CN105441308B - 循环式单细胞捕获芯片 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种循环式单细胞捕获芯片，包括：液流层，包含环状液流管道，所述液流管道分别通过液流输入管道、液流输出管道与芯片外部连通，且所述液流输入管道和液流输出管道上还分别设有用以将所述液流管道与外界隔离的微阀；微筛，至少用以截留流经所述液流管道的液流内的单个细胞；微泵，至少用以驱使液流在所述液流管道内单向循环流动。利用本发明的芯片，能够在含有较少数量细胞的液流中有效捕获单细胞，其中捕获单细胞的微筛数量比例达到90%，捕获效率远远高于现有技术。

Description

循环式单细胞捕获芯片

技术领域

本发明属于微流控技术领域，特别是涉及一种循环式单细胞捕获芯片。

背景技术

随着生物技术研究手段的不断发展，生物学的研究层面正从细胞种群向单细胞层面深化拓展。每个细胞在时空上都是独一无二的，尽管它们可能来自同一祖先，但是不同的时空环境决定了它们各自特异的遗传表达，从而产生了不同的生物性状，这对于进化、耐药性、基因表达等研究具有重要价值。然而基于细胞种群的分析方法往往会掩盖群体内不同细胞间出现的差异，忽略这些少量但重要的信息。因此迫切需要研发基于单细胞的培养及分析方法，用来研究不同细胞个体间的差异性，了解细胞的遗传与代谢机制。

从大量细胞中获得单个细胞是进行单细胞培养与分析的第一步。传统的单细胞获取方法常采用对细胞群进行大量稀释或者显微操作的方法来进行。整个操作步骤复杂繁琐，单细胞获得效率低。微流控技术是上世纪九十年代在分析化学领域发展起来的，它以微管道网络微结构特征，通过微加工技术将微管道、微泵、微阀、微储液器、微检测元件等功能元器件像集成电路一样，集成在芯片材料上。微流控技术在分离捕获单细胞方面很高的效率，通过在芯片上制作微孔、微筛、微电极等结构，能够在较短时间捕获大量单细胞，在单细胞捕获培养研究方面已经有多个成功的应用范例。

美国专利申请US20120009671A1中描述了一种基于微孔的单细胞捕获方案，该芯片上有上千个160 μm （长）×160 μm（宽） × 160 μm（深）的微孔，各微孔顶部均有液体管道相连，捕获前，先将细胞浓度稀释到合适水平，然后将稀释的细胞液注入液体管道，使各微孔充满液体后停止注入细胞液，此时液体管道中的细胞在重力作用下沉入微孔，通过调整细胞液的稀释度可以确保约有10%~30%的微孔中含有单个细胞。捕获的单细胞在微孔中进行培养，培养液更换则通过以每秒2 mm的速度注入培养液来实现。此芯片能够实现160~480 个单元的单细胞培养。

针对上述单细胞捕获方案，由于单个细胞捕获是基于单细胞在平面上的均匀分布实现的，这就需要调整输入细胞的浓度，使单个微孔的水平区域仅含有一个细胞，尽管如此，多数微孔或是未捕获到细胞，或是捕获到两个及以上的细胞，能够捕获到单个细胞的微孔数量比例仍然比较低（10~30%）。而且，微孔中细胞捕获数量的不确定性使得必须要通过显微成像对所有微孔区域的细胞数量进行判别，从中挑出少数具有单个细胞的微孔，整个判别过程耗时且工作量比较大。另外，由于仅靠重力将单细胞捕获在微孔中，捕获力较弱，细胞容易随高流速的液流而流失，因此在培养液换液时，液流流速需要控制在每秒2mm以下，这增加实验过程的复杂性，提高操作难度大。从总体看，由于细胞捕获依赖于微孔中的流场分布，这对于微孔的形制有较大要求；由于微孔不仅作为捕获结构，还需要作为培养结构，因此特定的微孔形制也决定了有限的细胞培养空间结构。

已公开的技术文献（Lab Chip, 2012, 12, 765）公开了一种基于微筛的单细胞捕获芯片，该芯片具有多个串联圆形腔室，每个腔室中央有一对由两个微柱组成的微筛结构。当细胞注入腔室时，单个细胞会被阻滞于微筛处，从而被捕获，进而微筛外围的上方的圆形微阀通过加压，阀膜向下方的液体管道弯曲形变，将微筛区域与外界液体管道隔离，形成一独立腔室，捕获的单细胞即在其中培养生长。换液操作时，微阀开放数百毫秒后再次快速关闭，微阀隔离区域外的新液在此数百毫秒短时间内扩散进入微阀隔离区域内。该芯片在输入细胞数量为10000~25000个条件下，约有75%的微筛能够捕获到单细胞。由于需要细胞与液流管道中的微筛接触才能捕获单个细胞，因此捕获成功很大程度上取决于细胞与微筛接触的机率。然而由于微筛的横向直径很小，大部分细胞与微筛接触的机率很小，大都会绕过微筛，最后流出芯片。为了能够实现一定的被捕获单细胞数量，需要输入较多量的细胞，在该文献中，细胞数量约为10000~25000个，细胞输入数量需求高，这对于一些数量少的细胞样品而言，难以适用。同时，该芯片上捕获到单细胞的微筛仅占70%，为了获得尽可能多的单细胞，需要进一步提升微筛捕获效率。本发明因此而来。

发明内容

本发明的目的在于提出一种捕获单个细胞的循环式单细胞捕获芯片，该芯片通过液体循环流动，从中捕获单个细胞的芯片方案，通过该芯片，能够从注入的少量细胞中捕获得到多个单细胞。

为了解决现有技术中的这些问题，本发明提供的技术方案如下：

一种循环式单细胞捕获芯片，包括:

液流层，包含环状液流管道，所述液流管道分别通过液流输入管道、液流输出管道与芯片外部连通，且所述液流输入管道和液流输出管道上还分别设有用以将所述液流管道与外界隔离的微阀；

微筛，至少用以截留流经所述液流管道的液流内的单个细胞；

微泵，至少用以驱使液流在所述液流管道内单向循环流动。

进一步的，所述微阀可设置在所述微筛的上游或者下游。

进一步的，所述微筛包括连接在液流管道管壁上的一个以上微柱组，所述微柱组包括一个以上微柱，且其中一个微柱与液流管道管壁之间形成有能够阻滞单个细胞但使液流中的液体通过的间隙，或者其中两个微柱之间形成有能够阻滞单个细胞但使液流中的液体通过的间隙。

进一步的，所述芯片包括设于所述液流层上的弹性膜层，所述弹性膜层包括弹性膜。

进一步的，所述微筛包括连接在所述弹性膜暴露于所述液流管道内的局部表面上的一个以上微柱组，所述微柱组包括一个以上微柱，且其中一个微柱与液流管道管壁之间形成有能够阻滞单个细胞但使液流中的液体通过的间隙，或者其中两个微柱之间形成有能够阻滞单个细胞但使液流中的液体通过的间隙。

进一步的，所述微柱的形状可选自但不限于圆柱形、长方体、梯台、圆锥体、开放式槽型结构（例如，新月形结构）的一种或者两种以上的任意组合。

进一步的，所述芯片还包括设置在所述弹性膜层上的气动控制层，所述微泵包括分布于所述气动控制层内的两条以上第三气动控制管道，当在设定时段向其中两条以上第三气动控制管道内分别输入具有不同压力的流体时，该两条以上第三气动控制管道能够分别驱使所述弹性膜的不同局部区域产生不同程度的形变和/或位移，从而在液流管道内产生能够驱使液流单向流动的力。

进一步的，所述微阀包括能够驱使弹性膜的局部区域挤压液流输入管道和/或液流输出管道，从而在所述液流输入管道和/或液流输出管道内的选定位置阻断液流的驱动机构。

进一步的，所述驱动机构至少可选自但不限于电致动机构、磁致动机构、光致动机构、液压驱动机构或气动机构。

进一步的，所述芯片还包括设置在所述弹性膜层上的气动控制层，所述微阀包括分布于所述气动控制层内的至少一第一气动控制管道和至少一第二气动控制管道，当在设定时段向所述第一气动控制管道或第二气动控制管道内输入具有设定压力的流体时，所述第一气动控制管道或第二气动控制管道能够驱使所述弹性膜的局部区域挤压液流输入管道和/或液流输出管道，从而在所述液流输入管道或液流输出管道内的选定位置阻断液流。

其中，所述第一气动控制管道和第二气动控制管道还可一体设置，即，以一条与液流输入管道、液流输出管道均交叉的气动控制管道实现微阀的功能。

进一步的，所述芯片还包括设置在所述弹性膜层上的气动控制层，所述气动控制层包括第四气动控制管道，当向所述第四气动控制管道输入具有设定压力的流体时，所述第四气动控制管道能够驱使所述弹性膜的局部区域挤压所述液流管道，从而在所述液流管道内的选定位置形成液流阻断部，使从所述液流输入管道或液流输出管道输入的液体从液流管道内分布有微筛的区域中经过后，直接由所述液流输出管道或液流输入管道输出。

进一步的，所述液体为清洗液，且所述清洗液在液流管道内的流动方向与所述液流在液流管道内的流动方向一致。

该芯片的单细胞捕获原理在于，将一定量的细胞注入循环液流管道后，通过微阀将循环液流管道与外界隔离封闭，开启微泵后，细胞在微泵的作用下随液流在循环液流管道内单向循环流动，部分细胞被位于循环液流管道上的微柱阻挡而被捕获，当有足够数量的微柱捕获到单细胞后，停止微泵，开启微阀，向环状液流管路中注入清洗液洗去多余未捕获细胞，清洗液流主要方向与开启微泵时液流循环方向的一致。清洗完成后即可获得单细胞。

基于上述问题，本发明将细胞悬液注入一环状管路后封闭，并使其循环流动，其中的细胞能够多次经过分布于环状管路中的微筛而不流出芯片，增加了微筛接触的机会，应用该方案，不仅减少了细胞输入所需的数量，同时捕获到单细胞的微筛数量比例也得到提高，当输入细胞（酵母）数量在4000个左右时，捕获到单细胞的微筛数量比例可达90%。

本发明的芯片中，由于细胞随液流在循环液流管道（环状管路）中循环流动，捕获过程中，细胞始终分布在具有微筛的环状管路中，每个细胞有多次机会经过同一微筛捕获区域，被微筛阻滞而捕获的概率大大增加，因此输入细胞的需求数量仅~4000个，显著少于对比文献，而捕获有单细胞的微筛数量比例达到90%，捕获效率高于对比文献。

环状闭合管道俯视形状可为圆形、方形或任意闭合形状，微泵不限于一组，也可为多组，微柱结构不限于圆柱形，可为长方体、梯台、圆锥等，每组数量也不限于两个，也可为三个或以上，仅需能够阻滞细胞，而允许液流通过。

相对于现有技术中的方案，本发明的优点至少在于：

（1）本发明芯片在应用于单细胞捕获时，具有微筛的循环液流管道为一环状闭合管道，其中的液流在微泵的驱动下单向循环流动，直至有较多数量的微筛捕获到单细胞，捕获有单细胞的微筛数量比例达到90%，捕获效率高于对比文献。

（2）本发明芯片通过设置第三气动控制管道形成微阀，在冲洗多余细胞时加压截止相应的环状管路区域，防止清洗液进入环状管路后以最短路径流出，确保冲洗充分。

附图说明

下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：

图1为本发明实施例1循环式单细胞捕获芯片的俯视示意图；

图2是图1中循环式单细胞捕获芯片1B区域局部放大示意图；

图3是图2所示沿线1C的循环式单细胞捕获芯片剖面结构示意图；

图4是图1所示沿线1D的循环式单细胞捕获芯片剖面结构示意图；

图5是本发明实施例2循环式单细胞捕获芯片的俯视示意图；

图6是图5中2B区域循环式单细胞捕获芯片局部放大示意图；

图7是图6所示沿线2C的循环式单细胞捕获芯片剖面结构示意图。

其中：110为液流层；120为气动控制层；130为弹性膜层；循环液流管道1101，液流输入管道1102，液流输出管道1103；第一气动控制管道1202、第二气动控制管道1203、第三气动控制管道1201、第四气动控制管道1204；1301为微柱。

具体实施方式

以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限于限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体厂家的条件做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。

实施例1

图1~4所示是本发明实施例1循环式单细胞捕获芯片的结构示意图，该芯片由三个上下层叠的结构层组成。底层是液流层110，上层是气动控制层120，两层之间有弹性膜130相隔。液流层110中有循环液流管道1101，液流输入管道1102，液流输出管道1103，各管道宽100微米，高20微米，液流输入管道1102及液流输出管道1103一端均有接口与芯片外连通，在液流管道1101底部有多组突起的微柱1301，每个微柱直径10微米，高15微米，微柱间间隙4微米，以阻拦单细胞。气动控制层120中有气动控制管道1201、1202、1203，宽100微米，其中第一气动控制管道1202在液流输入管道1102上方穿越，第二气动控制管道1203在液流输出管道1103上方穿越。

所述气动控制层包括控制液流输入管道启闭的第一气动控制管道1202、控制液流输出管道启闭的第二气动控制管道1203和控制循环液流管道单向流动的第三气动控制管道1201，这些气动控制管道通过弹性膜层变形或者位移使微阀启闭或者使微泵启闭。气动控制管道均与外界相连，当向气动控制管道中注入高压气体，气动控制管道下的弹性膜会向下发生弯曲，挤压弹性膜下方的液流管道，当撤去高压气体时，弹性膜回复，此即为微流控芯片中的微阀。气动控制管道1202形成的微阀可以将液流输入管道1102关闭，气动控制管道1203形成的微阀可以将液流输出管道1103封闭，这样循环液流管道1101变成了闭合的循环液流管道。第三气动控制管道1201为两根或三根平行的管道，通过按特定时序依次加压，可以挤压下方循环液流管道1101中的液体单向流动，此即为微流控芯片中的微泵。第三气动控制管道1201形成的微泵驱动液体在闭合的循环液流管道内循环流动。

该芯片的单细胞捕获原理在于，将一定量的细胞注入循环液流管道后，通过微阀将循环液流管道与外界隔离封闭，开启微泵后，细胞在微泵的作用下随液流在循环液流管道内单向循环流动，部分细胞被位于循环液流管道上的微柱阻挡而被捕获，当有足够数量的微柱捕获到单细胞后，停止微泵，开启微阀，向环状液流管路中注入清洗液洗去多余未捕获细胞，清洗液流主要方向与开启微泵时液流循环方向的一致。清洗完成后即可获得单细胞。

结合附图1~4，通过液流输入管道1102向循环液流管道1101中注入细胞悬液，部分悬液从液流输出管道1103中流出，然后向气动控制管道1202、1203中充入高压流体，截止液流输入管道1102、液流输出管道1103，向气动控制管道1201中按特定时序依次加压，驱动下方循环液流管道1101中的液体单向流动，待有足够数量的微筛1301捕获到单细胞后，撤去气动控制管道1201、1202、1203中气压，通过液流输入管道1102或液流输出管道1103中注入清洗液，确保清洗液在循环液流管道中的主要流向与微泵循环时的液流方向相同，将多余未捕获的细胞冲出，即可得到捕获的单细胞。

本实施例中循环液流管道可以为环形液流管道；其中环形可以是方环形或者圆环形。

实施例2

图5~7是本发明实施例2循环式单细胞捕获芯片的结构示意图，该芯片由三个上下层叠的结构层组成。底层是液流层110，上层是气动控制层120，两层之间有弹性膜130相隔。液流层110中有循环液流管道1101，液流输入管道1102，液流输出管道1103，各管道宽100微米，高20微米，液流输入管道1102及液流输出管道1103一端均有接口与芯片外连通，在弹性膜130面向液流管道1101一侧有多组突起的微柱1301，每个微柱直径10微米，高15微米，以阻拦单细胞。气动控制层120中有四个气动控制管道1201、1202、1203、1204，宽100微米，其中第一气动控制管道1202在液流输入管道1102上方穿越，第二气动控制管道1203在液流输出管道1103上方穿越，第四气动控制管道2204在液流输入管道1102与液流输出管道1103之间的循环液流管道1101上方穿越。

所述气动控制层包括控制液流输入管道启闭的第一气动控制管道1202、控制液流输出管道启闭的第二气动控制管道1203、控制循环液流管道单向流动的第三气动控制管道1201、控制循环液流管道启闭连通的第四气动控制管道1204，这些气动控制管道通过弹性膜层变形或者位移使微阀启闭或者使微泵启闭。气动控制管道均与外界相连，当向气动控制管道中注入高压气体，气动控制管道下的弹性膜会向下发生弯曲，挤压弹性膜下方的液流管道，当撤去高压气体时，弹性膜回复，此即为微流控芯片中的微阀。第三气动控制管道1201为两根或三根平行的管道，通过按特定时序依次加压，可以挤压下方循环液流管道1101中的液体单向流动，此即为微流控芯片中的微泵。所述第四气动控制管道1204设置在液流输入管道和液流输出管道间，当进行冲洗循环液流管道，所述第四气动控制管道通过弹性膜层变形或者位移使微阀关闭循环液流管道，清洗液按照原先液体流向进行冲洗。

本实施例中循环液流管道可以为环形液流管道；其中环形可以是方环形或者圆环形。结合附图5~7，通过液流输入管道1102向循环液流管道1101中注入细胞悬液，部分悬液从液流输出管道1103中流出，然后向气动控制管道1202、1203中充入高压流体，截止液流管道1102、1103，向气动控制管道1201中按特定时序依次加压，驱动下方循环液流管道1101中的液体单向流动，待有足够数量的微筛1301捕获到单细胞后，撤去气动控制管道1201、1202、1203中气压，向气动控制管道1204中充入高压气体，通过液流输入管道1102或液流输出管道1103中注入清洗液，确保清洗液在循环液流管道中的液体流向与微泵循环时的液流方向相同，将多余未捕获的细胞冲出，即可得到捕获的单细胞。

其中设置气动控制管道1204的目的在于使循环液流管道1101在气动控制管道1204处实现微阀，这样可以通过液流输入管道1102或液流输出管道1103中注入清洗液，确保清洗液在循环液流管道中的液体流向与微泵循环时的液流方向相同。

应当理解，上述实例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人是能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种循环式单细胞捕获芯片，其特征在于包括:

液流层，包含环状液流管道，所述液流管道分别通过液流输入管道、液流输出管道与芯片外部连通，且所述液流输入管道和液流输出管道上还分别设有用以将所述液流管道与外界隔离的微阀，

弹性膜层，其设于所述液流层上，

微筛，至少用以截留流经所述液流管道的液流内的单个细胞，

微泵，至少用以驱使液流在所述液流管道内单向循环流动；以及

设置在所述弹性膜层上的气动控制层；

其中，所述弹性膜层包括弹性膜；

所述微阀包括分布于所述气动控制层内的至少一第一气动控制管道和至少一第二气动控制管道，当向所述第一气动控制管道或第二气动控制管道输入具有设定压力的流体时，所述第一气动控制管道或第二气动控制管道能够驱使所述弹性膜的局部区域挤压液流输入管道或液流输出管道，从而在所述液流输入管道或液流输出管道内的选定位置阻断液流；

所述微泵包括分布于所述气动控制层内的两条以上第三气动控制管道，当在设定时段向其中两条以上第三气动控制管道内分别输入具有不同压力的流体时，该两条以上第三气动控制管道能够分别驱使所述弹性膜的不同局部区域产生不同程度的形变和/或位移，从而在液流管道内产生能够驱使液流单向流动的力；所述微筛包括连接在所述弹性膜暴露于所述液流管道内的局部表面上的一个以上微柱组，所述微柱组包括一个以上微柱，且其中一个微柱与液流管道管壁之间形成有能够阻滞单个细胞但使液流中的液体通过的间隙，或者其中两个微柱之间形成有能够阻滞单个细胞但使液流中的液体通过的间隙。

2.根据权利要求1所述的循环式单细胞捕获芯片，其特征在于：所述微柱的形状选自圆柱形、长方体、梯台、圆锥体、开放式槽型结构的一种或者两种以上的任意组合。

3.根据权利要求1所述的循环式单细胞捕获芯片，其特征在于：所述第一气动控制管道和第二气动控制管道一体设置。

4.根据权利要求1所述的循环式单细胞捕获芯片，其特征在于：所述芯片还包括设置在所述弹性膜层上的气动控制层，所述气动控制层包括第四气动控制管 道，当向所述第四气动控制管道输入具有设定压力的流体时，所述第四气动控制管道能够驱使所述弹性膜的局部区域挤压所述液流管道，从而在所述液流管道内的选定位置形成液流阻断部，使从所述液流输入管道或液流输出管道输入的液体从液流管道内分布有微筛的区域中经过后，直接由所述液流输出管道或液流输入管道输出。

5.根据权利要求4所述的循环式单细胞捕获芯片，其特征在于：所述液体为清洗液，且所述清洗液在液流管道内的流动方向与所述液流在液流管道内的流动方向一致。