CN103923816A - 一种基于微流控技术的细胞捕获阵列 - Google Patents

Abstract

本发明属于细胞生物学装置技术领域，公开了一种基于微流控技术的细胞捕获阵列，该阵列由若干基本单元构成，每个基本单元包括细胞捕获流动腔和后阻力控制通道；每个基本单元以等夹角辐射状排列呈圆形，且每个基本单元的纵向长度相等，基本单元总数目N，N为大于或等于1的整数。基于流体力学原理，本发明在细胞捕获流动腔处能捕获到的单细胞，并能通过后阻力控制通道的压力调节对已捕获的单细胞进行释放，同时进行细胞微环境调控细胞生物学行为及其机制的单细胞生物学研究。

Description

一种基于微流控技术的细胞捕获阵列

技术领域

本发明属于微流控芯片系统领域，具体涉及一种利用流体力学原理和圆形辐射结构捕获单细胞的微流控芯片，以及能对捕获单细胞加载精确动态生化信号的细胞生物学研究装置。

背景技术

传统的细胞生物学的研究对象是细胞群落，因而，所得的结果也只是大部分细胞的平均响应。这样得来的结果必然会忽视许多单细胞生物学事件。而细胞生物学响应的是一个二元状态事件：特定的激活状态或者失活状态。由于细胞群内不同细胞的异质性造成响应时间和分子配置上的差异，导致被研究的细胞群一部分处于激活状态，另一部分细胞处于非激活状态，此种情况下所获得的研究数据只是每个细胞的响应呈现出渐变状态平均结果，这显然不能完全代表真实的现象。如此的细胞行为的异质性在如细胞生长、分裂和感染等复杂生物学事件中非常常见。因此，如何在单细胞水平并能保证足够数量的条件下，研究遗传、生理和生物化学现象，来解释这些过程中的细胞的异质性和观察到有统计学意义的数据显得极其重要。

微流控技术使得创造一种与细胞尺寸相匹配并能整合细胞处理和流体操作等的研究工具成为可能。先前的研究者利用流体力学原理制作的微流控芯片要么只能抓住一个细胞，要么能抓住大量单细胞但无法对捕获单细胞精确加载动态生化信号刺激。基于此，本发明提出一种能够利用流体力学原理捕获足够数量的单细胞，并能够精确加载动态生物化学信号刺激的微流控装置。

发明内容

本发明提供一种基于微流控技术的细胞捕获阵列，可用于单细胞生物学研究。该细胞捕获阵列将细胞悬浮液的灌注、驻点流的形成、后阻力通道的调节集成在一块功能芯片上，使用动态生化信号发生装置对捕获单细胞精确加载动态生化信号刺激，能够较好的在单细胞水平下研究细胞的生物学行为。

本发明将流体力学原理和微流控技术结合，巧妙地将驻点流理论与物理屏障相结合，再通过对后阻力通道的调节，实现了对单细胞的捕获和释放，并利用等夹角辐射阵列结构实现了大量单细胞的捕获。装置设计结构简单，控制过程方便，可通过软件编程自动控制产生动态生化信号，不仅能在体外同时对多个单细胞加载动态的生化刺激，更好地研究单细胞的生物学行为，而且通过流量控制能调控生化因子浓度，实现对离体培养细胞微流动环境的定量调控。

本发明的技术方案如下：

一种基于微流控技术的细胞捕获阵列，该装置包括注射泵、注射器、双通接口、硅胶管、三通接口、液体进口、以等夹角辐射状呈圆形排列构造完全相同的阵列化自动捕获微通道、后阻力控制通道和液体出口构成，如图1所示。

细胞捕获系统包括细胞悬液注射器、细胞培养液注射器、液体进口、阵列化细胞捕获微通道和液体出口。

该阵列由若干结构完全相同的基本单元构成，每个基本单元包括细胞捕获流动腔和后阻力控制通道；每个基本单元以等夹角辐射状排列呈圆形,且每个基本单元的纵向长度相等，基本单元总数为大于或等于1的整数；

所述的阵列化细胞捕获微通道由若干以等夹角辐射状呈圆形排列的细胞捕获流动腔、输出上通道、输出下通道、可调阻力通道构成，如图2所示。其中，每个单独的细胞捕获流动腔包括一个入口和上、中、下三个出口，入口与细胞悬浮液入口通道和细胞培养液入口通道相通，上出口与输出上通道相通，中出口与阻力通道相通，下出口与输出下通道相通；输出上通道、输出下通道、阻力通道汇合到输出汇合通道；细胞捕获流动腔由上曲线边界、下曲线边界、上直线边界、下直线边界围成，如图3A、图3B所示。

由于流动腔的高度远小于其宽度和长度，并且尺寸在微米量级，根据流体力学原理可知，流动腔内液体流动主要受压力梯度和上、下平行平板摩擦力的影响，侧面边界摩擦力的影响可忽略不计，沿流动腔高度取平均后得到的平均流速可用类似于处理平面势流的方法求得。因此可以根据已知复势决定的流线形状确定流动腔的边界，构造出具有流体驻点的流动腔。

对单个细胞捕获流动腔，取如图4所示的平面直角坐标系。在Z＝x+iy平面上引入复势

其中和ψ(x,y)分别是平均流速的势函数和流函数，所以

选取较为常用的流动复势：W(Z)＝AZⁿ，其中A是实数，n是大于2的正整数。

在平面中存在

Z＝x+iy＝re^iθ

$r=\sqrt{x^2+y^2},\mathrm{\θ}=\arctan \left(\frac{y}{x}\right)---\left(3\right)$

其中r为Z的模，θ为Z的幅角，所以势函数和流函数ψ(x,y)满足

因此，势函数和流函数ψ(x,y)的表达式分别为

$\mathrm{\ψ}(x,y)=A\·{(x^2+y^2)}^{\frac{n}{2}}\·\sin [n\·\arctan \left(\frac{y}{x}\right)]---\left(6\right)$

进而得到等势线和流线分别为

$\mathrm{\ψ}={(x^2+y^2)}^{\frac{n}{2}}\·\sin [n\·\arctan \left(\frac{y}{x}\right)]=\mathrm{const}---\left(8\right)$

平面势流图4中（实线代表流线，虚线代表等势线），坐标原点处x＝0、y＝0，所以

所以整体流速为零，即坐标原点处应为流体驻点位置。

利用该平面势流特点，选取n＝2.5构造如图4所示的细胞捕获流动腔，使单个细胞捕获流动腔的轴线与x轴重合，上、下曲线边界与流线重合。上、下曲线边界方程为

${\mathrm{\ψ}}_{\mathrm{up}}={({x_0}^2+{y_0}^2)}^{\frac{n}{2}}\·\sin [n\·\arctan \left(\frac{y_0}{x_0}\right)],\left(\begin{array}{c}x\∈[x_1,x_0]\\ y\∈[y_0,y_1]\end{array}\right)---\left(10\right)$

${\mathrm{\ψ}}_{\mathrm{down}}={({x_0}^2+{y_0}^2)}^{\frac{n}{2}}\·\sin [n\·\arctan (-\frac{y_0}{x_0})],\left(\begin{array}{c}x\∈[x_1,x_0]\\ y\∈[-y_0,{-y}_1]\end{array}\right)---\left(11\right)$

式中

$x_0=L,y_0=\frac{W}{2}---\left(12\right)$

其中L为流动腔的总长度，W为流动腔入口端宽度，x和y是直角坐标系下点的横坐标和纵坐标，x₀和y₀是上曲线边界右端点的横坐标和纵坐标，x₁和y₁是上曲线边界左端点的横坐标和纵坐标（详见图5），n是大于2的正整数。上、下直线边界满足

$y=\±\tan \frac{\mathrm{\π}}{n}\·x(x\∈[0,x_2\left]\right)---\left(13\right)$

其中x₂是上流线边界点的横坐标。

根据平面势流理论，细胞进入流动腔后，沿流动腔中心轴线的平均流速从入口处的最大值逐步减小，到细胞捕获点（如图4两条等势线的交点处）流速接近于阻力通道入口流速，由于细胞尺寸大于阻力通道入口尺寸，当某一细胞沿轴线运动到捕获点位置时，阻力通道被部分关闭，细胞捕获点位置的平均流速V趋近于0，即形成了流体驻点，从而可以实现对悬浮单细胞的捕获。当外界因素影响流场分布，产生扰动时，被捕获细胞将偏离流体驻点，此时阻力通道被打开，根据流量守恒和流阻关系，细胞将会被重新拉回流体驻点，从而实现对细胞进行长时间捕获。

具体原理如下，见图6及等效原理图7。流入流动腔的总流量为Q，以等势线（图6中白色虚线）为界，输出上通道的流量为Q_up、输出下通道的流量为Q_down、阻力通道的流量为Q₀，因此有

Q＝Q_up+Q₀+Q_down       (14)

以流场等势线为界，输出上通道的流阻为R_up、输出下通道的流阻为R_down、阻力通道的可变流阻为R₀，流体驻点处与输出汇合通道间的压强差为ΔP，因此有

Q_upR_up＝Q₀R₀＝Q_downR_down＝ΔP     (15)

所以输出上通道、输出下通道和阻力通道的流量与对应流阻成反比。

具体捕获机制如下：当细胞沿中心流线流动至细胞捕获点时，由于细胞的几何尺寸大于阻力通道的入口截面尺寸，细胞将阻塞阻力通道使流阻R₀增大，导致流量Q₀减小，流量Q_up和Q_down增大，因此其余的细胞和培养液将从上、下输出通道流出。当细胞捕获流动腔内的流场受外界扰动发生改变导致被捕获细胞偏离原来捕获点，此时阻力通道打开，导致Q₀增大，将偏离的细胞重新拉回设定的细胞捕获点，如此可实现对单细胞进行长时间的捕获。

此外，后阻力控制通道，是由捕获层和控制层组成薄膜隔开的双层PDMS结构。在阵列化细胞捕获微通道的捕获层下增加一层带有圆环形微通道结构的控制层，控制层厚度与捕获层厚度保持一个量级。俯视图角度来看（如图6），该圆环形微通道位于各单位芯片的上、下输出通道和可变阻力通道下方，位于可变阻力通道下方的圆环形微通道高度远大于位于上、下输出通道下方的微通道高度（30微米）。控制层只含有单一进出口，同外界气压泵相连，当对控制层充气加压时，控制层和捕获层之间的薄膜变形（如图8A所示），使控制层管道的横截面积S_c增大，捕获层管道的横截面积S_t减小（如图8B所示），使得流阻R₀增大，导致流量Q₀减小。当外界加压P增大到一定程度使得阻力通道几乎完全堵塞，流量Q₀接近于0，细胞很容易受流场扰动且不会被重新拉回，进而沿着上、下输出通道流出，从而达到已捕获细胞被释放的目的。

动态生化信号产生装置包括两组注射泵和注射器，注射器包括溶质注射器、溶剂注射器，每个注射器的活塞凸缘固定在注射泵的推动块上，注射管用夹钳固定在注射器固定块的V型槽内，通过计算机控制推动块的运动实现流量的定量调控。溶质注射器和溶剂注射器通过双通接口和硅胶管连接到三通接口，构成了生成溶液的动态生化信号产生装置。再将动态生化信号产生装置通过双通接口、硅胶管和三通接口连接到细胞捕获系统的液体入口处。便可实行对已捕获到的大量单细胞进行动态信号加载。而由于阵列化细胞捕获微通道的每个单元部分的构造都完全相同，可保证每个单独流动腔内动态生化信号传输特性能保持一致，即是每个被捕获的细胞能分别接受到完全一致的动态生物化学信号。

下面以某溶液A为例阐述生成含有动态生化因子（溶质A）生化信号的原理。如图10所示，Q_A1(t)、Q_A2(t)和Q_A(t)分别表示溶质A、溶剂A和溶液A的流量，C_A1、和C_A(t)分别表示溶质A和溶液A中生化因子浓度，C_A1是常数，溶剂B中不含生化因子，根据质量守恒定律和流体连续性得：

Q_A1(t)+Q_A2(t)＝Q_A(t)      (16)

Q_A1(t)C_A1＝Q_A(t)C_A

由式（16）得：

$Q_{A1}\left(t\right)=\frac{Q_A\left(t\right)C_A\left(t\right)}{C_{A1}}---\left(17\right)$

$Q_{A2}\left(t\right)=Q_A\left(t\right)(1-\frac{C_A\left(t\right)}{C_{A1}})---\left(18\right)$

因此在给定溶液A的流量Q_A(t)、浓度C_A(t)和溶质A的浓度C_A1，即可得到溶质A和溶剂A的流量Q_A1(t)和Q_A2(t)。根据上述原理通过控制注射泵使溶质A注射器和溶剂A注射器的流量按照Q_A1(t)和Q_A2(t)变化，即可生成流量按Q_A(t)、浓度按C_A(t)变化的动态生化信号，即溶液A。

本发明的有益效果是可成功对离体培养的贴壁单细胞实现动态生化信号刺激，用于分析微流动环境定量调控离体贴壁细胞的生物学行为及其机制的细胞生物学研究。

附图说明

图1是基于微流控技术的阵列化细胞捕获装置结构图。

图2是8阵列自动细胞捕获微流控芯片结构俯视图。

图3A是捕获单细胞的微流控芯片单位结构俯视图。

图3B是捕获单细胞的微流控芯片单位结构侧视图。

图4是选取复势W(Z)＝AZⁿ中n=2.5时的平面势流流场分布图。

图5是细胞捕获流动腔IV示意图。

图6是自动捕获微通道III示意图。

图7是自动捕获微通道III等效原理图。

图8A后阻力控制通道原理示意图。

图8B后阻力控制通道结构的侧视图。

图9是溶液A产生原理图。

图10是本发明的装置结构示意图。

图中：1溶质注射器；2溶剂注射器；3细胞悬液注射器；4双通接口；

5硅胶管；6三通接口；7三通接口；8液体进口；

9阵列化细胞捕获微通道；10后阻力控制通道

11液体出口；12玻璃-PDMS芯片；

13流体驱动系统；14计算机显示系统；15激光共聚焦或荧光显微镜；

16细胞捕获8阵列；17可编程的注射泵；18细胞培养液；

19细胞悬浮液；20废液回收；

1-1液体入口；1-2液体入口通道；1-3捕获流动腔上曲线边界；

1-4捕获流动腔下曲线边界；1-5捕获流动腔上直线边界；

1-6捕获流动腔下直线边界；1-7上输出通道；1-8下输出通道；

1-9阻力通道；1-10输出汇合通道；1-11液体出口；1-12捕获层PDMS；

1-13阻力通道与控制层间隔；1-14捕获微通道高度；1-15控制层PDMS；

1-16控制微通道；1-17盖玻片；

I动态生化信号产生装置；II微流控芯片；III自动捕获微通道；

IV细胞捕获流动腔。

具体实施方式

如图1所示，本发明主要由细胞捕获系统和产生动态生化信号产生装置组成。细胞捕获系统是透明的生物相容性良好的玻璃-PDMS芯片，集成了细胞悬液注射器、细胞培养液注射器、液体进口、阵列化细胞捕获微通道和液体出口。其中动态生化信号由可编程的注射泵控制流量变化在组合的硅胶管内混合产生。微流控芯片部分利用流体力学原理和物理屏障成功实现了单细胞的捕获，并巧妙利用辐射结构对细胞捕获流动腔进行阵列化排列，实现了大量单细胞的捕获。动态生化信号产生部分通过硅胶管、连接头与微流控芯片上的液体进口连接构成了流量法控制动态生化刺激的装置。这便可实现将动态信号加载至利用微流控阵列已捕获的大量单细胞上。具体的结构参数如下：捕获单细胞的微流控芯片单位结构中，取n=2.5，捕获流动腔长L为0.1厘米，流动腔入口宽W为50微米；捕获层和控制层后约为2.5～3厘米（保证在一个量级），捕获层的微通道高为30微米；控制层的微通道高度不统一，位于捕获层可变阻力通道下方的微通道与捕获层之间厚度约为20～30微米，其余部分微通道高为30微米，与捕获层一致。

本实施例中，该装置与激光显微镜、计算机构成了细胞体外培养分析系统，如图11所示在单细胞捕获装置部分，分别装有细胞悬液注射器和细胞培养液注射器与液体入口连接，打开含有细胞培养液的注射器使细胞分别进入若干呈辐射状排列的捕获流动腔内；再打开含有细胞培养液的注射器，使各个捕获流流动腔内形成驻点流，通过结合物理屏障对单细胞进行大量的自动捕获。当细胞被捕获后，通过连接控制层的外界气压泵控制流动腔的后阻力，以达到对捕获细胞释放的目的。

其中在动态生化信号产生部分，两组可编程的注射泵的注射器分别装有刺激溶液的溶质和溶剂。给定溶液的流量及浓度变化情况时，即可推算出各组注射器的流量变化，通过软件编程控制注射泵的流量变化即可得到预期的含有动态生化信号的刺激溶液。将该刺激溶液输入到芯片的液体入口对已捕获的细胞加载动态生化信号刺激。

综上，结合单细胞捕获装置部分和动态生化信号产生部分，便可实现大量单细胞加载动态生化信号。进一步利用激光共聚焦或荧光显微镜检测经动态信号刺激后细胞生物学行为事件的变化。发明可对大量单细胞进行捕获和释放，并对其加载动态生化信号刺激，用于在单细胞水平下分析微流动环境定量调控离体细胞的生物学行为及其机制的细胞生物学研究。

Claims (1)

1.一种基于微流控技术的细胞捕获阵列，其特征在于：该阵列由若干结构完全相同的基本单元构成，每个基本单元包括细胞捕获流动腔和后阻力控制通道；每个基本单元以等夹角辐射状排列呈圆形,且每个基本单元的纵向长度相等，基本单元总数为大于或等于1的整数；

所述的细胞捕获流动腔，包括一个入口和上、中、下三个出口，入口与细胞悬浮液入口通道和细胞培养液入口通道相通，上出口与输出上通道相通，中出口与阻力通道相通，下出口与输出下通道相通；输出上通道、输出下通道、阻力通道汇合到输出汇合通道；细胞捕获流动腔由上曲线边界、下曲线边界、上直线边界、下直线边界围成；以流动腔纵向中轴线为x坐标轴，中心入口处为坐标原点，该流动腔的上、下曲线边界是由流线方程确定，具体公式为：

${\left(\sqrt{x^2+y^2}\right)}^n\·\sin [n\·\arctan \left(\frac{y}{x}\right)]={\left(\sqrt{{x_0}^2+{y_0}^2}\right)}^n\·\sin [n\·\arctan \left(\frac{y_0}{x_0}\right)],\left(\begin{array}{c}x\∈[x_1,x_0]\\ y\∈[y_0,y_1]\end{array}\right)---\left(10\right)$

${\left(\sqrt{x^2+y^2}\right)}^n\·\sin [n\·\arctan (-\frac{y}{x})]={\left(\sqrt{{x_0}^2+{y_0}^2}\right)}^n\·\sin [n\·\arctan \left(\frac{-y_0}{x_0}\right)],\left(\begin{array}{c}x\∈[x_1,x_0]\\ y\∈[{-y}_0,-y_1]\end{array}\right)---\left(11\right)$

式中

$x_0=L,y_0=\frac{W}{2}---\left(12\right)$

其中L为流动腔的总长度，W为流动腔入口端宽度，x和y是直角坐标系下点的横坐标和纵坐标，x₀和y₀是上曲线边界右端点的横坐标和纵坐标，x₁和y₁是上曲线边界左端点的横坐标和纵坐标，n是大于2的正整数；

上、下直线边界满足: $y=\±\tan \frac{\mathrm{\π}}{n}\·x(x\∈[0,x_2\left]\right)---\left(13\right)$

其中x₂是上流线边界点的横坐标；

所述的后阻力控制通道，由捕获层和控制层组成薄膜隔开的双层PDMS结构，控制层是一个圆环形微通道，同外界气压泵相连；由于外界气压增大引起控制层和捕获层之间的薄膜变形，使控制层管道的横截面积S_c增大，捕获层管道的横截面积S_t减小，从而使得流动腔的后阻力增大，以达到对捕获细胞释放的目的。