CN108949497B - 极微量循环肿瘤细胞的特异性单细胞定点捕捉芯片 - Google Patents

Abstract

一种极微量循环肿瘤细胞的特异性单细胞定点捕捉芯片，玻璃基底上由下至上依次键合有蛇形微管路层和阀层，蛇形微管路层上的蛇形微管路上间隔的形成有一个以上的监测段，相邻的两个监测段之间设置有中段液体流入口和中段液体流出口，蛇形微管路的首端设置有首段血液流入口和首段液体流入口，蛇形微管路的尾端设置有尾段血液流出口和尾段液体流出口；玻璃基底上对应每个监测段设置有2个以上的单细胞捕捉位点；阀层上对应每个中段液体流入口、中段液体流出口、首段血液流入口、首段液体流入口、尾段血液流出口和尾段液体流出口处设置有控制开关阀，对应每相邻的两个监测段之间都设置有限流阀。本发明即可以实现细胞分选富集还可以实现特异性单细胞定点捕捉。

Description

极微量循环肿瘤细胞的特异性单细胞定点捕捉芯片

技术领域

本发明涉及一种单细胞定点捕捉芯片。特别是涉及一种用于全血中的极微量循环肿瘤细胞的特异性单细胞定点捕捉芯片。

背景技术

近年来，肿瘤诊疗技术已经取得很大进步，但是癌症依然是导致人类死亡的第一大杀手，其中癌症转移是造成癌症患者死亡的重要因素。循环肿瘤细胞是从实体肿瘤脱落并进入血液循环系统的肿瘤细胞，在癌症转移中发挥着重要作用。越来越多的研究者试图将循环肿瘤细胞作为临床和实验研究中癌症的基因型和表型变化的细胞标志物。鉴于循环肿瘤细胞的稀有性，研究如何从全血中高效率、高纯度、高活性的分选捕捉到循环肿瘤细胞具有重要意义。

要对循环肿瘤细胞进行检测分析，首要问题就是如何从数以亿计的血细胞中将循环肿瘤细胞分选出来。现有循环肿瘤细胞的分选富集一般采用两种策略。最常见的策略是利用细胞表面肿瘤标志物进行富集或删除其中的免疫细胞。其中基于循环肿瘤细胞表面表达抗原与抗体之间特异性结合的免疫亲和型分选技术已经在循环肿瘤细胞检测领域应用多年，该方法有利于提高循环肿瘤细胞的特异性捕捉效率和改善循环肿瘤细胞的分选纯度。随着微流控芯片技术的发展，免疫亲和型分选技术被应用于芯片中实现循环肿瘤细胞的分选富集。大多数相关研究中，通过循环肿瘤细胞表面抗原与微流控芯片中微管路或者各种微结构表面绑定抗体的特异性结合，实现循环肿瘤细胞的分选富集。

另一种分选富集策略是利用循环肿瘤细胞的大小、密度、变形能力、流体力等物理特性将循环肿瘤细胞从白细胞群体中分离出来。这类方法是免标记的，所以可以避免由标记分子引起的样品污染。基于物理特性的循环肿瘤细胞分选方法，无需对循环肿瘤细胞进行任何修饰，所以采用该方法分离获得的循环肿瘤细胞样品能够与更广泛的细胞分析方法(包括对细胞活性有要求的分析方法)相兼容。循环肿瘤细胞与正常血细胞相比，具有高核质比、大细胞尺寸和独特的细胞核形态。目前已经报道了多种基于循环肿瘤细胞与血细胞之间尺寸差异的分离装置，他们是无标记循环肿瘤细胞分离技术的代表，其基本工作原理是过滤。近年来，随着微流控技术的发展，越来越多的微结构应用到基于尺寸的细胞分离方法研究，包括微管路的收缩结构、微柱阵列和其他的微过滤器变形结构。基于物理特性的循环肿瘤细胞分选方法还包括基于电解质极化率的介电电流法。循环肿瘤细胞与其它血细胞存在不同的表面电荷，所以可以在双向电流作用下使循环肿瘤细胞与其它血细胞分别向不同的位置发生不同程度的漂移运动，实现循环肿瘤细胞的有效分选。

虽然基于细胞物理特性的分选方法和负削减技术(通过去除血液中的白细胞提高循环肿瘤细胞的占比)都可以避免处于上皮间充质转化或者其他转化过程的循环肿瘤细胞亚群的流失，但是收集到的细胞却也很难阻止一些非循环肿瘤细胞的混入。目前所研发的仪器不能提供满意的分选效率并且成本较高。另外，在宏观尺度分析系统中采用免疫亲和型捕捉方法可能导致生物探针与循环肿瘤细胞表面蛋白标志物的永久性连接，进而限制后续的循环肿瘤细胞提取和表征。此外，限制免疫亲和型分选富集方法发展的另一个重要因素是，还没有一种真正意义上的高特异性的标志物能够无遗漏的识别所有的循环肿瘤细胞。对于利用物理特性分离的过滤方法而言，比较粘着的肿瘤细胞与血细胞及过滤器表面相粘连是不可避免的，所以直接过滤方法容易发生堵塞，并且捕捉到的细胞难以从过滤器上释放下来，无法进行后续的测试分析。另外，虽然大多数循环肿瘤细胞的尺寸大于正常血细胞，但是因为在循环肿瘤细胞与白细胞的尺寸范围之间存在一块明显的重叠区域，所以会影响基于细胞尺寸的分选方法的效率和纯度。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一种能够提高单循环肿瘤细胞的捕捉效率的极微量循环肿瘤细胞的特异性单细胞定点捕捉芯片。

本发明所采用的技术方案是：一种极微量循环肿瘤细胞的特异性单细胞定点捕捉芯片，包括玻璃基底，所述的玻璃基底上由下至上依次键合有蛇形微管路层和阀层，其中，所述的蛇形微管路层上形成有用于流通载有细胞的液体的蛇形微管路，所述的蛇形微管路上间隔的形成有一个以上的用于对细胞进行监测的监测段，每相邻的两个监测段之间都设置有中段液体流入口和中段液体流出口，在所述的蛇形微管路的首端设置有1个首段血液流入口和1个首段液体流入口，在所述的蛇形微管路的尾端设置有1个尾段血液流出口和1个尾段液体流出口；所述的玻璃基底上对应所述蛇形微管路上的每个监测段都设置有2个以上的单细胞捕捉位点；所述的阀层上对应所述蛇形微管路上的每个中段液体流入口、中段液体流出口、首段血液流入口、首段液体流入口、尾段血液流出口和尾段液体流出口处都设置有用于控制液体流动的控制开关阀，所述的阀层上对应所述蛇形微管路上每相邻的两个监测段之间都设置有用于隔断或导通相邻两个监测段之间的流路的限流阀。

所述中段液体流出口位于相邻的两个监测段中前面的监测段的出口处，所述中段液体流入口位于相邻的两个监测段中后面的监测段的入口处，所述限流阀位于相邻的两个中段液体流入口和中段液体流出口之间。

所述的监测段上对应所述玻璃基底上沿血液流方向在每个单细胞捕捉位点前都设置有用于控制细胞的流动轨迹实现循环肿瘤细胞定点捕捉的凹槽阵列。

所述的凹槽阵列是由等间隔的形成在蛇形微管路内上表面上的若干个凹槽构成的阵列。

每个所述的凹槽都是V形结构。

所述的玻璃基底上修饰有纳米结构层，所述的单细胞捕捉位点是在所述的纳米结构层上利用喷墨打印装置逐行修饰只允许单个循环细胞吸附固定的单细胞捕捉位点，实现所述监测段处多个单细胞捕捉位点等间隔的修饰。

本发明的极微量循环肿瘤细胞的特异性单细胞定点捕捉芯片，充分结合免疫亲和型分选方法与基于细胞物理特性的分选方法，除了可以实现细胞分选富集之外，还可以实现特异性单细胞定点捕捉。能够从血液中高效率、高纯度的分选捕捉到单循环肿瘤细胞，为循环肿瘤细胞的异质性检测提供高活性的单细胞阵列。本发明的芯片首先利用循环肿瘤细胞的物理特性，以连续流动的方式实现循环肿瘤细胞的分选富集，然后通过微流体技术操控细胞的运动轨迹，并利用喷墨打印形成的抗体点阵实现单循环肿瘤细胞的特异性吸附固定，其中抗体点阵喷印在采用纳米结构/纳米材料修饰的芯片表面，以提高单循环肿瘤细胞的捕捉效率。本发明可以为单循环肿瘤细胞的形态学观测及基因组学和蛋白组学测试分析提供便利。本发明具有如下优点：

1、基于循环肿瘤细胞尺寸大与变形性小的双重特性，采用流动式微流控分选技术，从数以亿计的血细胞中分选富集循环肿瘤细胞，分选富集环境可以不受待处理液体量的影响，不需要样品前处理过程，可以大大简化流程，减少目标细胞的损失。

2、利用具有皮升级喷液量的喷墨打印技术在芯片表面修饰允许且只允许单个循环肿瘤细胞吸附固定的抗体位点，并利用喷印系统的微米级定位精度及多喷头结构，实现芯片表面多种抗体固定间隔的阵列化修饰，为分选富集后的循环肿瘤细胞提供单细胞特异性吸附位点阵列。

3、利用微管路内的沟槽结构控制细胞在流场中的运动轨迹，通过优化设计沟槽结构与抗体点阵的交错位置以及单处沟槽结构的形状与深宽尺寸，保证循环肿瘤细胞与抗体位点的碰撞结合，实现单循环肿瘤细胞的特异性定点捕捉。

4、在芯片表面修饰纳米结构(纳米线)/纳米材料(石墨烯、氧化石墨烯)，利用纳米结构/纳米材料对细胞和蛋白质分子的吸附增强效应，显著提高循环肿瘤细胞的捕捉效率。

附图说明

图1是本发明极微量循环肿瘤细胞的特异性单细胞定点捕捉芯片的结构示意图；

图2是本发明极微量循环肿瘤细胞的特异性单细胞定点捕捉芯片的俯视结构示意图；

图3是本发明中凹槽阵列的结构示意图；

图4是本发明的微管路中凹槽阵列调整液体流的原理示意图。

图中

1：阀层 1.1：控制开关阀

1.2：限流阀 2：蛇形微管路层

2.1：蛇形微管路 2.2：监测段

2.3：凹槽阵列 2.31：凹槽

2.32：凸起 2.4：中段液体流入口

2.5：中段液体流出口 2.6：首段血液流入口

2.7：尾段血液流出口 2.8：首段液体流入口

2.9：尾段液体流出口 3：玻璃基底

3.1：单细胞捕捉位点 4：血液流

5：单细胞 6.1：浮力

6.2：重力 6.3：曳力

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明的极微量循环肿瘤细胞的特异性单细胞定点捕捉芯片做出详细说明。

本发明的极微量循环肿瘤细胞的特异性单细胞定点捕捉芯片，本发明首先利用循环肿瘤细胞尺寸大与变形性小的双重特性，通过流动式分选从数以亿计的血细胞中对循环肿瘤细胞进行富集，然后利用微流体技术操控细胞的运动轨迹，将循环肿瘤细胞吸附固定在喷墨打印形成的直径在微米量级的抗体位点上，实现单循环肿瘤细胞的特异性定点捕捉。

如图1所示，本发明的极微量循环肿瘤细胞的特异性单细胞定点捕捉芯片，包括玻璃基底3，所述的玻璃基底3上由下至上依次键合有透明的蛇形微管路层2和阀层1。

如图2所示，所述的蛇形微管路层2上形成有用于流通载有细胞的液体的蛇形微管路2.1，所述的蛇形微管路2.1上间隔的形成有一个以上的用于对细胞进行监测的监测段2.2，每相邻的两个监测段2.2之间都设置有中段液体流入口2.4和中段液体流出口2.5，在所述的蛇形微管路2.1的首端设置有1个首段血液流入口2.6和1个首段液体流入口2.8，在所述的蛇形微管路2.1的尾端设置有1个尾段血液流出口2.7和1个尾段液体流出口2.9。所述的玻璃基底3上对应所述蛇形微管路2.1上的每个监测段2.2都设置有2个以上的单细胞捕捉位点3.1。所述的阀层1上对应所述蛇形微管路2.1上的每个中段液体流入口2.4、中段液体流出口2.5、首段血液流入口2.6、首段液体流入口2.8、尾段血液流出口2.7和尾段液体流出口2.9处都设置有用于控制液体流动的控制开关阀1.1，所述的阀层1上对应所述蛇形微管路2.1上每相邻的两个监测段2.2之间都设置有用于隔断或导通相邻两个监测段2.2之间的流路的限流阀1.2。

所述中段液体流出口2.5位于相邻的两个监测段2.2中前面的监测段2.2的出口处，所述中段液体流入口2.4位于相邻的两个监测段2.2中后面的监测段2.2的入口处，所述限流阀1.2位于相邻的两个中段液体流入口2.4和中段液体流出口2.5之间。为特异性单细胞定点捕捉芯片的每一条管路设置独立的流入口、流出口和控制阀，便于后续各条管路的培养液、细胞裂解液、待测药物、荧光探针等化学试剂的更换操作。

所述的监测段2.2上对应所述玻璃基底3上沿血液流方向在每个单细胞捕捉位点3.1前都设置有用于控制细胞的流动轨迹实现循环肿瘤细胞定点捕捉的凹槽阵列2.3。本发明通过所设置的凹槽阵列2.3，打破层流状态下细胞与芯片表面无接触的限制，并通过凹槽阵列2.3与抗体位点的配合设计，控制细胞的流动轨迹实现循环肿瘤细胞的定点捕捉。

如图3所示，所述的凹槽阵列2.3是由等间隔的形成在蛇形微管路2.1内上表面上的若干个凹槽2.31构成的阵列。每个所述的凹槽2.31都是V形结构。图3中4表示血液流，5表示单细胞。

如图4所示的微管路中凹槽阵列调整液体流的原理，在所述的监测段2.2上设计加工的凹槽阵列2.3，可以改变凹槽表面的液流方向并在微管路内引起涡流。如果在微管路表面设计具有一定夹角的两组凹槽，那么将会在微管路内产生一对涡流，并且涡流的大小比例与凹槽的宽幅比例相等。在凹槽引起的涡流当中，细胞的受力如图4所示，相邻涡流使细胞向涡流的交界处(即两组凹槽的夹角处)运动，而在交界处细胞受到浮力、重力和拖曳力的作用。利用凹槽结构控制蛇形微管路内循环肿瘤细胞在流场中的运动轨迹，通过优化设计凹槽结构与抗体点阵的交错位置以及单处凹槽结构的形状与深宽尺寸，使循环肿瘤细胞在凹槽结构引起的涡流当中拖曳力的作用下，实现其与抗体位点的碰撞结合，保证单循环肿瘤细胞的特异性定点捕捉。本专利中特异性定点捕捉循环肿瘤细胞的抗体除了传统意义上的抗体之外，还包括能够特异性识别循环肿瘤细胞表面抗原的适配体等。

本发明的极微量循环肿瘤细胞的特异性单细胞定点捕捉芯片中，首段血液流入口2.6中所流入的液体是利用循环肿瘤细胞的物理特性进行流动式分选富集之后的载有循环肿瘤细胞的血液。在完成循环肿瘤细胞分选富集之后，利用细胞的表面抗原进行特异性识别捕捉，有利于克服循环肿瘤细胞与白细胞的尺寸范围之间的重叠性，提高循环肿瘤细胞的分选富集纯度。

本发明的极微量循环肿瘤细胞的特异性单细胞定点捕捉芯片中，所述的玻璃基底3上修饰有纳米结构层，所述的单细胞捕捉位点3.1是在所述的纳米结构层上利用喷墨打印装置逐行修饰只允许单个循环细胞吸附固定的单细胞捕捉位点3.1，实现所述监测段2.2处多个单细胞捕捉位点3.1等间隔的修饰。本发明的单细胞捕捉位点3.1的修饰方法具有以下优势：①可以为单循环肿瘤细胞特异性定点捕捉提供吸附位点；②单循环肿瘤细胞的捕捉位置固定，在阵列化检测中方便寻址，有利于提高检测效率；③可以实现多种抗体的修饰，有利于循环肿瘤细胞特异性吸附抗体的优化选择。

本发明中所述的纳米结构层是采用竖直纳米线或石墨烯或氧化石墨烯。利用纳米结构/纳米材料对细胞和蛋白质分子的吸附增强效应，来提高循环肿瘤细胞的捕捉效率。以石墨烯为例，石墨烯的高表面-体积比使得其能够更加有效的吸附细胞和生物分子，石墨烯的六元环单位可以和生物分子的碳基环结构形成π堆积键来增加生物分子的固定量，石墨烯的生物兼容性使得其适合于细胞和蛋白质分子的吸附固定。既可以采用化学气相沉积法制备石墨烯，并利用激光对石墨烯进行图形化，亦可以采用其他石墨烯的制备和图形化工艺在芯片表面加工石墨烯。然后采用喷墨打印技术在石墨烯表面修饰抗体点阵，利用石墨烯对细胞和蛋白质分子的吸附增强效应，提高循环肿瘤细胞的捕捉效率。

发明公开和揭示的所有组合可以通过借鉴本文公开内容产生，尽管本发明的组合已通过详细实施过程进行了描述，但是本领域技术人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本发明所述的装置进行拼接或改动，或增减某些部件，更具体地说，所有相类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，他们都被视为包括在本发明精神、范围和内容之中。

Claims (3)

1.一种极微量循环肿瘤细胞的特异性单细胞定点捕捉芯片，包括玻璃基底(3)，其特征在于，所述的玻璃基底(3)上由下至上依次键合有蛇形微管路层(2)和阀层(1)，其中，所述的蛇形微管路层(2)上形成有用于流通载有细胞的液体的蛇形微管路(2.1)，所述的蛇形微管路(2.1)上间隔的形成有一个以上的用于对细胞进行监测的监测段(2.2)，每相邻的两个监测段(2.2)之间都设置有中段液体流入口(2.4)和中段液体流出口(2.5)，在所述的蛇形微管路(2.1)的首端设置有1个首段血液流入口(2.6)和1个首段液体流入口(2.8)，在所述的蛇形微管路(2.1)的尾端设置有1个尾段血液流出口(2.7)和1个尾段液体流出口(2.9)；所述的玻璃基底(3)上对应所述蛇形微管路(2.1)上的每个监测段(2.2)都设置有2个以上的单细胞捕捉位点(3.1)；所述的阀层(1)上对应所述蛇形微管路(2.1)上的每个中段液体流入口(2.4)、中段液体流出口(2.5)、首段血液流入口(2.6)、首段液体流入口(2.8)、尾段血液流出口(2.7)和尾段液体流出口(2.9)处都设置有用于控制液体流动的控制开关阀(1.1)，所述的阀层(1)上对应所述蛇形微管路(2.1)上每相邻的两个监测段(2.2)之间都设置有用于隔断或导通相邻两个监测段(2.2)之间的流路的限流阀(1.2)；

所述的监测段(2.2)上对应所述玻璃基底(3)上沿血液流方向在每个单细胞捕捉位点(3.1)前都设置有用于控制细胞的流动轨迹实现循环肿瘤细胞定点捕捉的凹槽阵列(2.3)；所述的凹槽阵列(2.3)是由等间隔的形成在蛇形微管路(2.1)内上表面上的若干个凹槽(2.31)构成的阵列；

所述的玻璃基底(3)上修饰有纳米结构层，所述的单细胞捕捉位点(3.1)是在所述的纳米结构层上利用喷墨打印装置逐行修饰只允许单个循环细胞吸附固定的单细胞捕捉位点(3.1)，实现所述监测段(2.2)处多个单细胞捕捉位点(3.1)等间隔的修饰。

2.根据权利要求1所述的极微量循环肿瘤细胞的特异性单细胞定点捕捉芯片，其特征在于，所述中段液体流出口(2.5)位于相邻的两个监测段(2.2)中前面的监测段(2.2)的出口处，所述中段液体流入口(2.4)位于相邻的两个监测段(2.2)中后面的监测段(2.2)的入口处，所述限流阀(1.2)位于相邻的两个中段液体流入口(2.4)和中段液体流出口(2.5)之间。

3.根据权利要求1所述的极微量循环肿瘤细胞的特异性单细胞定点捕捉芯片，其特征在于，每个所述的凹槽(2.31)都是V形结构。

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