病起着重要作用。微流控芯片被称为“芯片实验室”,具有小型化,一体化,高通量,尺寸和单微粒相匹配等优点,因此,特别适用于单微粒的分析。然而,现有的微流控芯片装置的可控组装能力有限。比如微阵列或者液滴微流控系统,受到泊松分布的限制,导致大多数微孔或者液滴中是不含有单微粒的空微孔或者空液滴,只有少数含有单个微粒,更加无法精准控制微孔或者液滴中组装的细胞数目。其他类型的微流控装置,比如基于流体动力学捕获原理的微流控芯片,大多数仍然无法实现真正的精准组装。另外,近年涌现一些可用于多种微粒组装的微流控芯片,一次操作往往只能实现一种类型单微粒的捕获和组装,而较难实现单次操作同时获得两种不同类型单微粒的捕获和组装。
发明内容
为了解决上述问题和不足,本发明的目的在于提供一种精准组装单微粒的微流控芯片。该芯片可以实现高效的单微粒捕获和组装,并且可以精准控制组装的数量和类型,同时该芯片含有两个通道,可以实现并行捕获两种单微粒,一次转移到组装腔体即可实现两种微粒的组装。
为了达到上述目的,本发明采用如下技术方案:
一种用于精准组装单微粒的微流控芯片,包括通道层和封闭层,其中,所述的通道层含有两条并行的第一通道和第二通道,每条通道包括至少一样品入口以及一样品出口,还包括设于样品入口和样品出口之间的复数个基本单元,其中:
每个基本单元包括两条捕获通道、两条旁路通道和一个组装腔体;两个捕获通道设于所述的组装腔体的一侧,和样品入口连接的通道在靠近组装腔体处分叉为捕获通道和旁路通道,两个旁路通道的出口分别连接下一基本单元的进口,且每个旁路通道的出口分别具有一反向延伸段连通至组装腔体;所述的两条捕获通道的捕获缝隙尺寸不同。
优选地,旁路通道包括多个连接段,所述的连接段为“几”字形,多个几字形从小到大排列依次向外叠加,且相邻的几字形的有一端连接,构成串联的通道。
优选地,第一通道的旁路通道和第二通道的旁路通道对称排列,分别设置在组装腔体的两侧。
优选地,捕获通道为喇叭形,喇叭小口的一端位于组装腔体的一侧。
优选地,所述芯片结构还包含封闭层,通道层与封闭层通过键合实现通道的密闭性。
优选地,所述通道层中的每个基本单元通过串联的形式连接在一起。
优选地,所述第一通道或第二通道的宽度为5-1000微米,深度为5-100微米;捕获通道的宽度为5-50微米,组装腔体的宽度为50-500微米,深度为50-500微米。
优选地,所述组装腔体的深度大于其余通道深度。
本发明还提供所述的用于精准组装单微粒的微流控芯片的用途,用于单细胞RNA测序、单细胞共培养、细胞分泌蛋白检测、单细胞相互作用分析等研究应用领域。
本发明还提供单微粒的组装方法,采用所述的微流控芯片,方法包括如下步骤:
(1)在第一通道和第二通道的样品入口分别通入含有单微粒的悬浮液;每一个通道中的单微粒到达捕获通道和旁路通道交叉位置时,单微粒被捕获通道所捕获;当捕获通道位点被单个单微粒占据后,捕获通道的位置流体阻力增大,因此,后续的单微粒进入旁路通道,进入下一个基本单元进行单微粒的捕获;
(2)从第一通道和第二通道的样品入口分别通入洗涤液,用于清洗芯片通道中残留的多余的单微粒;
(3)从第一通道和第二通道的样品出口通入溶液,使得被捕获通道所捕获的单微粒从捕获通道被反向冲洗到组装腔体中,同时通过控制洗涤液的流速以及基于组装腔体高度较高的优势,转移到组装腔体中的单微粒降低流速,实现单个单微粒的组装;
(4)重复步骤(1)-(3),进行单微粒的捕获、转移,从而实现第二次的组装,实现单微粒的数量,类型的可控精准组装。
本发明一种用于精准组装单微粒的微流控芯片,包括通道层和封闭层。其中,所述的通道层含有两条并行独立的通道,每条通道含有多个基本单元,其中每个基本单元包括捕获通道,旁路通道流道,组装腔体。捕获通道呈喇叭形,与旁路通道构成可供单微粒前行的两条路径。每个组装腔体相互连通,因此,在捕获单微粒之后,通过反向通溶液,即可实现该单元捕获的单微粒转移至上一个单元的组装腔体中。两条通道的捕获通道一大一小,分别实现大、小粒径单微粒的捕获,同时每个捕获通道的最小缝隙小于所能捕获单微粒的粒径。
本发明的微流控芯片所用捕获层和载片材料可以是硅,石英,玻璃以及有机聚合物等。有机聚合物可以是聚二甲基硅氧烷,聚碳酸酯,聚甲基丙烯酸甲酯,聚乙烯,聚丙烯等。
作为优选,本发明所用通道层和控制层的材料是聚二甲基硅氧烷PDMS,封闭层是玻璃载玻片。
所述的通道层包含有用于单微粒捕获和转移的主体微流体通道,接着与密封层通过键合形成密封通道,以防止溶液泄露。
所述的单微粒可以为:细胞、磁珠、各种材质的微球等。
本发明的一个优选的实施方式中,微粒悬液通入的流速为0.002ml/h-5ml/h,例如0.02ml/h,0.05ml/h,0.1ml/h。
所述的通道层内微流体通道进行超疏水化处理。采用氟代硅烷如二甲基十八烷基氯硅烷,1H,1H,2H,2H-全氟辛基硅烷、1H,1H,2H,2H-全氟辛基二甲基氯硅烷、1H,1H,2H,2H-全氟辛基三氯硅烷等或者采用氟油如EGC-1700、EGC-1720、EGC-1702、FC-722、FC-724等进行超疏水处理。
本发明的一个优选的实施方式中,所述的用于精准组装单微粒的微流控芯片的主要操作步骤包括:(1)进样:在通道入口通入含有一定浓度单微粒的悬浮液;(2)捕获:(3)组装,基本工作流程为:
步骤A:从芯片两个并行通道分别灌注溶液,以排除芯片气泡,同时封闭芯片,防止单微粒的黏附。接着,将溶液换成单微粒悬浮液,分别从两个通道的入口进行进样,使得单微粒分别进入两个通道。每一个通道中的单微粒到达捕获通道和S行旁路交叉位置时,可供选择的有两个前行路径,分别为捕获通道和旁路通道流道,由于捕获通道的流体阻力更低,而旁路通道的路径较长,流体阻力更高,因此,单微粒会被捕获通道所捕获。当捕获通道位点被单个单微粒占据后,捕获通道的位置流体阻力增大,因此,后续的单微粒会进入旁路通道,实现单微粒的高效捕获。
步骤B:从芯片进样口通入洗涤液,用于清新芯片通道中残留的多余的单微粒,然后拔掉进样口的管子,从出样口通入溶液,使得被捕获通道所捕获的单微粒从捕获通道被冲洗到组装腔体中,同时通过控制洗涤液的流速以及基于组装腔体高度较高的优势,转移到组装腔体中的单微粒降低流速,实现单个单微粒的组装。同时由于芯片设计两个独立的通道,因此,一次转移即可实现两个单微粒的组装。
步骤C:重复步骤A,进行单微粒的捕获,以及重复步骤B进行单微粒的转移,从而实现第二次的组装,以获得单微粒的数量,类型的可控精准组装。
本发明进行单微粒组装的优点是:1.该芯片只包含一层通道层,制作简单,同时没有复杂的泵阀结构,芯片上进行全流程操作简单。2.基于流体力学原理进行单微粒捕获,捕获效率高。3.通过设计两条含有不同尺寸捕获通道的并行通道,可以满足不同粒径微粒的同时捕获和转移。4.可以实现高通量的单微粒捕获和转移。5.本发明与其它组装单微粒微流控芯片相比能够实现更加准确的单微粒组装,包括组装的单微粒类型、单微粒数量都可以精准控制,同时通过设计两条并行通道,一次操作即可获得两种不同单微粒的组装。6.由于设计较高深度的组装腔体,降低该腔体内的流体流速,有助于多个微粒的组装,可以实现单微粒的长期保存,有利于后续检测。
附图说明
图1芯片剖视图
图2绘示了实施例1芯片整体结构示意图
图3绘示了实施例1芯片高度表征图
图4绘示了实施例1芯片通道基本单元示意图
图5为实施例2的单细胞捕获结果
图6为实施例2的单细胞组装结果
图7为实施例2的多个单细胞组装结果
图8为实施例3的两种不同粒径单微球同时捕获结果
图9为实施例3的两种不同粒径单微球组装结果
A通道层
B封闭层
1A.第一通道
2A.第二通道
1A-1:第一通道进口段
1A-2:旁路通道
1A-3:连接段
1A-4:旁路通道进出口段
1A-5:出口段
1A-6:反向延伸段
1.捕获通道 2.组装腔体 3.第一进样口 4.第二进样口 5.第三进样口
6.第四进样口 7.第一出样口 8.第二出样口 9.第三出样口
10.第四出样口 11.微柱 12捕获通道 13捕获通道
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式,以精确组装单细胞和单微球为例,对本发明做进一步详细说明。
实施例1用于精准组装单微粒的PDMS材质微流控芯片
本发明芯片参照图1所示,芯片结构包含通道层A和封闭层B两部分组成,其中通道层位于上层,封闭层位于下层,通道层A的底部设有凹槽从而形成捕获通道1和组装腔体2,其中,组装腔体2高度高于捕获通道1。
通道结构包含多个连接在一起的基本单元,在本实施例中,这些基本单元之间采用串联的形式连接在一起(如图2和图3所示)。而基本单元的连接方式并不局限于本实施例的方法,还可以采用并联的方式进行连接。
芯片的通道层结构参照图1至图3,包括2个通道(即第一通道1A和第二通道2A),4个进样口,4个出样口和基本单元,分别为:第一进样口3、第二进样口4,第三进样口5,第四进样口6,第一出样口7、第二出样口8,第三出样口9,第四出样口10,同时在4个进样口各设计了一些扇形的微柱11,以过滤溶液中的杂质。在图2中,并行的两个通道1A,2A的流向为从右至左。
在芯片的通道层设置的两条并行的通道,可以同时捕获两种单微粒,即第一通道1A和第二通道2A。其中,
第一通道1A包括:位于该通道右侧的第一进样口3,第二进样口4和位于通道左侧的第一出样口7,第二出样口8,以及基本单元构成。同时组装腔体2设置为方形,在光刻时,叠加一层,使得组装腔体2的高度高于其他结构,如图4。
第二通道2A包括:位于该通道左侧的第三进样口5,第四进样口6和位于通道左侧的第三出样口9,第四出样口10,以及基本单元构成。
如图3所示,第一通道1A和第二通道2A分别从右侧垂直连接于组装腔体12的右侧壁上。以第一通道1A为例,在靠近组装腔体2的位置,第一通道1A的进口段1A-1分为捕获通道12和旁路通道1A-2,所述的捕获通道12截面为喇叭形,喇叭小的一端朝向组装腔体2。旁路通道1A-2的进口和进口段1A-1垂直,旁路通道1A-2包括多个连接段1A-3,所述的连接段1A-3为“几”字形,多个(本实施例中有七个)几字形从小到大排列依次向外叠加,且相邻的几字形的有一端连接(例如,第一个几字形的左末端和第二个几字形的左末端连接,第二个几字形的右末端和第三个几字形的右末端连接,以此类推),构成串联的通道,最后一个几字形(也即最外侧的)的左端旁路通道出口段1A-4和该基本单元的出口段1A-5连接,所述的出口段1A-5连接下一基本单元的进口段。并且,所述的出口段1A-5通过反向延伸段1A-6连通至组装腔体2。每个单元(包括组装腔体2和所有几字形)整体上为方形,组装腔体2位于中间,两个通道的几字形分别对称设于组装腔体2两侧,能够充分利用平面空间。
第二通道2A的形状和第一通道1A除了捕获通道大小差异外,基本相同。其具有捕获通道13。其中,捕获通道12和捕获通道13的开口大小不同,以实现不同粒径单微粒的捕获。组装腔体2的宽度宽于通道的其余部分,同时深度也更深于通道的其余部分。
作为本发明的优选实施方式,第一通道1A的通道宽为25微米,深度为50微米,捕获通道14的长度为20微米,最狭窄的宽度为8微米,第二通道2A的通道宽为40微米,深度为50微米,捕获通道16的长度为20微米,最狭窄的宽度为15微米,组装腔体2深度为150微米。
作为本发明的优选实施方式,所述的通道层层的材料均为聚二甲基硅氧烷,封闭层材料为玻璃。
实施例2精准组装单微粒
作为本发明的优选实施方式,所用的细胞为K562细胞,细胞直径为10-20微米,所用的两种微球为聚苯乙烯微球,直径为20微米和40微米。
作为本发明的优选实施方式,所选用的细胞流速为0.02ml/h。作为本发明的优选实施方式,所选用的微球流速为0.05ml/h。
作为本发明的优选实施方式,反向反冲的流速为0.05ml/h。
精确组装单微粒的具体工作过程为:
步骤A:从芯片两个并行通道分别灌注溶液,以排除芯片气泡,同时封闭芯片,防止单微粒的黏附。接着,将溶液换成单微粒悬浮液,分别从两个通道的入口进行进样,使得单微粒分别进入两个通道。每一个通道中的单微粒到达捕获通道14和旁路通道1A-2交叉位置时,可供选择的有两个前行路径,分别为捕获通道和旁路通道流道,由于捕获通道的流体阻力更低,而旁路通道的路径较长,流体阻力更高,因此,单微粒会被捕获通道所捕获,如果只在一个通道通入单微粒溶液,在本实施例中使用单细胞悬浮液,则只在一个通道的捕获通道捕获到单细胞如图5所示。如果在两个通道分别通入两种单微粒溶液,则可以在两个通道的捕获通道分别捕获到对应的两种单颗粒,在本实施例中使用两种不同粒径的微球,因此捕获通道捕获到相应两种粒径的微球如图8所示。当捕获通道位点被单个单微粒占据后,捕获通道的位置流体阻力增大,因此,后续的单微粒会进入旁路通道,实现单微粒的高效捕获。
步骤B:从芯片进样口通入洗涤液,用于清洗芯片通道中残留的多余的单微粒,然后拔掉进样口的管子,从出样口通入溶液,使得被捕获通道所捕获的单微粒从捕获通道被反向冲洗,经过进口段1A-1,再通过前一基本单元的出口段1A-5,最后通过反向延伸段1A-6进入到前一基本单元的组装腔体中,同时通过控制洗涤液的流速以及基于组装腔体高度较高的优势,转移到组装腔体中的单微粒降低流速,实现单个单微粒的组装,如图6。同时由于芯片设计两个独立的通道,因此,一次转移即可实现两个单微粒的组装.如图9。
步骤C:重复步骤A,进行单微粒的捕获,以及重复步骤B进行单微粒的转移,从而实现第二次的组装,以获得单微粒的数量,类型的可控精准组装。其结果见图7。
申请人声明,本发明通过上述实施例来说明本发明的详细特征以及详细方法,但本发明并不局限于上述详细特征以及详细方法,即不意味着本发明必须依赖上述详细特征以及详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明白,对本发明的任何改进,对本发明选用组分的等效替换、具体方式的选择等,均属于本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (10)
1.一种用于精准组装单微粒的微流控芯片,其特征在于,包括通道层和封闭层,其中,所述的通道层含有两条并行的第一通道和第二通道,每条通道包括至少一样品入口以及一样品出口,还包括设于样品入口和样品出口之间的复数个基本单元,其中:
每个基本单元包括两条捕获通道、两条旁路通道和一个组装腔体;两个捕获通道设于所述的组装腔体的一侧,和样品入口连接的通道在靠近组装腔体处分叉为捕获通道和旁路通道,两个旁路通道的出口分别连接下一基本单元的进口,且每个旁路通道的出口分别具有一反向延伸段连通至组装腔体;所述的两条捕获通道的捕获缝隙尺寸不同。
2.如权利要求1所述的一种用于精准组装单微粒的微流控芯片,其特征在于,旁路通道包括多个连接段,所述的连接段为“几”字形,多个几字形从小到大排列依次向外叠加,且相邻的几字形的有一端连接,构成串联的通道。
3.如权利要求1所述的一种用于精准组装单微粒的微流控芯片,其特征在于,第一通道的旁路通道和第二通道的旁路通道对称排列,分别设置在组装腔体的两侧。
4.如权利要求1所述的一种用于精准组装单微粒的微流控芯片,其特征在于,捕获通道为喇叭形,喇叭小口的一端位于组装腔体的一侧。
5.如权利要求1所述的一种用于精准组装单微粒的微流控芯片,其特征在于,所述芯片结构还包含封闭层,通道层与封闭层通过键合实现通道的密闭性。
6.如权利要求1所述的一种用于精准组装单微粒的微流控芯片,其特征在于,所述通道层中的每个基本单元通过串联的形式连接在一起。
7.如权利要求1所述的一种用于精准组装单微粒的微流控芯片,其特征在于,所述第一通道或第二通道的宽度为5-1000微米,深度为5-100微米;捕获通道的宽度为5-50微米,组装腔体的宽度为50-500微米,深度为50-500微米。
8.如权利要求1所述的一种用于精准组装单微粒的微流控芯片,其特征在于,所述组装腔体的深度大于其余通道深度。
9.如权利要求1至8任一项所述的用于精准组装单微粒的微流控芯片的用途,用于单细胞RNA测序、单细胞共培养、细胞分泌蛋白检测、单细胞相互作用分析等研究应用领域。
10.单微粒的组装方法,采用权利要求1至8任一项所述的微流控芯片,方法包括如下步骤:
(1)在第一通道和第二通道的样品入口分别通入含有单微粒的悬浮液;每一个通道中的单微粒到达捕获通道和旁路通道交叉位置时,单微粒被捕获通道所捕获;当捕获通道位点被单个单微粒占据后,捕获通道的位置流体阻力增大,因此,后续的单微粒进入旁路通道,进入下一个基本单元进行单微粒的捕获;
(2)从第一通道和第二通道的样品入口分别通入洗涤液,用于清洗芯片通道中残留的多余的单微粒;
(3)从第一通道和第二通道的样品出口通入溶液,使得被捕获通道所捕获的单微粒从捕获通道被反向冲洗到组装腔体中,同时通过控制洗涤液的流速以及基于组装腔体高度较高的优势,转移到组装腔体中的单微粒降低流速,实现单个单微粒的组装;
(4)重复步骤(1)-(3),进行单微粒的捕获、转移,从而实现第二次的组装,实现单微粒的数量,类型的可控精准组装。
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