CN104388301A

CN104388301A - 基于流体力学的单细胞高效捕获器件和系统

Info

Publication number: CN104388301A
Application number: CN201410709749.3A
Authority: CN
Inventors: 王文会; 金帝
Original assignee: Tsinghua University
Current assignee: Tsinghua University
Priority date: 2014-11-28
Filing date: 2014-11-28
Publication date: 2015-03-04
Anticipated expiration: 2034-11-28
Also published as: CN104388301B

Abstract

本发明公开了一种基于流体力学的单细胞高效捕获器件和系统，其中，所述单细胞高效捕获器件包括：基底和设置在基底之上的流道及捕获结构，其中，基底和流道及捕获结构以可逆的方式贴合在一起，其中，流道及捕获结构包括多路流道，每路流道包括细胞培养液入口、主流道、细胞捕获区及细胞培养液出口。本发明实施例的基于流体力学的单细胞高效捕获器件，在流道上布置连续串联的细胞捕获区，提高了空间利用率，提高了单细胞的捕获效率，而且制备和使用成本低，可扩展性强。

Description

基于流体力学的单细胞高效捕获器件和系统

技术领域

本发明涉及微流控技术领域，尤其涉及一种基于流体力学的单细胞高效捕获器件和系统。

背景技术

研究细胞在受到外部刺激的情况下，如何分化、增殖、凋亡等特性具有生物医学上的重要意义。传统上，测量细胞的特性时，通常使用1千到1百万个细胞作为一个群体来统计出平均值。但是最近的研究发现，细胞个体的响应其实与群体的响应大相径庭，或者说细胞群体的平均值掩盖了个体细胞的真实的差异化响应。因此，在生物医学领域，如基因分析、药物研发、组织形成、癌症机理、疾病治疗等方面需要利用细胞测量它们的响应时，单细胞分析有了迫切的需求。

在做单细胞分析时，样本准备是必不可少的一步；没有这一步，后面的分析无法进行。而样本准备中，最重要的就是从细胞培养液中把单个细胞一一捕获即固定在指定的位置，以下为方便叙述，称这种技术为单细胞捕获。因为细胞必须存在于细胞培养液中，因此单细胞捕获的主流方法是采用流体力学的原理，设计具有特殊结构的微流控芯片来实现捕获。实现单细胞捕获时，根据细胞是否与周围的支撑面接触，可以分为接触和非接触式两种。其中，非接触式方法一般采用滞点流或者微漩涡来把单个的颗粒或者细胞“吸入”中心。相关技术中的采用滞点流的方式尚不能捕获通常尺寸在10μm级别及以上的细胞，而采用微漩涡方式则不能使漩涡中心的细胞静止下来，这会影响细胞的贴壁性能，因此不适合作为后续分析之用。因此，大多数细胞捕获器件都采用接触式方法。

而相关技术中的接触式方法在实现单细胞捕获时，具有以下缺点：1)不能准确控制细胞的捕获位置；2)所需要的细胞培养液中细胞的样本要足够大，造成细胞样本的极大浪费；3)流道的几何形状设计的非常复杂，增加了对流道的制备要求和成本；4)流道设计的很长，导致微流控芯片上每一个有效捕获单位所占空间大，造成极大浪费。

因此，细胞捕获器件有待改进。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种基于流体力学的单细胞高效捕获器件，该捕获器件在流道上布置连续串联的细胞捕获区，提高了空间利用率，提高了单细胞的捕获效率，而且制备和使用成本低，可扩展性强。

本发明的第二个目的在于提出一种基于流体力学的单细胞高效捕获系统。

为了实现上述目的，本发明第一方面实施例的基于流体力学的单细胞高效捕获器件，包括：基底和设置在所述基底之上的流道及捕获结构，其中，所述基底和所述流道及捕获结构以可逆的方式贴合在一起，其中，所述流道及捕获结构包括多路流道，每路所述流道包括细胞培养液入口、主流道、细胞捕获区及细胞培养液出口。

根据本发明实施例的基于流体力学的单细胞高效捕获器件，在流道上布置连续串联的细胞捕获区，提高了空间利用率，提高了单细胞的捕获效率，而且制备和使用成本低，可扩展性强。

为了实现上述目的，本发明第二方面实施例的基于流体力学的单细胞高效捕获系统，包括：本发明第一方面实施例的基于流体力学的单细胞高效捕获器件；容器，用于储存细胞培养液；以及注射泵，用于将所述细胞培养液泵入所述基于流体力学的单细胞高效捕获器件中的细胞培养液入口。

根据本发明实施例的基于流体力学的单细胞高效捕获系统，在流道上布置连续串联的细胞捕获区，提高了空间利用率，提高了单细胞的捕获效率，而且制备和使用成本低，可扩展性强。

附图说明

图1是根据本发明一个实施例的基于流体力学的单细胞高效捕获器件的示意图；

图2A是根据本发明一个实施例的细胞在流道中流动的示意图；

图2B是根据本发明一个实施例的一路流道及其中的主流道和捕获区的示意图；

图3是根据本发明一个实施例的流道中对应于结构的缺省值时每个细胞捕获区的体积流率比；

图4A是根据本发明一个实施例的L1,L2,L3和W1对体积流率比的影响示意图(以第一个细胞捕获区为例)；

图4B是根据本发明一个实施例的L1,L2,L3和W1对体积流率比的影响示意图(以第六个细胞捕获区为例)；

图5是根据本发明一个实施例的流道中对应于结构的优化值时每个细胞捕获区的体积流率比的示意图；

图6是通过PDMS软光刻方法加工出的基于流体力学的单细胞高效捕获器件的示意图；

图7A是根据本发明一个实施例的细胞被捕获后在显微镜下观察到的明场图；

图7B是根据本发明一个实施例的细胞被捕获后在显微镜下观察到的明场图所对应的荧光图；

图8是根据本发明一个实施例的单个细胞在流道中移动的动态示意图；

图9是根据本发明一个实施例的基于流体力学的单细胞高效捕获系统的结构示意图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

下面参考附图描述本发明实施例的基于流体力学的单细胞高效捕获器件和系统。

图1是根据本发明一个实施例的基于流体力学的单细胞高效捕获器件的示意图。如图1所示，本发明实施例的基于流体力学的单细胞高效捕获器件10，包括：基底100和设置在基底100之上的流道及捕获结构200。

其中，基底100和流道及捕获结构200以可逆的方式贴合在一起，其中，流道及捕获结构200包括多路流道210，每路流道包括细胞培养液入口、主流道、细胞捕获区及细胞培养液出口。

在本发明的一个实施例中，流道及捕获结构200所包含的流道210的数量可根据需求进行配置。

在本发明的一个实施例中，多路流道210的细胞培养液入口相互独立或连成一块。

在本发明的一个实施例中，多路流道210的细胞培养液出口相互独立或连成一块。

具体地，如图1所示，基于流体力学的单细胞高效捕获器件10的上部分为流道及捕获结构200，下部分为基底100。上下两部分以可逆的方式贴合在一起，捕获完一批细胞后可以拆开，作必要的洗脱、消毒等处理之后与新的基底重新贴合用于捕获另一批细胞。

其中，上部分的流道及捕获结构200包含多路流道210，如图2A、图2B所示，每一路流道210分为细胞培养液入口、主流道、细胞捕获区、及细胞培养液出口。流道210的数量可以自由选择，且这些流道210的入口可以连成一块或者相互独立存在，出口也可以连成一片或者独立存在。原始的细胞悬浮液从入口导入，多余的细胞培养液从出口流出。

在本发明的一个实施例中，单细胞高效捕获器件10横着放置时，如图2A、图2B所示，每路流道210包括梯子状的区域或者由T字型和倒T字型组成的结构重复而成的区域，其中，每一个T字型的右上角或倒T字型的右下角处的流道由宽变窄，由宽变窄的区域为细胞捕获区。另外，T字型或倒T字型中的平置宽流道及竖直的宽流道称为主流道，允许细胞随细胞培养液无损伤通过。

需要说明的是，本发明实施例的基于流体力学的单细胞高效捕获器件10，可以有很多并行的且结构完全一样或者不一样的流道。结构相同的流道，可以用于捕获相同类型和尺寸的细胞；结构不同的流道，可以用于捕获不同类型和尺寸的细胞。另外，如图2A所示，每路流道210都包括梯子状的区域，如果把梯子竖着看，梯子的横杆的左侧或者右侧周期性地设计有一个比流道大部分尺寸更窄的收口，这个收口及其附近区域称作细胞捕获区用于捕获住流经的细胞培养液中的细胞，流道尺寸不变的其它区域称为主流道，它让细胞培养液无障碍通过。

其中，细胞捕获区的数量可根据需要进行设计，数量的多少不影响单细胞捕获的性能。一般来讲，在1平方厘米尺度上可布置上万个细胞捕获区。

在本发明的实施例中，每个细胞捕获区有一个体积流率比Q₁/Q₂，该值决定于流道的几何结构和尺寸。对于给定的几何结构，以体积流率比为目标函数，对流道的尺寸来说，合适的选择应使体积流率比在1-2之间。其中，细胞捕获区的体积流率比Q₁/Q₂将在后面的实施例中进行具体介绍。

对每一路流道210，细胞在细胞培养液中以队列方式一个接一个地被细胞捕获区捕获。换句话说，每一次，细胞队列中的第一个细胞被第一个空余捕获区捕获，如此循环往复，所有的细胞捕获区都捕获到单细胞。平均来讲，单细胞从进入细胞捕获区到被捕获约为1-2秒。

进一步地，利用本发明实施例的基于流体力学的单细胞高效捕获器件可以制作图形化的细胞阵列。其制作方法是待捕获的细胞阵列在基底100上恢复粘附后，将器件的上下两部分(即流道及捕获结构200和基底100)分离开，上部分可以重复利用来捕获细胞，而基底100上即留下了图形化的细胞阵列。

另外，如图1所示，细胞悬浮液通过注射泵从细胞培养液入口泵入，经过单细胞高效捕获器件10进行单细胞捕获后，多余的细胞和培养液从出口流回到装有细胞悬浮液的容器，从而节省细胞悬浮液。

本发明实施例的基于流体力学的单细胞高效捕获器件，在流道上布置连续串联的细胞捕获区，提高了空间利用率，提高了单细胞的捕获效率，而且制备和使用成本低，可扩展性强。

如前文所述，体积流率比Q₁/Q₂的值决定于流道的几何结构和尺寸，下面进行详细说明。

本发明利用“最小流阻原理”进行单细胞捕获，根据流阻原理，要让细胞捕获区能够被动地捕获住细胞，就必须把细胞捕获区的流阻设计得低于主流道的流阻，而流阻高低可以用另一个更加方便的参数来描述，就是体积流率，定义为单位时间内流过流道的液体的体积。

具体地，如图2A所示，例如，流体从入口进入流道后，当流体有通道1和通道2可选时，如果通道1的体积流率Q₁与通道2的体积流率Q₂的比值Q₁/Q₂大于1，则流体将优先通过通道1，那么细胞随细胞培养液流过收口1时，细胞会被流体动力卡在收口1处，从而实现捕获。重要的是，一旦通道1中有细胞被卡在收口处，该通道因被阻塞住其流阻会急剧变大，大大超过主流道的流阻，因此细胞培养液将选择从主流道(例如，图2A中的通道2)通过，从而绕过这个已经捕获了细胞的收口，到达下一个待捕获细胞的收口2处。通过这种循环往复的流体动力学，当所有的收口处都捕获住细胞后，多余的细胞培养液将从主流道的出口处流出，被收集起来以作它用。如图2B所示，W₂和H数值的选择由匹配细胞大小的原则来定，其余的四个变量L₁,L₂,L₃和W₁则需要选择合适的值使得Q₁/Q₂大于1。这里我们假设待捕获的细胞大小为15-20μm，W₂＝H＝25μm稍微大于细胞直径以防止细胞培养液阻塞，选择一组值为：L₁＝90μm,L₂＝6μm,L₃＝90μm,W₁＝9μm，称这组值为缺省值。需要指出的是，如图2A、图2B所示，除了收口处和标出宽度为W₁处，其它流道的宽度都为W₂，且所有流道的高度均设置为H。

本发明实施例的流道及捕获结构200的结构有好几个优点。第一，空间浪费小。因为我们重复利用T字型和倒T字型的流道组合，细胞捕获区可以被密集布放，在正反两个方向上高度利用了流阻的变化。第二，节约细胞样本。因为细胞培养液从入口处到出口处，都是按照列队行进的方式通过与细胞尺寸相匹配的主流道；每一次捕获，都是队列中的第一个细胞被当前细胞捕获区捕获，队列中剩余的细胞都没有任何损伤地通过主流道行进至下一个细胞捕获区。这种确定性的捕获方式理论上决定了，有多少个细胞捕获区，细胞培养液中有多少个细胞就能保证所有的捕获区完成单细胞捕获。这对非常珍贵的细胞样本如干细胞和循环癌症细胞意义重大。第三，捕获快、通量高。因为空间浪费小，细胞培养液流经较短的距离就到达了捕获区，这意味着在捕获细胞时，速度更快。另外，本发明的流道及捕获结构200(即微流控芯片)，可以布设M个并行的流道，每个流道上布设N个细胞捕获区，则通量可以达到M乘以N个。

要让微流控芯片能够成功运行，必须保证Q₁/Q₂的值至少大于1，这涉及到如何设计及优化该芯片中流道的几何形状和尺寸。图2B中标出了6个关键的参数，其中主流道的宽度W₂和深度H取决于所要捕获的细胞尺寸，在设计中可以作为一个常数来处理，其余的参数(L₁,L₂,L₃和W₁)则可以以Q₁/Q₂为目标函数进行优化。因此，下面给出Q₁/Q₂的表达式。

根据Darcy-Weisbach方程和Hagen-Poiseuille流体方程解，微流道的压降可以表示为：

Δp = \frac{ρ V^{2}}{2} (f \frac{L}{D} + Σ K_{l}), - - - (1)

其中，f为达西摩擦因子，L为流道的长度，ρ为流体密度，V为流体平均流动速率，D为水力直径，∑K_L代表了所有因流体压缩、合并、分散及其造成的涡流而形成的水头损失。

在本发明的实施例中，流道模型在实验中达到的最大雷诺数Re不会超过10，表明流体的特性为层流。而对于雷诺数Re低于10的层流流体，由于壁面摩擦而引起的压降(公式(1)的前半部分)要远大于由于上述其他原因造成的水头损失(公式(1)的后半部分)，所以公式(1)中∑K_L可以忽略不计。对于矩形横截面的流道来说，D可进一步表达为4A/P，而V可表达为Q/A，其中A和P分别为流道的横截面面积和周长，Q是流道的体积流率。达西摩擦因子f与纵横比α以及雷诺数Re＝ρVD/μ有关，其中，μ为流体动力粘性系数，纵横比定义为流道横截面的宽高之比或高宽之比使得0≤α≤1。

对于矩形横截面流道中的完全发展层流，可以由下式(2)得到达西摩擦因子f与纵横比α和雷诺数Re之间的关系：

C(α)＝96×(1-1.3553α+1.9467α²-1.7012α³+0.9564α⁴-0.2537α⁵)， (2)

其中，C(α)为摩擦常数，C(α)＝(f×Re)_fd，下标fd(fully developed)表示完全发展。

而要形成完全发展层流，流道必须满足条件：L/D>300。而对于本发明实施例的流道，最大的L/D不会超过10，所以是不足以形成完全发展层流的。故需要用下式(3)对公式(2)进行修正以适用于本发明中的不完全发展层流情况，修正后的公式(3)为：

C = f_{app} \times Re = {[{3.2 / {(x^{+})}^{0.57}}^{2} + {(f \times Re)}_{fd}^{1}]}^{\frac{1}{2}}, - - - (3)

其中，x⁺定义式如下：

x⁺＝L/(D·Re)＝μLP²/(16ρAQ)， (4)将公式(2)、(3)和(4)带入公式(1)中得：

Δp = \frac{C}{32} \cdot \frac{μlQ P^{2}}{A^{3}}, - - - (5)

在本发明的一个实施例中，如图2A所示，细胞培养液流体从细胞捕获区的一端A到另一端B有第一路径(路径1，由A到B的一条直线段)和第二路径(路径2，由A-C-D-B的折线)，其中，第一路径的微流道的压降和第二路径的微流道的压降相等。

在本发明的一个实施例中，每个细胞捕获区具有各自的体积流率比Q₁/Q₂，其中，Q₁为第一路径的体积流率，Q₂为第二路径的体积流率，当Q₁/Q₂大于1时，细胞培养液流体优先通过第一路径，以捕获细胞。

具体地，对从位置A到B的两条路径1和路径2，忽略流体的微量损耗，上面的公式(5)可以给出这两条路径上的压降。路径1和2的体积流率如图2A所标示。第二路径(路径2)包括第一子路径A-C、第二子路径C-D和第三子路径D-B。路径2上的压降可以描述为：

Δ p_{2} = \frac{μ {P_{2}}^{2}}{32 {A_{2}}^{3}} \cdot [2 C_{21} L_{3} Q_{2} + C_{22} L_{1} (Q_{1} + Q_{2})], - - - (6)

其中，P₂＝2(W₂+H)，A₂＝W₂·H，

C_{22} = {[{3.2 / {({x_{22}}^{+})}^{0.57}}^{2} + C {(α_{2})}^{2}]}^{\frac{1}{2}}, {x_{21}}^{+} = μ L_{3} P_{2}^{2} / (16 ρ A_{2} A_{2}), {x_{22}}^{+} = μ L_{1} P_{2}^{2} / [16 ρ A_{2} (Q_{1} + Q_{2})],

α₂＝W₂/H。

而对于路径1(第一路径)，如图2B所示，因为在细胞捕获区有三段几何形状，因此它的压降对应地有三个部分(即第一子路径m-n、第二子路径n-p和第三子路径p-q)。对于宽和窄不变的部分(第一子路径m-n和第三子路径p-q)，其压降的计算类似于路径2，对于从宽到窄变化的弧形部分(第二子路径n-p)，其压降可以表达为：

Δ {p_{1}}^{'} = {&Integral;}_{0}^{L_{T}} \frac{C_{12}}{32} \cdot \frac{μ Q_{1} P^{2}}{A^{3}} dL, - - - (7)

其中，

P = 2 (\sqrt{{W_{2}}^{3} - 4 L^{2}} + H), A = \sqrt{{W_{2}}^{2} - 4 L^{2}} H, L_{T} = \sqrt{{W_{2}}^{2} - {W_{1}}^{2}} / 2,

C_{22} = {[{3.2 / {({x_{22}}^{+})}^{0.57}}^{2} + C {(α_{2})}^{2}]}^{\frac{1}{2}},

x₁₂ ⁺＝μLP²/(16ρAQ₁)，

α = \sqrt{{W_{2}}^{2} - 4 L^{2}} / H .

那么，路径1上的总压降可以表达为：

Δ p_{1} = \frac{C_{11}}{32} \frac{μ (L_{1} - L_{2} - L_{T}) Q_{1} {P_{2}}^{2}}{{A_{2}}^{3}} + \frac{C_{13}}{32} \frac{μ L_{2} Q_{1} {P_{1}}^{2}}{{A_{1}}^{3}} + Δ {p_{1}}^{'}, - - - (8)

其中，P₁＝2(W₁+H)，A₁＝W₁H，

C_{13} = {[{3.2 / {({x_{13}}^{+})}^{0.57}}^{2} + C {(α_{1})}^{2}]}^{\frac{1}{2}}, {x_{11}}^{+} = μ (L_{1} - L_{2} - L_{T}) P_{2}^{2} / (16 ρ A_{2} A_{1}),

α₁＝W₁/H，

{x_{13}}^{+} = μ L_{2} P_{1}^{2} / (16 ρ A_{2} Q_{1}) .

由于第一路径的微流道的压降和第二路径的微流道的压降相等，即Δp₁＝Δp₂，由此根据公式(7)和(8)便可以得到Q₁/Q₂的解。由于上述式子较为复杂，较难得到Q₁/Q₂的解析解，可以利用数学计算软件如Matlab计算出其数值解。在计算的过程中，由于Q₁和Q₂的值相互依赖，故通过变化Q₂(或Q₁)的值相应地计算出一系列Q₁(或Q₂)的值，从而得到Q₁/Q₂(参看表格1，表格1为说明在不同的Q₂下通过理论数值计算得到的Q₁/Q₂值)。可以看出，当Q₂<10^-11m³/s时，无论Q₂如何变化，Q₁/Q₂均基本不变，而当Q₂>10^-11m³/s时，当Q₂增大时，Q₁/Q₂会减小)。当Q₂<10^-11m³/s时，C和C(α)之间的最大差异小于0.6％，故有下述的化简：

C₁₁＝C₂₁＝C₂₂＝C(α₂)，C₁₃＝C(α₁)，C₁₂＝C(α)。

如此，就使得Q₁/Q₂能够得到解析解如下：

\frac{Q_{1}}{Q_{2}} = \frac{\frac{C (α_{2}) {(W_{2} + H)}^{2} (L_{1} + 2 L_{3})}{{W_{2}}^{3}}}{- \frac{C (α_{2}) {(W_{2} + H)}^{2} (L_{2} + L_{T})}{{W_{2}}^{3}} + \frac{C (α_{1}) {(W_{1} + H)}^{2} L_{2}}{{W_{1}}^{3}} + {&Integral;}_{0}^{L_{T}} \frac{C (α) {(\sqrt{{W_{2}}^{2} - 4 L^{2}} + H)}^{2}}{{\sqrt{{W_{2}}^{2} - 4 L^{2}}}^{3}} dL}, - - - (9)

其中，C(α₁)为第一路径中的第三子路径的摩擦常数，C(α₂)为第一路径中的第一子路径和第二路径中所有子路径的摩擦常数，C(α)为第一路径中的第二子路径的摩擦常数，W₁为第一路径中的第三子路径的宽度，W₂为第一路径中的第一子路径的宽度和第二路径中所有子路径的宽度，H为第一路径和第二路径的高度，L₁为第二路径中的第二子路径的长度，L₂为第一路径中的第三子路径的长度，L₃为第二路径中的第一和第三子路径的长度，L_T为第一路径中的第二子路径的长度。

其中，需要注意的是第一路径中连接第一子路径(m-n)和第三子路径(p-q)的第二子路径(n-p)由光滑过渡的圆弧形构成。

在公式(9)中，W₂和H如前所述，数值的选择由匹配细胞大小的原则来定，其余的四个变量L₁,L₂,L₃和W₁则需要选择合适的值使得Q₁/Q₂大于1。

表1

Q₂(m³/s)	10^-13	10^-12	10^-11	10^-10	10^-9	10^-8
							Q₁/Q₂	3.51	3.51	3.49	3.28	2.32	1.36

这四个变量L₁,L₂,L₃和W₁的选择可以通过数字仿真的方法来定。简单一点讲，可以利用计算流体力学软件包，如Fluent来计算出流体在流道中的速度分布，进而得到体积流率比。这里我们假设待捕获的细胞大小为15-20μm，W₂＝H＝25μm稍微大于细胞直径以防止细胞阻塞流道，选择一组值为：L₁＝90μm,L₂＝6μm,L₃＝90μm,W₁＝9μm。称这组值为缺省值。假定每一个流道有10个细胞捕获区，且细胞培养液中没有细胞，利用这组缺省值计算出每个细胞捕获区的体积流率比如图3所示。从图3中可以发现三个有代表性的模式：(1)第一个捕获区的体积流率比最低，而最后一个捕获区的最高；(2)第二个捕获区相对周围的捕获区体积流率比更高；(3)中间其它捕获区的体积流率比相对稳定。其中，第一点和第三点意义较大。第一点说明在设计中要重点关注第一个捕获区使其体积流率比符合要求，第三点说明这种结构从理论上可以无限地扩展而不影响体积流率比或捕获性能。

因此为确定一组优化值，下面每次只对缺省值里的某一个变量改变其数值，来计算出该单个变量对体积流率比的影响，图4给出了这几个变量分别变化时，对应的体积流率比与缺省值的变化关系。事实上，任何一个变量的改变，其对体积流率比的影响对所有捕获区都是一致的，即同时增加，或者同时减小，图4A、图4B中示意的第一个捕获区和第六个捕获区(即有代表性的中间捕获区)即可看出此趋势。总体上，L₁,L₃和W₁的增加和L₂的减小可以使体积流率比增加。最终，经过比较，获得一组优化值为L₁＝120μm,L₂＝6μm,L₃＝120μm,W₁＝10μm，对应的十个捕获区的体积流率比如图5所示。

仿真同样可以验证当前的捕获区实现了单细胞捕获后，后续的首个捕获区仍能够继续进行单细胞捕获。表格2中所示为流道结构采用前述得到的优化值，仿真没有细胞捕获、第一个、第二个、第三个细胞捕获区每个都分别捕获了单个细胞后，对应的所有细胞捕获区的体积流率比。可见，当某个捕获区实现单细胞捕获后，该捕获区的体积流率比降为接近0(参看表格2中有下划线标记的数据)，失去了流体产生的吸力，从而不能捕获多个细胞；与此相对应，下一个捕获区的体积流率比也下降，但是仍然维持在1以上(参看表格2中倾斜且加粗标记的数据)。换句话说，此时下一个捕获区就成为了第一个捕获区，细胞捕获重复进行直到所有捕获区都捕获了单细胞。

表2

捕获区	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
											零细胞捕获	1.056	1.059	2.714	3.010	2.980	3.028	2.921	3.009	2.573	6.560
单细胞	0.468	1.919	3.334	2.839	3.003	3.005	2.917	2.997	2.557	6.550
											双细胞	0.508	0.712	1.726	3.454	2.888	2.990	2.910	3.015	2.549	6.561
三细胞	0.510	0.821	0.676	1.738	3.523	2.891	2.952	3.019	2.586	6.522

对于尺寸在15-20μm的细胞，一组设计优化值为L₁＝120μm,L₂＝6μm,L₃＝120μm,W₁＝10μm，W₂＝H＝25μm是可行的。对于尺寸不同的细胞，可以通过上面介绍的方法进行分析选择。

流道及捕获结构200的制备可以有多种方法。常见的包括使用PDMS软光刻方法，或者用塑料、聚合物材料有机玻璃等进行机加工或LIGA等微加工方法，加工出流道、收口、细胞培养液进口和出口等。加工好的流道及捕获结构200倒扣在基底100上进行等离子体打氧键合，将流道及捕获结构200变成永久封闭的空间；或者在倒扣在基底上后仅仅进行真空抽气，从而形成可逆的封闭流道空间。将此贴合好的单细胞高效捕获器件10平放或者使入口比出口位置稍微高一些放置，在入口和出口处分别与外部液路相连。使用时，与入口处相连的细胞培养液可以放置的比器件高，将细胞培养液加入时，通过重力作用，细胞培养液就会自动流经流道及捕获区，完成细胞的捕获。

图6所示为通过PDMS软光刻方法加工出的流道及捕获结构200的示意图，包括入口、流道及出口。出于演示的目的，这里流道的数目只有4(即M＝4)，每个流道中细胞捕获区的数目为100(即N＝100)。提请注意的是，实际上M和N的数目的选择有很高的灵活性，可以根据需要进行选择。图7A和图7B所示分别为细胞被捕获后在显微镜下观察到的明场图和对应的荧光图，可以看出90％的捕获区都成功地捕获到了单细胞。

图8所示为单个细胞流经主流道到达捕获区的动态图。展示出单个细胞被捕获的平均速度为1-3秒。并且也显示了细胞在捕获的时候是遵守连续性规律的，即在一个细胞被捕获后，下一个细胞“确定性”地被下一个细胞捕获区捕获，不会漏掉细胞捕获区，也不会重复进入同一个已捕获细胞的捕获区。实验结果还表明，单细胞捕获成功率最高达到近90％。这些被捕获的细胞排列整齐，其距离也可以通过调整器件的结构来改变。这些捕获的细胞在原位可以粘附到基底100上，一般1-2小时后粘附较牢，此时可以把流道及捕获结构200从基底100上剥离开，就剩下了图案化的粘附在基底100上的单细胞阵列，这种单细胞阵列将有很广泛的用途。

为了实现上述实施例，本发明还提出一种基于流体力学的单细胞高效捕获系统。

图9是根据本发明一个实施例的基于流体力学的单细胞高效捕获系统的结构示意图。如图9所示，本发明实施例的基于流体力学的单细胞高效捕获系统，包括：基于流体力学的单细胞高效捕获器件10、容器20和注射泵30。

其中，容器20用于储存细胞培养液(即图9中的细胞悬浮液)。注射泵30用于将细胞培养液泵入基于流体力学的单细胞高效捕获器件10中的细胞培养液入口。

另外，基于流体力学的单细胞高效捕获器件10的出口与容器20相连，从单细胞高效捕获器件10出口流出的多余的细胞培养液流回容器20，从而节省了细胞培养液。

本发明实施例的基于流体力学的单细胞高效捕获系统，在流道上布置连续串联的细胞捕获区，提高了空间利用率，提高了单细胞的捕获效率，而且制备和使用成本低，可扩展性强。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。

流程图中或在此以其他方式描述的任何过程或方法描述可以被理解为，表示包括一个或更多个用于实现特定逻辑功能或过程的步骤的可执行指令的代码的模块、片段或部分，并且本发明的优选实施方式的范围包括另外的实现，其中可以不按所示出或讨论的顺序，包括根据所涉及的功能按基本同时的方式或按相反的顺序，来执行功能，这应被本发明的实施例所属技术领域的技术人员所理解。

在流程图中表示或在此以其他方式描述的逻辑和/或步骤，例如，可以被认为是用于实现逻辑功能的可执行指令的定序列表，可以具体实现在任何计算机可读介质中，以供指令执行系统、装置或设备(如基于计算机的系统、包括处理器的系统或其他可以从指令执行系统、装置或设备取指令并执行指令的系统)使用，或结合这些指令执行系统、装置或设备而使用。就本说明书而言，"计算机可读介质"可以是任何可以包含、存储、通信、传播或传输程序以供指令执行系统、装置或设备或结合这些指令执行系统、装置或设备而使用的装置。计算机可读介质的更具体的示例(非穷尽性列表)包括以下：具有一个或多个布线的电连接部(电子装置)，便携式计算机盘盒(磁装置)，随机存取存储器(RAM)，只读存储器(ROM)，可擦除可编辑只读存储器(EPROM或闪速存储器)，光纤装置，以及便携式光盘只读存储器(CDROM)。另外，计算机可读介质甚至可以是可在其上打印所述程序的纸或其他合适的介质，因为可以例如通过对纸或其他介质进行光学扫描，接着进行编辑、解译或必要时以其他合适方式进行处理来以电子方式获得所述程序，然后将其存储在计算机存储器中。

应当理解，本发明的各部分可以用硬件、软件、固件或它们的组合来实现。在上述实施方式中，多个步骤或方法可以用存储在存储器中且由合适的指令执行系统执行的软件或固件来实现。例如，如果用硬件来实现，和在另一实施方式中一样，可用本领域公知的下列技术中的任一项或他们的组合来实现：具有用于对数据信号实现逻辑功能的逻辑门电路的离散逻辑电路，具有合适的组合逻辑门电路的专用集成电路，可编程门阵列(PGA)，现场可编程门阵列(FPGA)等。

本技术领域的普通技术人员可以理解实现上述实施例方法携带的全部或部分步骤是可以通过程序来指令相关的硬件完成，所述的程序可以存储于一种计算机可读存储介质中，该程序在执行时，包括方法实施例的步骤之一或其组合。

此外，在本发明各个实施例中的各功能单元可以集成在一个处理模块中，也可以是各个单元单独物理存在，也可以两个或两个以上单元集成在一个模块中。上述集成的模块既可以采用硬件的形式实现，也可以采用软件功能模块的形式实现。所述集成的模块如果以软件功能模块的形式实现并作为独立的产品销售或使用时，也可以存储在一个计算机可读取存储介质中。

上述提到的存储介质可以是只读存储器，磁盘或光盘等。尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims

1.一种基于流体力学的单细胞高效捕获器件，其特征在于，包括：

基底和设置在所述基底之上的流道及捕获结构，其中，所述基底和所述流道及捕获结构以可逆的方式贴合在一起，其中，

所述流道及捕获结构包括多路流道，每路所述流道包括细胞培养液入口、主流道、细胞捕获区及细胞培养液出口。

2.如权利要求1所述的基于流体力学的单细胞高效捕获器件，其特征在于，所述流道及捕获结构所包含的流道数量可根据需求进行配置。

3.如权利要求1所述的基于流体力学的单细胞高效捕获器件，其特征在于，所述多路流道的细胞培养液入口相互独立或连成一块。

4.如权利要求1所述的基于流体力学的单细胞高效捕获器件，其特征在于，所述多路流道的细胞培养液出口相互独立或连成一块。

5.如权利要求1所述的基于流体力学的单细胞高效捕获器件，其特征在于，所述每路流道包括梯子状的区域或者由T字型和倒T字型组成的结构重复而成的区域，其中，每一个所述T字型的右上角或所述倒T字型的右下角处的流道由宽变窄，所述由宽变窄的区域为所述细胞捕获区。

6.如权利要求5所述的基于流体力学的单细胞高效捕获器件，其特征在于，所述细胞培养液流体从所述细胞捕获区的一端到另一端有第一路径和第二路径，其中，所述第一路径的流体压降和所述第二路径的流体压降相等。

7.如权利要求6所述的基于流体力学的单细胞高效捕获器件，其特征在于，每个所述细胞捕获区具有各自的体积流率比Q₁/Q₂，其中，Q₁为所述第一路径的体积流率，Q₂为所述第二路径的体积流率，当所述Q₁/Q₂大于1时，所述细胞培养液流体优先通过所述第一路径，以捕获细胞。

8.如权利要求7所述的基于流体力学的单细胞高效捕获器件，其特征在于,其中，所述第一路径包括第一子路径、第二子路径和第三子路径，所述第二路径包括第一子路径、第二子路径和第三子路径，所述体积流率比Q₁/Q₂根据下述公式获取：

\frac{Q_{1}}{Q_{2}} = \frac{\frac{C (α_{2}) {(W_{2} + H)}^{2} (L_{1} + {2 L}_{3})}{{W_{2}}^{3}}}{- \frac{C (α_{2}) {(W_{2} + H)}^{2} (L_{2} + L_{T})}{{W_{2}}^{3}} + \frac{C (α_{1}) {(W_{1} + H)}^{2} L_{2}}{{W_{1}}^{3}} + {&Integral;}_{0}^{L_{T}} \frac{C (α) {(\sqrt{{W_{2}}^{2} - {4 L}^{2}} + H)}^{2}}{{\sqrt{{W_{2}}^{2} - {4 L}^{2}}}^{3}} dL},

其中，C(α₁)为所述第一路径中的第三子路径的摩擦常数，C(α₂)为所述第一路径中的第一子路径和所述第二路径中所有子路径的摩擦常数，C(α)为所述第一路径中的第二子路径的摩擦常数，W₁为所述第一路径中的第三子路径的宽度，W₂为所述第一路径中的第一子路径的宽度和和所述第二路径中所有子路径的宽度，H为所述第一路径和所述第二路径的高度，L₁为所述第二路径中的第二子路径的长度，L₂为所述第一路径中的第三子路径的长度，L₃为所述第二路径中的第一和第三子路径的长度，L_T为所述第一路径中的第二子路径的长度。

9.一种基于流体力学的单细胞高效捕获系统，其特征在于，包括：

如权利要求1-8所述的基于流体力学的单细胞高效捕获器件；

容器，用于储存细胞培养液；以及

注射泵，用于将所述细胞培养液泵入所述基于流体力学的单细胞高效捕获器件中的细胞培养液入口。