CN102876563A - 一种自动捕获单细胞的微流控芯片 - Google Patents

Abstract

本发明属于细胞生物学实验装置技术领域，是基于流体力学原理和微流控技术的一种自动捕获单细胞的微流控芯片。该玻璃-PDMS芯片包含了细胞悬浮液入口、培养液入口、细胞捕获流动腔、自动捕获微通道系统和液体出口；利用流体力学原理对悬浮培养的单细胞进行长时间捕获，便于对细胞加载动态（浓度随时间变化）生化信号，并观察、检测细胞的生物学行为。本发明可用于分析微环境调控离体细胞生物学行为及其机制的单细胞生物学实验研究。

Description

一种自动捕获单细胞的微流控芯片

技术领域

本发明属于细胞生物学实验装置技术领域，是基于流体力学原理和微流控技术的用于长时间捕获、观察、检测离体悬浮单细胞的生物学研究实验装置，具体为一种自动捕获单细胞的微流控芯片。

背景技术

细胞微环境与细胞相互作用日益成为细胞生物学领域的研究热点之一。对离体悬浮培养的单细胞进行操控、观察、检测是探究细胞生物学行为常用的手段。高度、横向和纵向尺度在微米、毫米或厘米量级的微流控芯片装置不仅是捕获、操控离体培养细胞的理想实验平台，也是构建离体培养细胞微流动生物力学和生物化学环境的重要实验工具，在细胞生物学研究工作中得到了广泛使用。现有的研究多数利用流体驻点或物理屏障对单细胞进行捕获。利用流体驻点捕获单细胞对细胞机械损伤小，但常因驻点位置不稳定、捕获时间短而不利于长时间观察、检测和分析；而外加反馈控制系统的驻点捕获方法则由于外部光学传感器和控制器机构复杂，成本偏高，不便广泛应用。利用物理屏障捕获单细胞简单且成本低廉，但容易造成细胞损伤且不便于加载动态生化信号刺激。因此迫切需要一种能对离体悬浮培养单细胞进行长期捕获、避免细胞损伤且便于加载动态生化信号刺激的单细胞捕获微流控芯片。

发明内容

本发明的设计目的在于提供一种用于单细胞生物学研究的捕获单细胞的微流控芯片，设计中利用流体力学原理和微流控技术，巧妙地将驻点流理论与物理屏障相结合，实现对单细胞的长时间捕获，同时对捕获细胞加载动态生化信号刺激，用于单细胞生物学的实验研究。

本发明是一种集成了培养液入口、细胞悬浮液入口、培养液入口通道、自动捕获微通道系统、输出汇合通道和液体出口的玻璃-PDMS芯片。

本发明的技术方案如下：

一种自动捕获单细胞的微流控芯片，该微流控芯片包括培养液入口，细胞悬浮液入口，培养液入口上通道，培养液入口下通道，细胞悬浮液入口通道，自动捕获微通道系统，输出汇合通道和液体出口；

所述的自动捕获微通道系统由细胞捕获流动腔，输出上通道，输出下通道，阻力通道构成。

其中，细胞捕获流动腔包括一个入口和上、中、下三个出口，入口与培养液入口上通道、培养液入口下通道、细胞悬浮液入口通道相通，上出口与输出上通道相通，中出口与阻力通道相通，下出口与输出下通道相通；输出上通道、输出下通道、阻力通道汇合到输出汇合通道；细胞捕获流动腔由上曲线边界、下曲线边界、上直线边界、下直线边界围成，流动腔的高度远小于其宽度和长度，并且尺寸在微米量级，根据流体力学原理可知，流动腔内液体流动主要受压力梯度和上、下平行平板摩擦力的影响，侧面边界摩擦力的影响可忽略不计，沿流动腔高度取平均后得到的平均流速可用类似于处理平面势流的方法求得。因此可以根据已知复势决定的流线形状确定流动腔的边界，构造出具有流体驻点的流动腔。

在Z=x+iy平面上引进复势

式中

和φ(x,y)分别是平均流速

的势函数和流函数，

在我们熟知的流动复势中，W(Z)＝AZⁿ（其中A是实数，n为正数且n>2）对应一类重要的平面势流。由于

Z=x+iy＝re^iθ                    (2)

这里r为Z的模，θ为Z的幅角，所以流函数φ(x,y)和势函数

满足

因此，等势线和流线分别为

rⁿcosnθ=const    (4)

与

rⁿsinnθ=const         (5)

图2给出了n＝3时该平面势流的流线（实线）和等势线（虚线），坐标原点处的流速为零，即流体驻点。利用该平面势流的特点，构造如图3所示的细胞捕获流动腔，使细胞捕获流动腔的轴线、边界与流线重合。因此，上、下曲线边界方程为

$r^n\sin \mathrm{n\θ}=r_0^n\sin n{\mathrm{\θ}}_0(\mathrm{\θ}\∈[{\mathrm{\θ}}_1,\mathrm{\π}-{\mathrm{\θ}}_0\left]\right)---\left(6\right)$

和

$r^n\sin \mathrm{n\θ}={-r}_0^n\sin n{\mathrm{\θ}}_0(\mathrm{\θ}\∈[{\mathrm{\θ}}_0,-\mathrm{\π}-{\mathrm{\θ}}_1\left]\right)---\left(7\right)$

式中

${\mathrm{\θ}}_0={\tan }^{-1}\frac{b}{2L}---\left(8\right)$

$r_0=\sqrt{L^2+b^2/4}---\left(9\right)$

其中L为流动腔的总长度，b为流动腔入口端宽度，θ和r是极坐标系下点的极角和极径，r₀是上曲线边界左端点的极径，θ₀是上曲线边界左端点极角的补角，θ₁是上曲线边界右端点的极角，n是大于2的正实数。上、下直线边界满足

$\mathrm{\θ}=\±(\mathrm{\π}-\frac{\mathrm{\π}}{n})(r\∈[0,L/2\left]\right)---\left(10\right)$

图3虚线为通过零点的两条等势线，满足方程

$\mathrm{\θ}=\±(\mathrm{\π}-\frac{\mathrm{\π}}{2n})(r\∈[0,r_0\sqrt[n]{\sin n{\mathrm{\θ}}_0}\left]\right)---\left(11\right)$

根据平面势流理论，沿细胞捕获流动腔轴线，平均流速从入口处的最大值逐步减小，到细胞捕获点（如图3两条等势线的交点处）流速接近于阻力通道入口流速，因此当细胞悬浮液从流动腔入口流入时，细胞会沿着中心流线流动并逐步减速停留到细胞捕获点。由于细胞尺寸大于阻力通道入口尺寸，此时阻力通道部分关闭，细胞捕获点平均流速

形成流体驻点，实现对悬浮细胞的捕获。若外界扰动试图将被捕获细胞偏离流体驻点，则阻力通道打开将细胞拉回流体驻点，从而实现对细胞进行长时间捕获。

具体原理如图5所示。流入流动腔的总流量为Q，以等势线（图4中白色虚线）为界，输出上通道的流量为Q₁、输出下通道的流量为Q₂、阻力通道的流量为Q₀，因此有

Q＝Q₁+Q₀+Q₂                            (12)

以流场等势线为界，输出上通道的流阻为R₁、输出下通道的流阻为R₂、阻力通道的流阻为R₀，流体驻点处与微通道系统出口的压强差为ΔP，因此有

Q₁R₁=Q₀R₀=Q₂R₂=ΔP          (13)

所以输出上通道、输出下通道和阻力通道的流量与对应流阻成反比。

当细胞流入细胞捕获流动腔，细胞沿中心流线流动至细胞捕获点实现细胞的捕获。由于细胞的几何尺寸大于阻力通道的入口截面尺寸，细胞将阻塞阻力通道使流阻R₀增大，导致流量Q₀减小，流量Q₁和Q₂增大，因此其余的细胞和培养液将流入输出上、下通道。当细胞捕获流动腔内的流场受外界扰动发生改变导致被捕获细胞偏离原来捕获点，此时阻力通道打开，导致Q₀增大，将偏离的细胞重新拉回设定的细胞捕获点，如此可实现对单细胞进行长时间的捕获。此外，利用培养液入口上、下通道可实现对捕获细胞加载各种生物化学因子刺激，研究捕获单细胞在生物化学因子刺激下的生物学效应。

附图说明

图1是自动捕获单细胞的微流控芯片结构图，A-自动捕获微通道系统，B-细胞捕获流动腔。

图2是平面势流流场分布（n＝3）。

图3是细胞捕获流动腔B示意图。

图4是自动捕获微通道系统A示意图。

图5是自动捕获微通道系统A等效原理图。

图6是实验系统示意图。

图1：1培养液入口，2细胞悬浮液入口，3培养液入口上通道，4培养液入口下通道，5细胞悬浮液入口通道，6上曲线边界，7下曲线边界，8上直线边界，9下直线边界，10输出上通道，11输出下通道，12阻力通道，13输出汇合通道，14液体出口。

具体实施方式

图1所示为自动捕获单细胞的微流控芯片结构图。集成了培养液入口1、细胞悬浮液入口2、培养液入口上通道3、培养液入口下通道4、自动捕获微通道系统、输出汇合通道13和液体出口14，其中自动捕获微通道系统由细胞捕获流动腔、输出上通道10、输出下通道11，阻力通道12构成。细胞捕获流动腔B包括一个入口和上、中、下三个出口，入口与培养液入口上通道3、培养液入口下通道4、细胞悬浮液入口通道5相通，上出口与输出上通道10相通，中出口与阻力通道12相通，下出口与输出下通道11相通。输出上通道10，输出下通道11，阻力通道12汇合到输出汇合通道13。芯片所有通道和腔室结构采用标准化的微加工方法用PDMS制作完成，并与洁净玻璃片永久键合密封，构成常见的玻璃-PDMS型芯片。

本实施例中，该装置与可编程注射泵、激光共聚焦（或荧光）显微镜、计算机构成了细胞体外培养分析系统（图6）。一支装有细胞悬浮液的注射器与装置的细胞悬浮液入口2连接，另外两组可编程注射泵的注射器分别装有刺激溶液的溶质和溶剂，通过软件编程控制注射泵的流量变化可得到含有动态生化信号的刺激溶液，将该刺激溶液输入到芯片的培养液入口1对捕获细胞加载动态生化刺激。该芯片在细胞捕获流动腔内对细胞进行捕获，并通过自动捕获微通道系统对捕获的细胞进行长时间的捕获，其中细胞捕获流动腔入口宽度为500μm，长度为2cm，流动腔上直线边界8与下直线边界9角度为120度，过驻点的等势线夹角为60度，对应于复势W(Z)＝AZⁿ中n=3的情况，上曲线边界前段右端点的极角θ₁为135度，阻力通道12宽度为5μm，所有通道和腔室高度为30μm。进一步，利用激光共聚焦或荧光显微镜实时监测细胞在流动腔内的捕获情况，观察细胞在动态生化信号刺激下的生物行为并将信息反馈给计算机以用于细胞生物学分析。本发明可成功对离体悬浮培养的直径大于8μm的单细胞进行长时间的捕获，并对捕获细胞进行动态生化信号的刺激加载、观察和检测，用于分析微环境调控离体细胞生物学行为及其机制的细胞生物学实验研究。

Claims (1)

1.一种自动捕获单细胞的微流控芯片，其特征在于，该微流控芯片包括培养液入口（1），细胞悬浮液入口（2），培养液入口上通道（3），培养液入口下通道（4），细胞悬浮液入口通道（5），自动捕获微通道系统，输出汇合通道（13）和液体出口（14）；

所述的自动捕获微通道系统由细胞捕获流动腔，输出上通道（10），输出下通道（11），阻力通道（12）构成；

其中，细胞捕获流动腔包括一个入口和上、中、下三个出口，入口与培养液入口上通道（3）、培养液入口下通道（4）、细胞悬浮液入口通道（5）相通，上出口与输出上通道（10）相通，中出口与阻力通道（12）相通，下出口与输出下通道（11）相通；输出上通道（10）、输出下通道（11）、阻力通道（12）汇合到输出汇合通道（13）；细胞捕获流动腔由上曲线边界（6）、下曲线边界（7）、上直线边界（8）、下直线边界（9）围成；

上曲线边界（6）和下曲线边界（7）由公式

$r^n\sin \mathrm{n\θ}=r_0^n\sin n{\mathrm{\θ}}_0(\mathrm{\θ}\∈[{\mathrm{\θ}}_1,\mathrm{\π}-{\mathrm{\θ}}_0\left]\right)---\left(6\right)$

和

$r^n\sin \mathrm{n\θ}={-r}_0^n\sin n{\mathrm{\θ}}_0(\mathrm{\θ}\∈[{\mathrm{\θ}}_0,-\mathrm{\π}-{\mathrm{\θ}}_1\left]\right)---\left(7\right)$

确定，式中

${\mathrm{\θ}}_0={\tan }^{-1}\frac{b}{2L}---\left(8\right)$

$r_0=\sqrt{L^2+b^2/4}---\left(9\right)$

其中L为流动腔的总长度，b为流动腔入口端宽度，θ和r是极坐标系下点的极角和极径，r₀是上曲线边界左端点的极径，θ₀是上曲线边界左端点极角的补角，θ₁是上曲线边界右端点的极角，n是大于2的正实数；

上直线边界（8）和下直线边界（9）满足方程

$\mathrm{\θ}=\±(\mathrm{\π}-\frac{\mathrm{\π}}{n})(r\∈[0,L/2\left]\right)---\left(10\right)$

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