CN112553048A - 一种细胞分选方法和芯片 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物医学领域，特别提供一种细胞分选方法和芯片，在微流控芯片的分选区域设置微柱阵列，所述微柱的截面形貌为桃形或者水滴形。实现目标细胞的高通量高精度分选、捕获、贮存、按需释放和收集功能，为细胞的后续测试提供有力的研究工具。

Description

一种细胞分选方法和芯片
技术领域
本发明涉及生物医学领域，特别涉及一种用于稀有细胞分选和捕获的微流控芯片、制作方法及其应用方法。
背景技术
世界卫生组织研究表明，肿瘤转移造成了多达90％的癌症致死病例，若能及早发现并诊治肿瘤转移，至少可避免30％死亡病例的发生。循环肿瘤细胞(Circulating tumorcells,CTCs)，作为存在于人体外周血中数量稀少的一类细胞，在临床上被认为是发生肿瘤转移的早期征兆，因而检测血液中的循环肿瘤细胞对癌症的早期诊断具有重要意义。循环肿瘤细胞在人体血液内含量极低，在1ml病人血液中含量仅为1-100个。因此，如何在保持细胞活性的前提下精确高效地移除血细胞，分离稀有循环肿瘤细胞是进行后续分析计数检测步骤的重要前提。
传统的细胞分选和捕获技术包括基于细胞生物特性的分选捕获方法(如使用免疫磁珠捕获细胞，使用人工抗体捕获细胞等)、基于细胞物理特性的分选捕获方法(如使用膜过滤分离技术，使用密度梯度离心技术等)等，但基于细胞生物特性的方法所使用的标记物会对细胞造成生理损伤并且很难清除；由于细胞具有可变形性且密度相差很小，传统的膜过滤分离和密度梯度离心方法通常分选率低、纯度较差，不适合稀有细胞分选。
微流控芯片结构特征尺寸与细胞相匹配，具有高精度、高通量、低成本的优势，非常适合于应在用稀有细胞分选领域，受到广泛关注。目前，确定性侧向位移的微流控技术分选技术是细胞分选领域的热点技术，利用特殊设置的微米级柱阵列结构，依据尺寸对细胞进行分离，小尺寸细胞维持在进入阵列时的侧向位置上，大尺寸细胞沿着微柱排列的方向，向阵列一侧聚集，从而实现分选，确定性侧向位移分选的分离尺寸范围为微米至20纳米，具有通量高、回收率高、可连续分离等优势。但其分选性能受到微柱截面形貌的影响，圆形作为较多采用的微柱截面形貌，对微柱间隙内流速调控能力低，存在分选通量低、易堵塞、所需周期多、芯片长度长的劣势。同时，采用圆形等传统微柱截面形貌无法对尺寸接近的细胞进行精确分离，例如较大的白细胞和较小的循环肿瘤细胞尺寸接近。
传统基于尺寸的细胞捕获技术是在流道中间设置阵列微槽来捕获细胞，依靠流体反向流动来释放被捕细胞，但是在流道中间设置阵列微槽易造成流动堵塞，并且只能依靠流体反向流动来释放所有被捕细胞，无法按需释放细胞。还不能满足稀有细胞等对高分离通量、低堵塞概率、高回收率、高纯度的分选的需求。
发明内容
本发明为解决上述问题，提供一种细胞分选方法和芯片。
本发明的第一目的在于提供一种阵列微结构的多功能细胞分选捕获微流控芯片；本发明第二目的是解决目标细胞与背景细胞尺度相差小，细胞变形误差不可忽略情况下适用的一种优化后可获得分选区域压力梯度的高精度分选结构。本发明的第三目的在于提供一种基于所述微流控芯片实现肿瘤细胞分选、捕获的应用方法。集成芯片具有按需释放被捕细胞、不易堵塞流体流动、多功能捕获等优势。
为实现上述目的，本发明采用以下具体技术方案：
本发明的第一方面，提供一种集分选和捕获技术一体的基于阵列微结构的多功能微流控芯片，以解决现有技术中圆形截面微柱分离能力低、传统捕获技术易堵塞流道、无法按需释放被捕细胞能力的不足，提供一种可以高回收率高纯度分选细胞、按需释放细胞、长期贮存细胞、不易堵塞流体流动的新型阵列微结构和多功能细胞分选捕获微流控芯片。
芯片设计可以根据目标细胞与杂质细胞的尺寸大小关系和变形性的关系选择采用单一式方案或级联式方案，并选择采用桃形或者水滴形微柱结构，其中单一式方案具有两个出口，分选完毕的目标细胞从顶部或底部流道流向捕获区域，级联式方案具有三个出口，分选完毕的目标细胞从底部流道或者中间过渡流道或者顶部出口流向捕获区域，其中对于尺寸差异较大的细胞采用水滴形微柱结构，对于可变形性差异较大的细胞采用桃形微柱结构，水滴形微柱是根据细胞尺寸差异区分细胞，不同位移分数的水滴形微柱阵列具有不同的尺寸分选临界半径值，尺寸小于尺寸分选临界值的细胞将在阵列间穿行，在垂直于流动方向上没有位移，尺寸大于尺寸分选临界值的细胞将沿着微柱排列的方向运动，发生垂直于流动方向的位移。桃形微柱是根据细胞变形性差异区分细胞，不同位移分数的桃形微柱阵列具有不同的可变形性分选临界半径值，可变形性大于可变形性分选临界值的细胞将在阵列间穿行，在垂直于流动方向上没有位移，可变形性小于可变形性分选临界值细胞将沿着微柱排列的方向运动，发生垂直于流动方向的位移。
例一，目标细胞尺寸大于所有杂质细胞尺寸，无论目标细胞与所有杂质细胞的可变形性是否有差异，则均可采用单一式方案，根据细胞尺寸差异，采用水滴形微柱阵列使分选完毕的目标细胞从顶部流向捕获区域，采用流体压力差驱动细胞进入到阵列微结构捕获区，实现捕获功能，通过调整流体流动速度来改变流体压力差，实现了细胞捕获、按需更换被捕获细胞、细胞贮存、按需释放已贮存细胞和按需细胞收集的功能；
例二，目标细胞尺寸小于所有杂质细胞尺寸，无论目标细胞与所有杂质细胞的可变形性是否有差异，则可采用单一式方案，根据细胞尺寸差异，采用水滴形微柱阵列使分选完毕的目标细胞从底部流向捕获区域，
例三，目标细胞尺寸处于所有杂质细胞尺寸的中间水平，无论目标细胞与所有杂质细胞的可变形性是否有差异，则可采用级联式方案，根据细胞尺寸差异，第一级与第二级分选区域采用不同位移分数的水滴形微柱阵列，使分选完毕的目标细胞从中间流道流向捕获区域；
例四，目标细胞的可变形性大于所有杂质细胞，无论目标细胞尺寸与所有杂质细胞是否有差异，则可采用单一式方案，根据细胞可变形性差异，采用桃形微柱阵列，使分选完毕的目标细胞从底部流向捕获区域；
例五，目标细胞的可变形性小于所有杂质细胞，无论目标细胞尺寸与所有杂质细胞是否有差异，则可采用单一式方案，根据细胞可变形性差异，采用桃形微柱阵列，使分选完毕的目标细胞从顶部流向捕获区域；
例六，目标细胞尺寸与小尺寸杂质细胞尺寸接近，并且目标细胞的可变形性大于小尺寸杂质细胞，则可采用级联式方案，根据细胞尺寸差异，第一级分选区域采用水滴形微柱阵列以分选出目标细胞与小尺寸杂质细胞，根据细胞变形性差异，第二级分选区域采用桃形微柱阵列以分选出目标细胞，使分选完毕的目标细胞从底部流道流向捕获区域；
例七，目标细胞尺寸与小尺寸杂质细胞尺寸接近，并且目标细胞的可变形性小于小尺寸杂质细胞，则可采用级联式方案，根据细胞尺寸差异，第一级分选区域采用水滴形微柱阵列以分选出目标细胞与小尺寸杂质细胞，根据细胞变形性差异，第二级分选区域采用桃形微柱阵列以分选出目标细胞，使分选完毕的目标细胞从中间流道流向捕获区域；
例八，目标细胞尺寸与大尺寸杂质细胞尺寸接近，并且目标细胞的可变形性大于大尺寸杂质细胞，则可采用级联式方案，根据细胞尺寸差异，第一级分选区域采用水滴形微柱阵列以分选出目标细胞与大尺寸杂质细胞，根据细胞变形性差异，第二级分选区域采用桃形微柱阵列以分选出目标细胞，使分选完毕的目标细胞从中间流道流向捕获区域；
例九，目标细胞尺寸与大尺寸杂质细胞尺寸接近，并且目标细胞的可变形性小于大尺寸杂质细胞，则可采用级联式方案，根据细胞尺寸差异，第一级分选区域采用水滴形微柱阵列以分选出目标细胞与大尺寸杂质细胞，根据细胞变形性差异，第二级分选区域采用桃形微柱阵列以分选出目标细胞，使分选完毕的目标细胞从顶部流道流向捕获区域。
根据需要，可进一步拓展级联式设计方案，增加细胞分选完毕后的流道并相应增加多尺寸细胞捕获区域，实现细胞的连续多尺寸分选与捕获。例如，目标细胞尺寸与中等尺寸杂质细胞尺寸接近，并且目标细胞的可变形性大于中等尺寸杂质细胞，则可采用级联式方案，根据细胞尺寸差异，第一级与第二级分选区域采用不同位移分数的水滴形微柱阵列以分选出目标细胞与中等尺寸杂质细胞，根据细胞变形性差异，第三级分选区域采用桃形微柱阵列以分选出目标细胞。
在本发明提供的细胞分选微流控芯片中，包括分选区域，所述分选区域设置微柱阵列，所述微柱的截面形貌为桃形或者水滴形。
在本发明提供的细胞分选微流控芯片中，所述微柱的高度为10微米-200微米，横向尺寸为10微米-75微米，横向间隙尺寸为15-35微米，其中，所述横向垂直于所述微流控芯片液体流动的方向；所述分选区域的行位移分数为0.05-0.25。在本发明提供的细胞分选微流控芯片中，所述桃形或者水滴形的尖端所指方向，与所述微流控芯片中液体流动的方向垂直。
在本发明提供的细胞分选微流控芯片中，所述微流控芯片的顶侧为所述桃形或者水滴形的尖端所指的一侧，所述微流控芯片的底侧为远离所述桃形或者水滴形的尖端所指的一侧；所述微流控芯片的样品入口靠近所述底侧。
在本发明提供的细胞分选微流控芯片中，所述微柱阵列驱动液体中的细胞根据细胞大小和可变形性而分层，尺寸小于尺寸分选临界值或者可变形性大于可变形性分选临界值的细胞将在阵列间穿行，在垂直于流动方向上没有位移，尺寸大于尺寸分选临界值或者可变形性小于可变形性分选临界值的细胞将沿着微柱排列的方向运动，发生垂直于流动方向的位移。细胞体积越大、可变形性越小，越靠近所述顶侧。在本发明提供的细胞分选微流控芯片中，在目标细胞的分层位置，设置目标细胞出口。
在本发明提供的细胞分选微流控芯片中，所述微流控芯片液体流动的方向上依次设置相邻的至少2个分选区域，靠近样品入口的所述分选区域，临界分选半径值最小；在液体流动的方向上，各所述分选区域的分选临界半径值依次增大。
在本发明提供的细胞分选微流控芯片中，还包括阵列捕获释放区域，所述分选区域的目标细胞出口与所述阵列捕获释放区域的入口，通过过渡流道连通。
在本发明提供的细胞分选微流控芯片中，所述阵列捕获释放区域包括沿液体流动方向延伸的捕获流道、设置在所述捕获流道两侧呈阵列式排布的多个捕获释放区域，每个所述捕获释放区域包括依次连通的捕获区、贮存区、释放通道，所述捕获区与所述捕获流道连通。
在本发明提供的细胞分选微流控芯片中，所述捕获区的尺寸略小于目标细胞的原始尺寸，大于目标细胞变形后最小形状结构尺寸；
所述贮存区的尺寸略大于目标细胞的原始尺寸；
所述释放通道的尺寸大于目标细胞的原始尺寸；
所述捕获区与所述贮存区通过变形通道连通；所述变形通道的尺寸小于目标细胞的原始尺寸，略大于目标细胞变形后最小形状结构尺寸；
所述贮存区与所述释放通道通过截留通道连通；所述截留通道小于目标细胞变形后最小形状结构尺寸。
在本发明的第二方面，在进行肿瘤细胞等特殊少量细胞的分选时，由于目标细胞的尺寸与背景细胞尺寸接近，例如部分循环肿瘤细胞和白细胞的尺寸均为15微米左右，单纯采用控制微柱阵列临界半径的方式难以实现高纯度的分选。而细胞的变形性存在一定差异，较大程度的变形减小了细胞的有效尺寸，使之更呈现小尺寸粒子的特征。
因此考虑通过调整微柱形貌，控制间隙内压强分布的方式，提高细胞所受压力从而增进细胞的变形，促使目标细胞与背景细胞分离。
基于这一依据构建优化问题，将优化目标设置为提高微柱间隙中心处与下侧微柱边壁的压力梯度，同样通过贝塞尔曲线拟合圆截面、通过缩放曲线控制点坐标的方式调整构型，最终优化的得到近似桃形的形貌。
在本发明的第三方面，本发明还提供一种稀有细胞分选捕获微流控芯片的应用方法，所述稀有细胞分选捕获微流控芯片为上面所述的阵列微结构多功能细胞分选捕获微流控芯片，在微流控芯片的分选区域设置微柱阵列，所述微柱的截面形貌为桃形或者水滴形。
在本发明提供的细胞分选方法中，所述桃形或者水滴形的尖端所指方向，与所述微流控芯片中液体流动的方向垂直。
在本发明提供的细胞分选方法中，所述微流控芯片的顶侧为所述桃形或者水滴形的尖端所指的一侧，所述微流控芯片的底侧为远离所述桃形或者水滴形的尖端所指的一侧；所述微流控芯片的样品入口靠近所述底侧。
在本发明提供的细胞分选方法中，所述微柱阵列驱动液体中的细胞根据细胞大小和可变形性而分层，细胞体积越大、可变形性越小，越靠近所述顶侧。
在本发明提供的细胞分选方法中，所述微流控芯片液体流动的方向上依次设置相邻的至少2个分选区域，靠近样品入口的所述分选区域，位移分数最小；在液体流动的方向上，各所述分选区域的分选临界值依次增大。
在本发明提供的细胞分选方法中，控制所述微柱间隙内压强分布，提高细胞所受压力从而增进细胞的变形，促使目标细胞与背景细胞分离。
细胞分选过程包括：
提供稀有细胞分选微流控芯片、预处理液体、样品液和缓冲液，所述预处理液体为一定浓度的含微量消泡剂成分的聚乙烯醇溶液，所述样品液含有少量目标稀有细胞及大量杂质细胞，所述缓冲液为磷酸盐缓冲溶液或适于样品液细胞生存的其他液体；
将所述预处理液体加注到注射器内，安装于注射泵上；
将注射器、芯片及收集耗材(离心管或试管等)通过毛细管相连接；
按照预设流速V1驱动预处理液体进入芯片缓冲液入口，排除芯片内气泡并对表面进行处理，处理时长为1-15分钟；
将所述缓冲液加注到注射器内，安装于注射泵上；
按照预设流速V2驱动缓冲液进入芯片缓冲液入口，排除预处理液体，形成适于细胞维持活性运动的环境；
将所述样品液加注到注射器内，安装于注射泵上；
在保持缓冲液按照预设流速V3运动的同时，按照预设流速V4驱动样品液进入样品入口，进行对样品液内少量稀有目标细胞的分选和捕获；
保持按照预设流速V4驱动样品液进入样品入口的同时，按照预设流速V5驱动缓冲液进入释放通道，缓冲液驱动细胞从捕获区脱离，捕获区重新捕获细胞，实现芯片的按需更换被捕获细胞功能；
细胞捕获完成后，将样品液停止向样品入口1注入的同时，按照预设流速V4驱动缓冲液进入缓冲液入口，并将流速V4逐渐增大到预设流速V6，增加微流控芯片内的流场压力，驱动被捕获的细胞从捕获区穿过变形通道到达贮存区，实现芯片的细胞贮存功能；
细胞贮存完成后，将缓冲液流速V6逐渐下降至V4后，按照预设流速V7驱动缓冲液进入某一个释放通道，驱动被贮存的细胞穿过变形通道和捕获区从贮存区脱离，实现芯片的按需释放已贮存细胞功能；
在上述过程中，保持使用收集耗材(离心管或试管等)收集来出口通道的液体；
细胞贮存完成后，将缓冲液流速V6逐渐下降至V5后，更换全新的收集耗材(离心管或试管等)，按照预设流速V7驱动缓冲液进入某一个释放通道，驱动被贮存的细胞从贮存区脱离，穿过变形通道和捕获区，从出口到达全新的收集耗材(离心管或试管等)，实现芯片的按需细胞收集功能；
所述预设流速V1-V7流速范围为1uL/min-2mL/min。
经由上述的技术方案可知，本发明提供的阵列微结构多功能细胞分选捕获微流控芯片包括功能芯片和密封承载芯片，功能芯片上设置有分选微柱阵列、捕获区、变形通道、贮存区、释放通道和进样口、出口及其他辅助结构，密封承载芯片和功能芯片实现封装形成密闭空间；通过注射泵等进样方式驱动样品液和缓冲液进入密闭空间，并在出口收集目标细胞和杂质细胞收集液，实现对目标细胞的细胞分选、细胞捕获、按需更换被捕获细胞、细胞贮存、按需释放已贮存细胞和按需细胞收集的功能。
另外，本发明还提供一种阵列微结构多功能细胞分选捕获微流控芯片应用方法，对所述细胞分选捕获微流控芯片的使用进行说明，使得所述细胞分选捕获微流控芯片通过分选功能微柱阵列、捕获区、变形通道、贮存区、释放通道对细胞进行操控及高通量高精度地分选、捕获、贮存、释放和收集。
本发明中，通过对阵列微结构多功能细胞分选捕获微流控芯片的设计，分别对一级分选微柱、二级分选微柱的横截面形貌，以及捕获释放区域的结构进行设计，从而实现细胞分选捕获微流控芯片的高通量高精度分选、捕获、贮存、按需释放和收集功能，为细胞的后续测试提供有力的研究工具。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1为单个分选结构；
图2不同微柱形貌间隙内压力分布；
图3不同微柱形貌间隙内流速分布；
图4优化得到的桃形和水滴形微柱截面形貌；
图5为本发明实施例提供的一种阵列微结构多功能细胞分选捕获微流控芯片结构示意图；
图6为本发明中采用单一式设计方案的微流控芯片平面示意图；
图7为本发明中采用单一式设计方案的微流控芯片中捕获释放区域的平面示意图；
图8为本发明中采用级联式设计方案分选捕获中等尺寸细胞的微流控芯片结构示意图；
图9为本发明中采用级联式设计方案分选捕获中等尺寸细胞的微流控芯片平面示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，而不构成对本发明的限制。
本发明中，细胞分选微流控芯片的设计，包含三个方面：一、分选微柱横截面形貌设计方法，用于设计一级分选微柱3、二级分选微柱4；二、捕获释放区域8的结构设计；三、匹配分选功能微柱5的其他通道辅助结构设计所述细胞分选部分的分选微柱横截面形貌。设计方法包含以下步骤：
步骤S1，应用三阶贝塞尔曲线拟合初始横截面形貌，初始形貌为圆形、菱形、三角形或圆角矩形等传统确定性侧向位移分选可采用的形貌；
步骤S2，对贝塞尔曲线的控制点横纵坐标分别施加缩放参量ki，mi，对形貌施加旋转参量ri；将完成构建的曲线复制并移动一定距离s，s的值根据待分选细胞的最大尺寸确定，略大于最大尺寸。
步骤S3，根据需求构建目标函数。一级分选微柱3的设计目的是保持分选临界半径而增大微柱横向间隙尺寸，设置目标函数1为使间隙内流速分布的不对称性最大、流量下侧微柱附近集中；二级分选微柱4的设计目的是对流经微柱间隙的细胞施加压力作用促进其变形，利用不同细胞变形程度的差异实现分选，设置目标函数2为使间隙中部到下侧微柱顶部压力差最大。
步骤S4，通过Nelder-Mead方法更新ki，mi，ri参量值，直至得到满足目标函数和约束的最优ki，mi，ri参量组合，即确定了在这一组合下的微柱横截面形貌。作为一级分选微柱3、二级分选微柱4的横截面形貌。
需要说明的是，本发明采用三阶贝塞尔曲线针对微柱形貌进行拟合和变形、旋转，包括且不限于使用圆形、三角形、菱形等作为初始形貌，并得到相应的优化结果，包括且不限于近似水滴的构型、近似桃形构型等。图2和图3分别示出了不同微柱形貌间隙内的压力分布和流速分布，优化得到的桃形微柱截面形貌如图4所示。图4中，两个桃形构型间的连线，为微柱阵列的横向间隙尺寸。图1中，横向间隙尺寸为λ，相邻两列的偏移距离为Δλ，微柱周期为N，则N＝λ/Δλ，将周期的倒数定义为位移分数εfraction，εfraction＝1/N＝Δλ/λ。临界半径值与间隙尺寸呈正比，与周期数呈负相关。因而在相同间隙尺寸的情况下，临界半径值小的阵列可以实现对更小尺寸细胞的分选；而在相同分选目标的情况下，临界半径值小的阵列可以拥有更大的间隙尺寸。减小临界半径值利于在相同间隙与周期的情况下对更小尺寸或者更大可变形性的细胞实现分选；还利于针对相同的分选目标，增大阵列的偏移度，即减小阵列的总长度，也增加了芯片的通量；还利于针对相同的分选目标，在偏移度相同的情况下，增大柱间间隙尺寸，这有效提高了芯片通量，同时减少了堵塞的发生。所述捕获释放区域8的结构设计方法包含以下步骤：
步骤SS1，按照目标细胞的尺寸大小，初步选择捕获区14的尺寸以及贮存区15的尺寸，对目标细胞采用标准线性固体模型建模，对细胞模型施加外力，针对不同的外力数值，采用有限单元法求解细胞在不同外力下的应力和应变；
步骤SS2，针对上述求解结果，适当选择比细胞原始尺寸略小，同时比变形后最小形状结构尺寸大很多的数值，作为捕获区14的尺寸；
适当选择比细胞原始尺寸略大的数值作为贮存区15的尺寸；
适当选择比细胞原始尺寸大的尺寸作为释放通道16的尺寸；
适当选择比细胞变形后最小形状结构尺寸更小的数值作为截留通道17的尺寸；
适当选择比细胞原始尺寸小很多，同时比最小形状结构尺寸略大的数值作为变形通道18的尺寸。
实施例1
本发明实施例提供一种阵列微结构多功能细胞分选捕获微流控芯片及其使用方法。
参见图5、图6、图7所示，芯片包括样品入口1，缓冲液入口2，一级分选微柱3，过渡流道6，缓充液入口7，捕获释放区域8，阵列捕获释放区域9，出口10，底部出口11，一级分选区域13，捕获区14，贮存区15，释放通道16，截留通道17，变形通道18。
本实施例中目标细胞的尺寸比所有背景细胞大，样品入口1位于底侧，在随着液体流动过程中目标细胞逐渐远离底侧向顶侧靠近，所以过渡流道6连接一级分选区域13的顶侧。缓充液入口7流入的缓冲液，与目标细胞混合，流入阵列捕获释放区域9，进行目标细胞的捕获。
在一个替代实施例中，如果目标细胞比所有背景细胞小，样品入口1位于底侧，在随着液体流动过程中背景细胞逐渐远离底侧向顶侧靠近，目标细胞依然靠近底侧，随着液体向阵列捕获释放区域9流动，所以过渡流道6连接一级分选区域13的底侧。
一级分选微柱3的形貌由前述设计方法确定，优选地，微柱形貌为近似水滴的构型，捕获释放区域8的形貌由前述设计方法确定，优选地，截留通道17和变形通道18的形状为近似矩形的构型。
一级分选微柱3的高度为10微米-200微米，横向尺寸为10微米-75微米，横向间隙尺寸为15-35微米，行位移分数为0.05-0.25。优选地，一级分选微柱3的高度为70微米，横向尺寸为52.5微米，横向间隙尺寸为30微米，行位移分数为0.05，纵向周期数为18，横向行数为22。截留通道17的宽度为5微米-15微米，长度尺寸为5微米-50微米。优选地，截留通道17的宽度为8微米，长度尺寸为30微米。变形通道18的宽度为10微米-25微米，长度尺寸为5微米-50微米。优选地，变形通道18的宽度为15微米，长度尺寸为30微米。
本实施例针对血细胞背景下的前列腺癌细胞进行分选，样品液为稀释血液与前列腺癌细胞的混合液，缓冲液为PBS溶液，预处理液体为一定浓度的含微量消泡剂成分的聚乙烯醇溶液。
将所述预处理液体加注到注射器内，安装于注射泵上；
将注射器、芯片及收集耗材(离心管或试管等)通过毛细管相连接；
按照预设流速V1驱动预处理液体进入芯片缓冲液入口2，排除芯片内气泡并对表面进行处理，处理时长为1-15分钟；
将所述缓冲液加注到注射器内，安装于注射泵上；
按照预设流速V2驱动缓冲液进入芯片缓冲液入口2，排除预处理液体，形成适于细胞维持活性运动的环境；
将所述样品液加注到注射器内，安装于注射泵上；
在保持缓冲液按照预设流速V3运动的同时，按照预设流速V4驱动样品液进入样品入口1，进行对样品液内少量稀有目标细胞的分选和捕获；
保持按照预设流速V4驱动样品液进入样品入口1的同时，按照预设流速V5驱动缓冲液进入上方第一个释放通道16，缓冲液驱动细胞从捕获区14脱离，捕获区14重新捕获细胞；
细胞捕获完成后，将样品液停止向样品入口1注入的同时，按照预设流速V4驱动缓冲液进入缓冲液入口7，并将流速V4逐渐增大到预设流速V6，增加微流控芯片内的流场压力，驱动被捕获的细胞从捕获区14穿过变形通道18到达贮存区15；
细胞贮存完成后，将缓冲液流速V6逐渐下降至V4后，更换全新的收集耗材(离心管或试管等)，按照预设流速V7驱动缓冲液进入上方第二个释放通道16，驱动被贮存的细胞从贮存区15脱离，穿过变形通道18和捕获区14，从出口10到达全新的收集耗材(离心管或试管等)；
所述预设流速V1-V7流速范围为1uL/min-2mL/min。
优选地，V1为40uL/min，V2为60uL/min，V3为40uL/min，V4为40uL/min，V5为60uL/min，V6为100uL/min，V7为80uL/min。
实施例2
本发明实施例提供一种级联阵列微结构多功能细胞分选捕获微流控芯片及其使用方法。
参见图8、图9示，芯片包括样品入口1，缓冲液入口2，一级分选微柱3，二级分选微柱4，顶部出口5，过渡流道6，缓充液入口7，捕获释放区域8，阵列捕获释放区域9，出口10，底部出口11，二级分选区域12，一级分选区域13，捕获区14，贮存区15，释放通道16，截留通道17，变形通道18。
本实施例中目标细胞为大尺寸，有小尺寸的背景细胞和大尺寸的背景细胞混合存在，并且目标细胞的可变形性比大尺寸背景细胞大，样品入口1位于底侧，在随着液体流动过程中目标细胞和大尺寸的背景细胞逐渐远离底侧向顶侧靠近。通过一级分选区域13的初步分选、二级分选区域12的再次分选，目标细胞向中间区域靠拢，所以过渡流道6连接二级分选区域12的中间。缓充液入口7流入的缓冲液，与目标细胞混合，流入阵列捕获释放区域9，进行目标细胞的捕获。
一级分选微柱3和二级分选微柱4的高度为10微米-200微米，一级分选微柱3为水滴形构型，二级分选微柱4为桃形构型，横向尺寸为10微米-75微米，横向间隙尺寸为15-35微米，位移分数为0.05-0.25,水滴形分选出不同尺寸的细胞，桃形分选出不同可变形性的细胞。优选地，一级分选微柱3和二级分选微柱4的高度为80微米，横向尺寸为76微米，横向间隙尺寸为30微米。一级分选区域13内行位移分数为0.05，纵向周期数为10，横向行数为14；二级分选区域12内行位移分数为0.2，纵向周期数为15，横向行数为16。截留通道17的宽度为5微米-15微米，长度尺寸为5微米-50微米。优选地，截留通道17的宽度为8微米，长度尺寸为30微米。变形通道18的宽度为10微米-25微米，长度尺寸为5微米-50微米。优选地，变形通道18的宽度为15微米，长度尺寸为30微米。
本实施例针对血细胞背景下的前列腺癌细胞进行分选捕获，样品液为稀释血液与前列腺癌细胞的混合液，缓冲液为PBS溶液，预处理液体为一定浓度的含微量消泡剂成分的聚乙烯醇溶液。
将所述预处理液体加注到注射器内，安装于注射泵上；
将注射器、芯片及收集耗材(离心管或试管等)通过毛细管相连接；
按照预设流速V1驱动预处理液体进入芯片缓冲液入口2，排除芯片内气泡并对表面进行处理，处理时长为1-15分钟；
将所述缓冲液加注到注射器内，安装于注射泵上；
按照预设流速V2驱动缓冲液进入芯片缓冲液入口2，排除预处理液体，形成适于细胞维持活性运动的环境；
将所述样品液加注到注射器内，安装于注射泵上；
在保持缓冲液按照预设流速V3运动的同时，按照预设流速V4驱动样品液进入样品入口1，进行对样品液内少量稀有目标细胞的分选和捕获；
使用收集耗材(离心管或试管等)收集底部出口11的收集液体，
保持按照预设流速V4驱动样品液进入样品入口1的同时，按照预设流速V5驱动缓冲液进入上方第一个释放通道16，缓冲液驱动细胞从捕获区14脱离，捕获区14重新捕获细胞；
细胞捕获完成后，将样品液停止向样品入口1注入的同时，按照预设流速V4驱动缓冲液进入缓冲液入口7，并将流速V4逐渐增大到预设流速V6，增加微流控芯片内的流场压力，驱动被捕获的细胞从捕获区14穿过变形通道18到达贮存区15；
细胞贮存完成后，将缓冲液流速V6逐渐下降至V4后，更换全新的收集耗材(离心管或试管等)，按照预设流速V7驱动缓冲液进入上方第二个释放通道16，驱动被贮存的细胞从贮存区15脱离，穿过变形通道18和捕获区14，从出口10到达全新的收集耗材(离心管或试管等)；
所述预设流速V1-V7流速范围为1uL/min-2mL/min。
优选地，V1为40uL/min，V2为60uL/min，V3为40uL/min，V4为40uL/min，V5为60uL/min，V6为100uL/min，V7为80uL/min。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
以上本发明的具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何根据本发明的技术构思所做出的各种其他相应的改变与变形，均应包含在本发明权利要求的保护范围内。

Claims (17)

1.一种细胞分选方法，其特征在于，在微流控芯片的分选区域设置微柱阵列，所述微柱的截面形貌为桃形或者水滴形。
2.根据权利要求1所述的细胞分选方法，其特征在于，所述桃形或者水滴形的尖端所指方向，与所述微流控芯片中液体流动的方向垂直。
3.根据权利要求2所述的细胞分选方法，其特征在于，所述微流控芯片的顶侧为所述桃形或者水滴形的尖端所指的一侧，所述微流控芯片的底侧为远离所述桃形或者水滴形的尖端所指的一侧；所述微流控芯片的样品入口靠近所述底侧。
4.根据权利要求3所述的细胞分选方法，其特征在于，所述微柱阵列驱动液体中的细胞根据细胞大小和变形性而分层，细胞体积越大、可变形性越小，越靠近所述顶侧。
5.根据权利要求1所述的细胞分选方法，其特征在于，所述微流控芯片液体流动的方向上设置1个分选区域，所述微柱截面形貌为水滴形或者桃形；或者依次设置相邻的至少2个分选区域，靠近样品入口的所述分选区域，临界分选半径值最小；在液体流动的方向上，各所述分选区域的分选临界半径值依次增大，所述微柱截面形貌为水滴形和桃形，靠近样品入口的所述分选区域微柱为水滴形，远离样品入口的所述分选区域微柱为桃形，或者靠近样品入口的所述分选区域微柱为桃形，远离样品入口的所述分选区域微柱为水滴形。
6.根据权利要求1-5中任意一项所述的细胞分选方法，其特征在于，控制所述微柱间隙内压强分布，提高细胞所受压力从而增进细胞的变形，促使目标细胞与背景细胞分离。
7.一种细胞分选微流控芯片，其特征在于，包括分选区域，所述分选区域设置微柱阵列，所述微柱的截面形貌为桃形或者水滴形。
8.根据权利要求7所述的细胞分选微流控芯片，其特征在于，所述微柱的高度为10微米-200微米，横向尺寸为10微米-75微米，横向间隙尺寸为15-35微米，其中，所述横向垂直于所述微流控芯片液体流动的方向；所述分选区域的行位移分数为0.05-0.25。
9.根据权利要求7所述的细胞分选微流控芯片，其特征在于，所述桃形或者水滴形的尖端所指方向，与所述微流控芯片中液体流动的方向垂直。
10.根据权利要求9所述的细胞分选微流控芯片，其特征在于，所述微流控芯片的顶侧为所述桃形或者水滴形的尖端所指的一侧，所述微流控芯片的底侧为远离所述桃形或者水滴形的尖端所指的一侧；所述微流控芯片的样品入口靠近所述底侧。
11.根据权利要求10所述的细胞分选微流控芯片，其特征在于，所述微柱阵列驱动液体中的细胞根据细胞大小和变形性而分层，细胞体积越大、可变形性越小，越靠近所述顶侧。
12.根据权利要求11所述的细胞分选微流控芯片，其特征在于，所述微流控芯片液体流动的方向上设置1个分选区域，所述微柱截面形貌为水滴形或者桃形；或者依次设置相邻的至少2个分选区域，所述微柱截面形貌为水滴形和桃形，靠近样品入口的所述分选区域微柱为水滴形，远离样品入口的所述分选区域微柱为桃形，或者靠近样品入口的所述分选区域微柱为桃形，远离样品入口的所述分选区域微柱为水滴形。
13.根据权利要求11所述的细胞分选微流控芯片，其特征在于，在目标细胞的分层位置，设置目标细胞出口。
14.根据权利要求7-13中任意一项所述的细胞分选微流控芯片，其特征在于，还包括阵列捕获释放区域，所述分选区域的目标细胞出口与所述阵列捕获释放区域的入口，通过过渡流道连通。
15.根据权利要求14所述的细胞分选微流控芯片，其特征在于，所述阵列捕获释放区域包括沿液体流动方向延伸的捕获流道、设置在所述捕获流道两侧呈阵列式排布的多个捕获释放区域，每个所述捕获释放区域包括依次连通的捕获区、贮存区、释放通道，所述捕获区与所述捕获流道连通。
16.根据权利要求15所述的细胞分选微流控芯片，其特征在于，所述捕获区的尺寸略小于目标细胞的原始尺寸，大于目标细胞变形后最小形状结构尺寸；
所述贮存区的尺寸略大于目标细胞的原始尺寸；
所述释放通道的尺寸大于目标细胞的原始尺寸；
所述捕获区与所述贮存区通过变形通道连通；所述变形通道的尺寸小于目标细胞的原始尺寸，略大于目标细胞变形后最小形状结构尺寸；
所述贮存区与所述释放通道通过截留通道连通；所述截留通道小于目标细胞变形后最小形状结构尺寸。
17.根据权利要求7-13中任意一项所述的细胞分选微流控芯片，其特征在于，控制所述微柱间隙内压强分布，提高细胞所受压力从而增进细胞的变形，促使目标细胞与背景细胞分离。
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