CN108034586B - 一种用于单细胞捕捉和培养的微流控芯片 - Google Patents
一种用于单细胞捕捉和培养的微流控芯片 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于单细胞阵列和培养的微流控芯片,包括组合在一起的上片和下片,所述上片和所述下片的相对表面上分别设置有挡块阵列和微孔阵列;所述挡块阵列的挡块与所述微孔阵列的微孔相对应地分隔分布,并配置成,所述挡块捕捉正向液流中的单个细胞并阻止正向液流中的细胞进入其正向前方的微孔,利用反向液流将所述挡块所捕捉的细胞冲出所述挡块并流入其反向前方的微孔;所述挡块阵列位于所述上片的所述表面形成的微流通道内,所述微流通道在所述微流控芯片上具有入口和出口。本发明能够简便高效地实现单细胞的捕捉、阵列化布置与培养。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于单细胞捕捉和培养的微流控芯片。
背景技术
单细胞分析已经发展成为细胞生物学领域研究细胞功能的一个关键问题,并且受限于工具和技术支持使得对单个细胞的分离,对后续的单细胞研究等问题变得越来越突出。传统提取单细胞的方式繁复、耗时、费力且效率不佳。而使用微流控芯片操纵单细胞,只需要将流体通入芯片,然后进行一定的操作即可得到实验结果。这只需要几分钟就能完成,可以提高实验效率,使得实验更加迅速、便捷。在微流控芯片上对单细胞进行阵列,则可同时进行多组对照实验,大大提高了实验效率。
微流控芯片技术是一种以流体在微米尺度下的低雷诺数流动为主要特征的科学技术,是多种单元技术在微小可控平台上灵活组合与规模集成。我们可以在一块几平方厘米的微流控芯片上,构建出复杂的微通道网络,并对其中的流体进行准确的操纵和控制。这种芯片将不同的模块集成在一个小型的平台上,提供了极大的方便。
目前,有很多基于挡块阵列的技术都可以通过微流控芯片操纵单细胞。美国德州研究人员使用挡块和墙壁对单细胞进行捕捉,并使细胞粘附在基底上,然后移除挡块和墙壁,从而使细胞留存在微流控芯片上。该方法的捕捉时间较长,而且无法和细胞培养有效的结合在一起。美国加州研究人员使用单体挡块阵列对单细胞进行捕捉,但捕捉成功率较低;而且每次捕捉需要24小时,效率较低。
发明内容
本发明的主要目的在于针对现有技术的不足,提供一种用于单细胞捕捉和培养的微流控芯片。
为实现上述目的,本发明采用以下技术方案:
一种用于单细胞阵列和培养的微流控芯片,包括组合在一起的上片和下片,所述上片和所述下片的相对表面上分别设置有挡块阵列和微孔阵列;所述挡块阵列的挡块与所述微孔阵列的微孔相对应地分隔分布,并配置成,所述挡块捕捉正向液流中的单个细胞并阻止正向液流中的细胞进入其正向前方的微孔,而反向液流将所述挡块所捕捉的细胞冲出所述挡块并流入其反向前方的微孔;所述挡块阵列位于所述上片的所述表面形成的微流通道内,所述微流通道在所述微流控芯片上具有入口和出口。
进一步地:
一条所述微流通道将多个所述挡块阵列串联形成一条液体通道,或者多条所述微流通道将多个所述挡块阵列并联形成多条液体通道。
所述挡块由轴对称的两个板状部分组成,所述两个板状部分在靠近其正向前方的微孔的一侧具有较大的间隙,在远离其正向前方的微孔的一侧具有较小的间隙,所述较大的间隙大于目标细胞的直径,所述较小的间隙小于目标细胞的直径;优选地,所述两个板状部分呈90度。
所述挡块的对称轴与所述微流控芯片的流向平行。
所述较大的间隙与所述微孔的直径近似,优选相等;所述较小的间隙为目标细胞直径的0.4倍-0.8倍,优选0.6倍。
所述挡块在所述微流通道中的高度为目标细胞直径1.2倍-2倍,优选1.5倍;优选地,所述挡块的高度与所述微流通道的深度相等。
所述微孔的深度为目标细胞直径2倍-5倍,优选3倍。
所述微流控芯片的液体入口和液体出口连接有用于驱动液体流动的注射泵。
所述微流控芯片的上片和下片通过AutoCAD进行二维模型绘制,将图形制作在掩膜版上,通过光刻技术复制成SU-8结构,通过软光刻法复制到PDMS上,优选地,所述微流控芯片由上片和下片键合在一起制得。
一种捕捉单细胞的方法,使用所述的微流控芯片进行单细胞捕捉,包括:
细胞捕获阶段,正向注入细胞缓冲液到微流通道中,单个细胞被卡在挡块的间隙中,其余细胞绕过挡块的同时也绕过挡块的正向前方的微孔;
细胞冲洗阶段,正向注入缓冲液冲刷微流通道,将微流通道内残余的细胞冲洗干净,只留下被捕获的单细胞;
反向冲洗捕获阶段,反向注入缓冲液冲刷微流通道,使细胞离开挡块而流到挡块的反向前方的微孔中。
本发明具有如下有益效果:
本发明提供的微流控芯片,可以将单细胞精确快速的从大量细胞中捕捉,固定到指定的位置,排列成阵列,用于单细胞的分析。使用本发明的微流控芯片,可以将单细胞捕捉、阵列、培养集成在单一微流控芯片上,通过简单的操作即可实施单细胞高通量获取与培养分析。
本发明提供的用于单细胞捕捉和培养的微流控芯片,克服了目前已公开的技术中单细胞捕捉和培养技术存在的细胞成活率低、捕捉率低、成功率低、难以实现高通量捕捉等不足,本发明的微流控芯片利用流体力学原理和微流控技术,将流动聚焦理论与捕捉结构相结合,并与微孔板相配合,实现单细胞精确捕捉和培养,具有高捕捉率、高成功率、高通量、适用性强的特点,并且结构简单、易操作加工、成本低,进而成为能够满足科研和临床需求的工具,为单细胞研究提供发展机理、诊断及治疗等,提供了新的研究和实验手段。
本发明具有以下优点:
1.简便地实现了单细胞高效捕捉、阵列化地布置和培养;
2.制作简单,成本低;
3.高通量,可以同时完成多组对照实验;
4.结构利于细胞被捕捉,捕捉效率高;
5.细胞存活率高。
附图说明
图1是本发明实施例微流控芯片的上片和下片的组合示意图;
图2是本发明实施例微流控芯片中的上片的仰视图;
图3是本发明实施例微流控芯片的透视和局部放大图;
图4是本发明实施例微流控芯片的单个捕捉结构示意图;
图5是本发明实施例微流控芯片捕捉和培养的流程示意图,图中从上至下依次为流道冲洗,细胞捕获,细胞冲洗,反向冲洗捕获,细胞培养五个步骤。
附图标记说明:
1-上片;2-下片;3-液体入口;4-液体出口;5-微孔;6-微流通道;7-挡块;8-目标细胞。
具体实施方式
以下对本发明的实施方式作详细说明。应该强调的是,下述说明仅仅是示例性的,而不是为了限制本发明的范围及其应用。
参阅图1至图5,在一种实施例中,一种用于单细胞阵列和培养的微流控芯片,包括组合在一起的上片1和下片2,所述上片1和所述下片2的相对表面上分别设置有挡块阵列和微孔阵列;所述挡块阵列的挡块7与所述微孔阵列的微孔5相对应地分隔分布,并配置成,所述挡块7能够捕捉正向液流中的单个细胞并阻止正向液流中的细胞进入其正向前方的微孔5(图4中挡块7左侧的微孔5所示即为其正向前方的微孔,正向液流在图3-图5中为从右往左的流向),而反向液流则将所述挡块7所捕捉的细胞冲出所述挡块7并流入其反向前方的微孔(图4中的挡块7右侧的未示出的微孔为其反向前方的微孔,反向液流在图3-图5中为从左往右的流向);所述上片1表面的挡块7在所述上片1的表面并联成挡块阵列,通过所述上片1表面的微流通道6串联成一条液体通道或者并联成多条液体通道,每条液体通道在所述微流控芯片上具有一个液体入口3和一个液体出口4。
在优选的实施例中,所述挡块7由轴对称的两个板状部分组成,所述两个板状部分在靠近其正向前方的微孔5的一侧具有较大的间隙,在远离其正向前方的微孔5的一侧具有较小的间隙,所述较大的间隙大于目标细胞的直径,所述较小的间隙小于目标细胞的直径。在更优选的实施例中,所述两个板状部分呈90度。
在优选的实施例中,所述上片1的挡块7的对称轴与所述微流控芯片的流向平行。
在优选的实施例中,所述较大的间隙与所述微孔5的直径近似,优选相等;所述较小的间隙为目标细胞8直径的0.4倍-0.8倍,最优选为0.6倍。
在优选的实施例中,所述上片1的挡块7在微流通道中形成的阻挡高度为目标细胞8直径1.2倍-2倍,最优选为1.5倍。所述挡块7的高度可以设置成与所述微流通道6的深度相等。
在优选的实施例中,所述下片2的微孔5的深度为目标细胞8直径2倍-5倍,最优选为3倍。
在优选的实施例中,所述微流控芯片拥有一个液体入口3和一个液体出口4,这两个液体入口3和液体出口4贯穿整个上片1,并与上片1的微流通道6相连。
在优选的实施例中,所述微流控芯片的液体入口3和液体出口4连接有用于驱动液体流动的注射泵。
在优选的实施例中,所述微流控芯片的上片1和下片2通过AutoCAD进行二维模型绘制,将图形制作在掩膜版上,通过光刻技术复制成SU-8结构,通过软光刻法复制到PDMS上。
在优选的实施例中,所述微流控芯片由上片1和下片2键合在一起制得。
由于芯片制作成本较低,且清洗芯片的成本较高,本发明采用可抛弃式微流控芯片。
根据本发明的一些实施例,芯片由上片和下片键合组成。使用光刻技术将微流通道、挡块、微孔等结构刻制在硅基底的SU-8结构上。流道包括液体入口、主流道和液体出口。
芯片上片的挡块结构尺寸、间距等均相同,挡块阵列的尺寸、间距也均相同。下片的微孔与上片的挡块结构一一对应,位于挡块结构的液体流向方向。
在本发明的一个具体实例中的芯片大小:50*60mm2;下片微孔:直径200μm、深度50μm;上片微流通道:深度25μm;上片挡块:间距200mm;上片挡块阵列:间距5mm。
微流通道可以是串联的单条通道,也可以是并行设置的多条通道。
本发明具体实施例的微流控芯片的微流通道的宽度,由挡块的阵列数量决定。本领域技术人员可以自行设计微流通道的尺寸。
注射泵连接所述微流控芯片的液体入口和液体出口,用于驱动液体流动。
参阅图5,在另一种实施例中,一种捕捉单细胞的方法,使用所述的微流控芯片进行单细胞捕捉,该方法包括:
细胞捕获阶段,正向注入细胞缓冲液到微流通道6中,单个细胞8被卡在挡块7的间隙中,其余细胞绕过挡块7的同时也绕过挡块7的正向前方的微孔5;
细胞冲洗阶段,正向注入缓冲液冲刷微流通道6,将微流通道6内残余的细胞冲洗干净,只留下被捕获的单细胞8;
反向冲洗捕获阶段,反向注入缓冲液冲刷微流通道6,使细胞8离开挡块7而流到挡块的反向前方的微孔中。
其中包含细胞的缓冲液从液体入口进入微流通道6后,部分细胞被挡块7捕捉住。待捕捉完成后,将微流通道6中的剩余细胞冲洗干净,然后反向缓慢通缓冲液冲洗,使捕捉到的细胞落入位于下片的微孔5中。使用该微流控芯片,能简便高效地实现单细胞的捕捉、阵列化地布置和培养;且该微流控芯片制作工艺简单。
在工作过程中,当细胞被挡块捕捉后,通过挡块间隙的流量会明显缩小,故即使第二个细胞流向挡块间隙,也会由于所处状态的不稳定而沿挡块的一侧流走,因此每个挡块只会捕捉到一个细胞。反向冲洗时,由于液体的流线基本沿挡块的对称轴对称,因此被捕捉的细胞会沿挡块的对称轴的方向朝对应的微孔流动;细胞流至微孔上方时,受到重力作用和流线影响从而进入微孔中。
在优选实施例中,芯片内无运动部件,所有结构都是通过软光刻工艺制得;上片和下片之间进行键合,保证了管道的密封性。芯片结构使用过程简单高效,操作简洁。
采用本发明的微流控芯片对平均直径约为15μm的Hela细胞进行捕捉阵列;通过AutoCAD进行二维模型绘制,将图形制作在掩膜版上,通过光刻技术复制成SU-8结构,通过软光刻法复制到PDMS上,从而得到如图3所示的微流控芯片。微流通道6位于上片1,上片1和下片2的材料均为PDMS,上片1和下片2使用对准键合机键合在一起,微流通道6的深度为25μm,微孔5的深度为50μm,直径为200μm。挡块的间隙为10μm,挡块之间的距离为200μm。
其工作流程图如图5所示。流道冲洗阶段,用注射泵通过液体入口注入缓冲液冲刷微流通道,流量为500μl/min,确保微流通道内没有肉眼可见的气泡存留。细胞捕获阶段,用注射泵通过液体入口注入密度较高的(100个/μl)细胞缓冲液,流量为100μl/min;细胞缓冲液流至挡块时,大部分细胞会绕过挡块,只有少数细胞会流向挡块间隙,并卡在间隙中,从而被捕获。细胞冲洗阶段,用注射泵通过液体入口注入缓冲液冲刷微流通道,流量为100μl/min,将微流通道内残余的细胞冲洗干净,只留下被捕获的单细胞。反向冲洗捕获阶段,用注射泵通过液体出口注入缓冲液冲刷微流通道,流量为80μl/min,细胞离开挡块,流向微孔。细胞培养阶段,细胞流经微孔时受到重力作用落入微孔,并沉入孔底,从而实现单细胞阵列,进行后续培养工作。整个流程可以在30秒内完成。
本发明的微流控芯片还课题通过调整挡块尺寸大小、微流通道高度大小来实现对不同直径目标细胞的捕捉,可以调整微孔阵列的直径和间距对细胞所需的不同培养环境进行调整。液体出口端连接回收装置,将没有被捕捉的细胞缓冲液回收,用于下一次实验,从而减少细胞的浪费。
本发明基于使用微流控芯片实现单细胞捕捉、阵列化和培养,改善现有单细胞捕捉喷射技术存在的成本高、效率低、成功率低等问题,并达到以下技术指标:
1.应用微机电加工工艺制成单细胞操纵系统,实现单细胞捕捉、阵列和培养;
2.高通量:每30秒可以捕捉400个单细胞;
3.捕捉效率:30秒可以完成一次捕捉;
4.捕捉成功率:但细胞捕捉成功率可以达到90%以上;
5.细胞存活率:捕捉阵列完成12小时后细胞存活率可以达到95%以上。
以上内容是结合具体/优选的实施方式对本发明所作的进一步详细说明,不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,其还可以对这些已描述的实施方式做出若干替代或变型,而这些替代或变型方式都应当视为属于本发明的保护范围。
Claims (13)
1.一种用于单细胞捕捉和培养的微流控芯片,其特征在于,包括组合在一起的上片和下片,所述上片和所述下片的相对表面上分别设置有挡块阵列和微孔阵列;所述挡块阵列的挡块与所述微孔阵列的微孔相对应地分隔分布,并配置成,所述挡块捕捉正向液流中的单个细胞并阻止正向液流中的细胞进入其正向前方的微孔,而反向液流将所述挡块所捕捉的细胞冲出所述挡块并流入其反向前方的微孔;所述挡块阵列位于所述上片的所述表面形成的微流通道内,所述微流通道在所述微流控芯片上具有入口和出口,一条所述微流通道将多个所述挡块阵列串联形成一条液体通道,或者多条所述微流通道将多个所述挡块阵列并联形成多条液体通道,所述挡块由轴对称的两个板状部分组成,所述两个板状部分在靠近其正向前方的微孔的一侧具有较大的间隙,在远离其正向前方的微孔的一侧具有较小的间隙,所述较大的间隙大于目标细胞的直径,所述较小的间隙小于目标细胞的直径。
2.如权利要求1所述的微流控芯片,其特征在于,所述两个板状部分呈90度角。
3.如权利要求2所述的微流控芯片,其特征在于,所述挡块的对称轴与所述微流控芯片的流向平行。
4.如权利要求2或3所述的微流控芯片,其特征在于,所述较大的间隙与所述微孔的直径相等;所述较小的间隙为目标细胞直径的0.4倍-0.8倍。
5.如权利要求4所述的微流控芯片,其特征在于,所述较小的间隙为目标细胞直径的0.6倍。
6.如权利要求1所述的微流控芯片,其特征在于,所述挡块在所述微流通道中的高度为目标细胞直径的1.2倍-2倍。
7.如权利要求6所述的微流控芯片,其特征在于,所述挡块在所述微流通道中的高度为目标细胞直径的1.5倍。
8.如权利要求6所述的微流控芯片,其特征在于,所述挡块的高度与所述微流通道的深度相等。
9.如权利要求1所述的微流控芯片,其特征在于,所述微孔的深度为目标细胞直径的2倍-5倍。
10.如权利要求9所述的微流控芯片,其特征在于,所述微孔的深度为目标细胞直径的3倍。
11.如权利要求1至3任一项所述的微流控芯片,其特征在于,所述微流控芯片的液体入口和液体出口连接有用于驱动液体流动的注射泵。
12.如权利要求1至3任一项所述的微流控芯片,其特征在于,所述微流控芯片的上片和下片通过AutoCAD进行二维模型绘制,将图形制作在掩膜版上,通过光刻技术复制成SU-8结构,通过软光刻法复制到PDMS上,所述微流控芯片由上片和下片键合在一起制得。
13.一种捕捉单细胞的方法,其特征在于,使用如权利要求1至12任一项所述的微流控芯片进行单细胞捕捉,包括:
细胞捕获阶段,正向注入细胞缓冲液到微流通道中,单个细胞被卡在挡块的间隙中,其余细胞绕过挡块的同时也绕过挡块的正向前方的微孔;
细胞冲洗阶段,正向注入缓冲液冲刷微流通道,将微流通道内残余的细胞冲洗干净,只留下被捕获的单细胞;
反向冲洗捕获阶段,反向注入缓冲液冲刷微流通道,使细胞离开挡块而流到挡块的反向前方的微孔中。
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Optimization of microfluidic microsphere-trap arrays;Xiaoxiao Xu et.al.;BIOMICROFLUIDICS;第第7卷卷;第1-16页 * |
The microfluidic multitrap nanophysiometer for hematologic cancer cell characterization reveals temporal sensitivity of the calcein-AM efflux assay;Thomas F. Byrd IV et.al.;Sci Rep;第第4卷卷;第1-9页 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
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CN108034586A (zh) | 2018-05-15 |
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