CN103865752A - 循环肿瘤细胞捕获和分类磁性微流控芯片及其制造和使用 - Google Patents

循环肿瘤细胞捕获和分类磁性微流控芯片及其制造和使用 Download PDF

Info

Publication number
CN103865752A
CN103865752A CN201410081500.2A CN201410081500A CN103865752A CN 103865752 A CN103865752 A CN 103865752A CN 201410081500 A CN201410081500 A CN 201410081500A CN 103865752 A CN103865752 A CN 103865752A
Authority
CN
China
Prior art keywords
circulating tumor
tumor cell
fluidic chip
caught
classifying
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201410081500.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN103865752B (zh
Inventor
樊嘉
杨欣荣
孙云帆
陈翔
徐泱
周俭
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Dunhui Medical Technology Development Co., Ltd.
Shanghai Puen Haihui Medical Laboratory Co., Ltd.
Original Assignee
Zhongshan Hospital Fudan University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhongshan Hospital Fudan University filed Critical Zhongshan Hospital Fudan University
Priority to CN201410081500.2A priority Critical patent/CN103865752B/zh
Publication of CN103865752A publication Critical patent/CN103865752A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN103865752B publication Critical patent/CN103865752B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
    • C12M23/16—Microfluidic devices; Capillary tubes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/34—Internal compartments or partitions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M35/00—Means for application of stress for stimulating the growth of microorganisms or the generation of fermentation or metabolic products; Means for electroporation or cell fusion
    • C12M35/06—Magnetic means
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0693—Tumour cells; Cancer cells

Abstract

本发明提供了循环肿瘤细胞捕获和分类磁性微流控芯片及其制造和使用。所述的循环肿瘤细胞捕获和分类磁性微流控芯片，包括玻璃基片，所述的玻璃基片上设有微流控通道，其特征在于，所述的微流控通道包括主流道，主流道的流入端分别连接样本管道和缓冲液管道，主流道的流出端连接流出道，主流道的侧面从流入端到流出端的方向上依次连接至少两个捕获区域，每个捕获区域内皆设有捕获微结构，每个捕获区域各连接一个鉴定释放管道。本发明可以实现通过一次样品进样即完成单/多标志物循环肿瘤分离、分类和释放收集的功能。

Description

循环肿瘤细胞捕获和分类磁性微流控芯片及其制造和使用
技术领域
本发明涉及一种循环肿瘤细胞捕获和分类磁性微流控芯片及其制造和使用。
背景技术
目前全世界癌症患者约达1400万，每年新发病人数约700万，每年约有500万人死于癌症，而且这一数字还将会继续上升。在我国，估计每年新增病例约120万，每年约有100万人死于癌症。目前包括手术治疗、化疗、放疗在内多种治疗手段还远远不能达到治愈癌症目的，肿瘤高复发、转移及耐药等特性，成为进一步提高癌症患者总体生存的瓶颈。
近来研究提示循环肿瘤细胞在肿瘤转移和复发中扮演关键角色。我们在前期研究中发现循环肝癌细胞的数量与肝癌切除术后早期肝内复发和肺转移密切相关，并且那些具有干细胞特性的循环肿瘤细胞具有很强的成瘤、抗凋亡能力。因此精确地捕获分类这些导致癌症转移、复发的“种子”细胞具有重大的临床和科研意义。然而这群细胞在外周血中极其稀有，平均106个白细胞中只有一个循环肿瘤细胞。目前已有的循环肿瘤细胞捕获技术如梯度密度离心技术、滤膜技术和流式细胞技术在实现循环肿瘤干细胞的捕获分类方面均存在一定的缺陷。梯度密度离心和滤膜技术通过循环肿瘤细胞与血细胞之间物理特性的差异(密度、大小)实现细胞的捕获，由于这两种基于物理特性实现捕获的技术其灵敏度和特异性较低，无法对捕获细胞进行分类，细胞易丢失，限制了其在循环肿瘤细胞捕获中的应用。流式细胞术通过对待测样品进行特定的荧光标记，然后利用复杂的光学检测系统进行鉴定分选，该技术虽可实现不同类别肿瘤细胞的分类收集，但是设备本身成本昂贵、检测效率低、需专人操作，同时检测微量细胞灵敏度差，无法对细胞形态学进行观察，也很难广泛应用于循环肿瘤干细胞的捕获。因此亟需开发一款小型、廉价、操作简单，具有高灵敏度、特异性、一次性使用的、集多标志物捕获和分类的循环肿瘤细胞捕获器件。
微流控芯片技术具有检测高效、集成化、试剂消耗量小等诸多优点正被越来越多地应用于生物医学领域，并已发展出多种微流控细胞捕获技术。然而目前大多数已报道的细胞捕获芯片仍停留在单标志物、单种细胞的捕获，对于多标志物、多类别细胞捕获仍然缺乏相应的手段。它们中的代表是Nagrath S等2007年于Nature上报道的一种单标志物循环肿瘤细胞捕获芯片，该芯片在流道内设置圆形的微柱阵列，经过化学修饰，在流道内壁及微柱表面结合上皮细胞黏附因子抗体，通过细胞流动中与微柱的碰撞来捕获靶细胞。该类芯片无法实现多标志物循环肿瘤干细胞捕获及分类的功能。此外这种芯片的应用还受制于捕获的细胞很难释放收集和前期芯片化学修饰过程复杂等缺点。为了实现多标志物癌细胞捕获的目的，XuY等2009年在Anal Chem上提出蛇形管道划定不同捕获区域，在每个捕获区域的上下游设置进出样开孔，利用开孔的交替开放与封闭在不同区域固定上各自不同的核酸适体，以此来达到在同一管道中并行捕获不同癌细胞的目的。该方法虽然可以实现多标志物细胞的捕获，但多次重复的流道固定使芯片制备过程时间长、步骤多，又由于在同一管道内进行流动固定，容易产生上下游的交叉污染，使假阳性增高，而为了控制假阳性率，必须加长各区域的长度，这对芯片的进一步集成造成了障碍。
因此，为了适应临床和科研需要，亟需开发一种新型的循环肿瘤细胞捕获微流控芯片，这类芯片无需对其内部进行繁复的化学修饰，具备一次样品进样就能对完成包括多标志物循环肿瘤细胞的捕获、分类和释放收集等功能，同时还具有操作简便、集成度高的特点。
发明内容
本发明的主要目的在于克服现有微流控细胞捕获芯片技术的不足，构建一种基于磁性及微捕获结构的循环肿瘤细胞多标志物分类捕获的微流控芯片，其可实现将标记有不同大小/磁强免疫磁粒子的外周血或淋巴液一次注入微流控芯片内即能完成包括多标志物循环肿瘤细胞的捕获、分类和释放收集等功能。
为了达到上述目的，本发明提供了一种循环肿瘤细胞捕获和分类磁性微流控芯片，包括玻璃基片，所述的玻璃基片上设有微流控通道，其特征在于，所述的微流控通道包括主流道，主流道的流入端分别连接样本管道和缓冲液管道，主流道的流出端连接流出道，主流道的侧面从流入端到流出端的方向上依次连接至少两个捕获区域，每个捕获区域内皆设有捕获微结构，每个捕获区域各连接一个鉴定释放管道。
优选地，所述的主流道的侧面从流入端到流出端的方向上依次连接第一捕获区域、第二捕获区域和第三捕获区域。
优选地，所述的每个捕获区域内的捕获微结构共有至少两排，相邻两排中的捕获微结构交错排列，每个捕获微结构包括对称设置的第一侧壁和第二侧壁，第一侧壁和第二侧壁的前后两端皆不连接。
更优选地，所述的第一侧壁和第二侧壁的前端之间的距离为4-7μm，第一侧壁和第二侧壁的后端之间的距离为15-25μm，第一侧壁和第二侧壁的长度为20μm，每排中相邻的捕获微结构之间的距离为25-30μm，相邻两排捕获微结构的距离为40-50μm。
更优选地，所述的捕获微结构的对称中轴线与主流道中线的夹角为45-60度。
优选地，所述的循环肿瘤细胞捕获和分类磁性微流控芯片还包括生物分子标记磁粒子(免疫磁粒子)。
更优选地，所述的生物分子标记磁粒子包括粒径为10-50nm的生物分子标记磁粒子、粒径为300-500nm的生物分子标记磁粒子、粒径为1μm的生物分子标记磁粒子以及粒径为2.8μm的生物分子标记磁粒子的一种或两种以上的组合。
更优选地，所述的生物分子标记磁粒子为至少一种可与靶细胞特异性结合的标记有生物分子抗体的磁粒子。
更优选地，所述的靶细胞为肝癌、肺癌、前列腺癌、乳腺癌、结直肠癌、胃癌、食管癌、胆囊癌、胰腺癌、鼻咽癌、膀胱癌、淋巴瘤、宫颈癌、子宫内膜癌或卵巢癌释放的循环肿瘤细胞。
更优选地，所述的生物分子为蛋白质、核酸、脂类或糖类。
本发明还提供了上述循环肿瘤细胞捕获和分类磁性微流控芯片的制造方法，其特征在于，具体步骤包括：在硅片基底上进行SU8胶光刻，获得所需要的微流控通道的阴模，然后通过聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane，PDMS)成型，制备微流控通道；最后将微流控通道与玻璃基片进行键合，得到循环肿瘤细胞捕获和分类磁性微流控芯片。
本发明还提供了上述循环肿瘤细胞捕获和分类磁性微流控芯片的使用方法，其特征在于，具体步骤包括：
第一步：将含有复杂细胞成份的样品预处理后获得全部有核细胞重悬液，加入生物分子标记磁粒子进行孵育，得到细胞悬液；
第二步：在循环肿瘤细胞捕获和分类磁性微流控芯片外部施加外磁场，将细胞悬液和PBS缓冲液分别通过样本管道和缓冲液管道以相同的流速或压力泵入循环肿瘤细胞捕获和分类磁性微流控芯片；
第三步：将相应的生物分子荧光抗体分别通过鉴定释放管道泵入各捕获区域，同时，将PBS缓冲液以相同的流速从样本管道和缓冲液管道泵入，孵育后，将PBS缓冲液通过鉴定释放管道泵入，荧光显微镜下观察捕获的循环肿瘤细胞，即可实现捕获循环肿瘤细胞的分类鉴定；或者，撤除外磁场，在样本通道和缓冲液通道内以相同的速度泵入细胞培养液或缓冲液，按照从流出端到流入端的顺序依次打开各捕获区域连接的鉴定释放管道的阀门，将细胞培养液或缓冲液从鉴定释放管道泵入，鉴定释放管道内液体的流速要等于或高于样本通道和缓冲液通道内液体的流速，在流出道顺序收集不同捕获区域捕获的循环肿瘤细胞。
优选地，所述的含有复杂细胞成份的样品为静脉血样本、动脉血样本或淋巴液样本。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明的循环肿瘤细胞捕获和分类磁性微流控芯片内具有特定形状的微捕获结构阵列，可以实现通过一次样品进样即完成单/多标志物循环肿瘤分离、分类和释放收集的功能。使用时，被不同大小/磁强免疫磁性粒子标记的靶细胞在流道内受磁场作用产生特定的偏转角度和范围，使不同种类的靶细胞被其所对应的不同微捕获结构阵列区域捕获。不同微捕获结构阵列区域内分离的不同种类的靶细胞可顺序被释放并收集。对于不同微捕获结构阵列区域内分离的不同种类的靶细胞，可使用不同分子生物学鉴定方法(如但不限于生物分子抗体，原位RNA检测技术等)进行分类鉴定。本发明具有较高的灵敏度和特异性，捕获细胞易于收集，无需芯片内部微流通道复杂的表面修饰过程。本发明可用于循环肿瘤细胞的捕获、鉴定、回收、分子生物学分析和基因组学分析。
附图说明
图1为循环肿瘤细胞捕获和分类磁性微流控芯片内部设计示意图。
图2为图1中A处放大图；
图3为循环肿瘤细胞捕获和分类磁性微流控芯片分类捕获的示意图。
图4为循环肿瘤细胞捕获和分类磁性微流控芯片分类鉴定的示意图。
图5为循环肿瘤细胞捕获和分类磁性微流控芯片实施外周血循环肿瘤细胞顺序的示意图。
图6为循环肿瘤细胞捕获和分类磁性微流控芯片实施肝癌患者外周血循环肿瘤细胞检测结果。右上，红色荧光标记EpCAM+循环肝癌干细胞，蓝色荧光标记细胞核；左上，红色荧光标记CD133+循环肝癌干细胞，绿色荧光标记CD45+白细胞，蓝色荧光标记细胞核；右下，绿色荧光标记CD90+循环肝癌干细胞，红色荧光标记CD45+白细胞，蓝色荧光标记细胞核；左下，红色荧光标记CD24+循环肝癌干细胞，绿色荧光标记CD45+白细胞，蓝色荧光标记细胞核。
图7为循环肿瘤细胞捕获和分类磁性微流控芯片实施肝癌患者外周血循环肿瘤细胞捕获并释放后，使用单细胞PCR检测系统，对EpCAM+、CD133+、CD90+和CD24+循环肿瘤干细胞实施47个癌症和干细胞相关基因的表达谱检测。以证明循环肿瘤细胞捕获和分类磁性微流控芯片捕获得到的细胞可以应用于下游分子生物学实验。
图中，
Figure BDA0000473936520000051
为阀门，
Figure BDA0000473936520000052
白细胞，
Figure BDA0000473936520000053
红细胞，
Figure BDA0000473936520000054
、
Figure BDA0000473936520000055
、
Figure BDA0000473936520000056
不同类别的循环肿瘤细胞。
具体实施方式
下面结合实施例来具体说明本发明。
实施例1
如图1所示，为循环肿瘤细胞捕获和分类磁性微流控芯片内部设计示意图，所述的循环肿瘤细胞捕获和分类磁性微流控芯片包括玻璃基片1，所述的玻璃基片1上设有微流控通道，所述的微流控通道包括主流道2，主流道2的流入端分别连接样本管道3和缓冲液管道4，主流道2的流出端连接流出道5，主流道2的侧面从流入端到流出端的方向上依次连接第一捕获区域11、第二捕获区域12和第三捕获区域13，每个捕获区域内皆设有捕获微结构，如图2所示，每个捕获区域内的捕获微结构共有至少两排，相邻两排中的捕获微结构交错排列，每个捕获微结构包括对称设置的第一侧壁21和第二侧壁22，第一侧壁21和第二侧壁22的前后两端皆不连接。所述的第一侧壁21和第二侧壁22的前端之间的距离a为5μm，第一侧壁21和第二侧壁22的后端之间的距离b为20μm，第一侧壁21和第二侧壁22的长度c为20μm，每排中相邻的捕获微结构之间的距离d为30μm，相邻两排捕获微结构的距离e为45μm。捕获微结构的对称中轴线与主流道2中线的夹角α为45度。每个捕获区域各连接一个鉴定释放管道6。循环肿瘤细胞捕获和分类磁性微流控芯片的长度和宽度分别为50mm和10mm。每个捕获区域的宽度为15mm。
所述的循环肿瘤细胞捕获和分类磁性微流控芯片还包括生物分子标记磁粒子(免疫磁粒子)。所述的生物分子标记磁粒子包括粒径为300m的EpCAM标记磁粒子、粒径为50nm的CD133标记磁粒子、粒径为1μm的CD90标记磁粒子、粒径为2.8μm的CD24标记磁粒子。
所述的循环肿瘤细胞捕获和分类磁性微流控芯片的制作方法为：在硅片基底上进行SU8胶光刻，获得所需要的微流控通道的阴模。将PDMS预聚体(DowComing，USA)与固化剂(Dow Coming，USA))按照10∶1的质量比充分混合后，在真空箱中抽真空脱气0.5h以上，直至肉眼可见的小气泡完全消失。将脱气后的混合物小心倾倒在处理好的SU-8阴模上，静置待PDMS混合物充分填充入SU-8阴模上的空隙里，PDMS混合物表面流平，然后放入烘箱中，在95℃下固化一个小时，手工脱模，即得到具有微流控通道结构的PDMS基片，清洗，将待键合的玻璃片和PDMS基片依次用丙酮、乙醇超声清洗5min，用大量去离子水冲洗；将玻璃片放入120℃烘箱，PDMS基片放入80℃烘箱，去水烘干；将玻璃片和PDMS基片的待键合面放在氧等离子体腔中(真空度27Pa，氧气流量1000sccm，电压10V，功率10W，时间60s)，进行表面活化；将氧等离子体处理后的玻璃基片和PDMS基片贴合，小心的赶走气泡，放入烘箱，升温到95℃烘烤10min，即可形成永久键合，得到循环肿瘤细胞捕获和分类磁性微流控芯片。
所述的循环肿瘤细胞捕获和分类磁性微流控芯片的操作方法为：
(1)Hep3B细胞株(购自中科院上海生命科学园，肝细胞肝癌肿瘤细胞，表达EpCAM、CD133、CD90和CD24的Hep3B细胞阳性率分别为99.8％分、98％、0.2％和1％，本实施例中以Hep3B细胞作为掺入法的循环肿瘤细胞)。取4×107的Hep3B细胞，按每份1×107细胞分别与如下荧光抗体以1∶100比例混合CD24-PE(Catalog no.130-095-403，Milteny Biotec)，CD90-FITC(Catalogno.130-095-953，Milteny Biotec)，EpCAM-PE(Catalog no.130-091-253，Milteny Biotec)，CD133-PE(Catalog no.130-080-801，Milteny Biotec)，4℃孵育15min，使用流式细胞仪(BD FACSAria，BD Biosciences)分别分选EpCAM+、CD133+、CD90+和CD24+的Hep3B细胞各1000个，分别用1ml PBS(PBS1X，Catalog no.21-040-CVR，Coming)重悬。取4支Eppendorf管，每个管中放入上述四种Hep3B细胞悬液各100μl(每个管内含有100个Hep3B细胞)。
将上述制备好的四种Hep3B细胞悬液分别掺入1ml健康人外周血，分别得到100个EpCAM+Hep3B/1ml外周血样本、100个CD133+Hep3B/1ml外周血样本、100个CD90+Hep3B/1ml外周血样本和100个CD24+Hep3B/1ml外周血样本。
(2)将含有复杂细胞成份的样品预处理：将上述制备好的血液样本，与其9X体积的红细胞裂解液(Red blood cell lysis solution10X，Catalog no.130094183，Miltenyi Biotec)室温混匀2分钟，加入等体积的PBS缓冲液(PBS1X，Catalog no.21-040-CVR，Coming)终止裂红反应，室温下以350g的离心力离心5分钟，去除上清，加入300μl PBS缓冲液(pH＝7.4)重悬，获得外周血全部有核细胞(包括肿瘤细胞、白细胞、内皮细胞等)重悬液；
(3)300nm的EpCAM标记磁粒子(EasySepTM H uman EpCAM positiveselection kit，Catlog no.18356，StemCell technologies)、粒径为50nm的CD133标记磁粒子(CD133MicroBead Kit，human Catalog no.130-050-801，Milteny Biotec)为直接标记磁粒子，无需用户自行标记。90-biotin抗体(Catalogno.130-099-266，Milteny Biotec)和CD24-biotin抗体(Catalog no.130-099-266，Milteny Biotec)分别与1μm磁粒子(DynabeadsR MyOneTM StreptavidinT1，Catalog no.65601，Life technologies)、粒径为2.8μm磁粒子(DynabeadsRM-280Streptavidin，Catalog no.11206D，Life technologie)分别以体积比1∶1的比例室温30分钟混匀。
(4)将上述的生物分子标记磁粒子加入到外周血全部有核细胞重悬液中，每种生物分子标记磁粒子与外周血全部有核细胞重悬液的以体积比1∶3比例，即300μl细胞重悬液与100μl磁粒子混匀。4℃下孵育60分钟，加入1ml PBS缓冲液(pH＝7.4)，以350g的离心力离心5分钟，去除上清，加入5ml PBS缓冲液(pH＝7.4)重悬，得到含有外周血有核细胞和生物分子标记磁粒子的复合液，以进行后续步骤。
(5)如图3所示，在循环肿瘤细胞捕获和分类磁性微流控芯片外部施加外磁场7(汝铁硼永磁铁)，使用精密注射泵，将含有外周血有核细胞和生物分子标记磁粒子的复合液和PBS缓冲液(pH＝7.4)分别通过样本管道3和缓冲液管道4以相同的流速(2ml/hr)泵入循环肿瘤细胞捕获和分类磁性微流控芯片，生物分子标记磁粒子在外磁场的磁力作用下发生不同角度的偏转，并最终在其相对应的捕获区域内被捕获收集。未与生物分子标记磁粒子结合的其他血细胞(白细胞、内皮细胞等)则经过流出道流入废液池。整个操作过程中鉴定释放管道的阀门处于关闭状态。
(6)如图4所示，将相应的生物分子荧光抗体以1∶100比例稀释后(终体积1-2ml)，进行如下组合：CD24-PE(Catalog no.130-095-403，Milteny Biotec)+CD45-FITC(Catalog no.555482，BD bioscience)，CD90-FITC(Catalogno.130-095-953，Milteny Biotec)+CD45-PE(Catalog no.561866，BDbioscience)，EpCAM-PE(Catalog no.130-091-253，Milteny Biotec)+CD45-FITC(同上)，CD133-PE(Catalog no.130-080-801，Milteny Biotec)+CD45-FITC(同上)，打开鉴定/释放管道阀门，以低流速1ml/hr分别通过鉴定释放管道6泵入各捕获区域，同时，将PBS缓冲液(pH＝7.4)以相同的流速从样本管道3和缓冲液管道4泵入，避光室温孵育2小时，将PBS缓冲液(pH＝7.4)通过鉴定释放管道以2ml/hr的流速泵入，荧光显微镜下观察捕获的循环肿瘤细胞，即可实现捕获循环肿瘤细胞的分类鉴定。分类捕获后的细胞成像结果请参见图6。整个操作过程必须保持外加磁场的存在。
(7)本芯片捕获的EpCAM+、CD133+、CD90+和CD24+的Hep3B细胞数量分别为99个、96个、98个、99个，每种标志物细胞的捕获效率高达99％、96％、98％和99％。使用目前商售的MACS细胞富集系统(QuadroMACSTM Separator andStarting Kits，Miltenyi Biotec，Germany)，按照产品说明书对相同的血样进行处理，每种标志物标志物Hep3B细胞的捕获率分别仅为24％、25％、30％、20％。实验结果显示，本发明方案中微流控芯片对外周血不同标志物循环肿瘤细胞的分类捕获效率明显高于目前商售系统。
实施例2
循环肿瘤细胞捕获和分类磁性微流控芯片及其制造方法与实施例1相同。其操作方法如下：
(1)将含有复杂细胞成份的样品预处理：采集肿瘤患者外周静脉血5ml，用PBS缓冲液(pH＝7.4)稀释2倍，然后小心加于15ml Ficoll分离液(Ficoll-PaqueTM PLUS，Catalog no.17-1440-03，GE Healthcare)之上，室温400g离心30分钟，收集单个核细胞层内的细胞并用10ml PBS缓冲液(pH＝7.4)重悬，室温在离心力为300g的条件下离心10分钟，去除上清，300μl PBS缓冲液(pH＝7.4)重悬，获得外周血全部有核细胞(包括肿瘤细胞、白细胞、内皮细胞等)重悬液；
步骤(2)、(3)(4)与实施例1中步骤(3)、(4)、(5)相同。
(5)如图5所示，撤除外磁场，在样本通道3和缓冲液通道4内以相同的速度(4ml/hr)泵入细胞培养液(DMEM1X，Catlog no.11995-065，Gibco)，按照从流出端到流入端的顺序依次打开各捕获区域连接的鉴定释放管道的阀门(按照捕获区域C→A的顺序)，每个阀门打开时间为4min，间隔1min，将细胞培养液(同上)从鉴定释放管道泵入，鉴定释放管道内液体的流速为(4ml/hr)，在流出道5顺序收集不同捕获区域捕获的循环肿瘤细胞，用于下游研究。
(6)使用显微操作系统(TransferMan NK2，Eppendorf，Germany)将步骤(5)中收集的不同标志物循环肿瘤细胞单细胞分别挑出(每种标志物各收集4个细胞，共16个细胞)，按照产品说明说使用单细胞表达谱系统(BioMarkTM HDsystem，Fluidigm)对16个循环肿瘤单细胞进行单细胞数字PCR检测。检测结果见图7。实验结果显示，本发明方案中的微流控芯片捕获的多种标志物循环肿瘤细胞保持了较好的细胞活性，可进一步应用下游分子生物学分析。

Claims (10)

1.一种循环肿瘤细胞捕获和分类磁性微流控芯片，包括玻璃基片(1)，所述的玻璃基片(1)上设有微流控通道，其特征在于，所述的微流控通道包括主流道(2)，主流道(2)的流入端分别连接样本管道(3)和缓冲液管道(4)，主流道(2)的流出端连接流出道(5)，主流道(2)的侧面从流入端到流出端的方向上依次连接至少两个捕获区域，每个捕获区域内皆设有捕获微结构，每个捕获区域各连接一个鉴定释放管道(6)。
2.如权利要求1所述的循环肿瘤细胞捕获和分类磁性微流控芯片，其特征在于，所述的主流道(2)的侧面从流入端到流出端的方向上依次连接第一捕获区域(11)、第二捕获区域(12)和第三捕获区域(13)。
3.如权利要求1所述的循环肿瘤细胞捕获和分类磁性微流控芯片，其特征在于，所述的每个捕获区域内的捕获微结构共有至少两排，相邻两排中的捕获微结构交错排列，每个捕获微结构包括对称设置的第一侧壁(21)和第二侧壁(22)，第一侧壁(21)和第二侧壁(22)的前后两端皆不连接。
4.如权利要求3所述的循环肿瘤细胞捕获和分类磁性微流控芯片，其特征在于，所述的第一侧壁(21)和第二侧壁(22)的前端之间的距离(a)为4-7μm，第一侧壁(21)和第二侧壁(22)的后端之间的距离(b)为15-25μm，第一侧壁(21)和第二侧壁(22)的长度(c)为20μm，每排中相邻的捕获微结构之间的距离(d)为25-30μm，相邻两排捕获微结构的距离(e)为40-50μm。
5.如权利要求3所述的循环肿瘤细胞捕获和分类磁性微流控芯片，其特征在于，所述的捕获微结构的对称中轴线与主流道(2)中线的夹角(α)为45-60度。
6.如权利要求1所述的循环肿瘤细胞捕获和分类磁性微流控芯片，其特征在于，所述的循环肿瘤细胞捕获和分类磁性微流控芯片还包括生物分子标记磁粒子。
7.如权利要求6所述的循环肿瘤细胞捕获和分类磁性微流控芯片，其特征在于，所述的生物分子标记磁粒子包括粒径为10-50nm的生物分子标记磁粒子、粒径为300-500nm的生物分子标记磁粒子、粒径为1μm的生物分子标记磁粒子以及粒径为5μm的生物分子标记磁粒子的一种或两种以上的组合。
8.如权利要求6所述的循环肿瘤细胞捕获和分类磁性微流控芯片，其特征在于，所述的生物分子标记磁粒子为至少一种可与靶细胞特异性结合的标记有生物分子抗体的磁粒子。
9.权利要求1-8中任一项所述的循环肿瘤细胞捕获和分类磁性微流控芯片的制造方法，其特征在于，具体步骤包括：在硅片基底上进行SU8胶光刻，获得所需要的微流控通道的阴模，然后通过聚二甲基硅氧烷成型，制备微流控通道；最后将微流控通道与玻璃基片(1)进行键合，得到循环肿瘤细胞捕获和分类磁性微流控芯片。
10.权利要求1-8中任一项所述的循环肿瘤细胞捕获和分类磁性微流控芯片的使用方法，其特征在于，具体步骤包括：
第一步：将含有复杂细胞成份的样品预处理后获得全部有核细胞重悬液，加入生物分子标记磁粒子进行孵育，得到细胞悬液；
第二步：在循环肿瘤细胞捕获和分类磁性微流控芯片外部施加外磁场，将细胞悬液和PBS缓冲液分别通过样本管道(3)和缓冲液管道(4)以相同的流速或压力泵入循环肿瘤细胞捕获和分类磁性微流控芯片；
第三步：将相应的生物分子荧光抗体分别通过鉴定释放管道(6)泵入各捕获区域，同时，将PBS缓冲液以相同的流速从样本管道(3)和缓冲液管道(4)泵入，孵育后，将PBS缓冲液通过鉴定释放管道泵入，荧光显微镜下观察捕获的循环肿瘤细胞，即可实现捕获循环肿瘤细胞的分类鉴定；或者，撤除外磁场，在样本通道(3)和缓冲液通道(4)内以相同的速度泵入细胞培养液或缓冲液，按照从流出端到流入端的顺序依次打开各捕获区域连接的鉴定释放管道的阀门，将细胞培养液或缓冲液从鉴定释放管道泵入，鉴定释放管道内液体的流速要等于或高于样本通道(3)和缓冲液通道(4)内液体的流速，在流出道(5)顺序收集不同捕获区域捕获的循环肿瘤细胞。
CN201410081500.2A 2014-03-07 2014-03-07 循环肿瘤细胞捕获和分类磁性微流控芯片及其制造和使用 Active CN103865752B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410081500.2A CN103865752B (zh) 2014-03-07 2014-03-07 循环肿瘤细胞捕获和分类磁性微流控芯片及其制造和使用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410081500.2A CN103865752B (zh) 2014-03-07 2014-03-07 循环肿瘤细胞捕获和分类磁性微流控芯片及其制造和使用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN103865752A true CN103865752A (zh) 2014-06-18
CN103865752B CN103865752B (zh) 2015-10-28

Family

ID=50904765

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410081500.2A Active CN103865752B (zh) 2014-03-07 2014-03-07 循环肿瘤细胞捕获和分类磁性微流控芯片及其制造和使用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN103865752B (zh)

Cited By (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104388301A (zh) * 2014-11-28 2015-03-04 清华大学 基于流体力学的单细胞高效捕获器件和系统
CN104498327A (zh) * 2014-12-17 2015-04-08 华中科技大学 一种高通量微流控芯片、细胞分析装置及方法
CN104614513A (zh) * 2015-01-26 2015-05-13 国家纳米科学中心 一种基于磁分离的弛豫时间免疫传感分析方法
CN104651315A (zh) * 2015-03-19 2015-05-27 武汉大学 一种在微流控芯片中同时利用抗原抗体特异性识别和细胞尺寸差别分选肿瘤细胞的方法
CN104805011A (zh) * 2015-04-28 2015-07-29 中国科学院半导体研究所 一种微流控芯片及利用其捕获循环肿瘤细胞的方法
WO2016086374A1 (zh) * 2014-12-03 2016-06-09 士捷医疗设备(武汉)有限公司 一种模拟细胞体内环境的微流体器件及其应用
CN106047706A (zh) * 2016-06-15 2016-10-26 西北工业大学 一种基于单细胞捕获实现细胞定位培养芯片及其使用及制备方法
CN106867867A (zh) * 2017-01-24 2017-06-20 浙江大学 一种针对尿路上皮癌的尿脱落肿瘤细胞微流控芯片检测技术
CN108535239A (zh) * 2018-03-28 2018-09-14 上海艾瑞德生物科技有限公司 基于微液滴的微流控芯片和检测系统
CN108865655A (zh) * 2018-06-29 2018-11-23 苏州百源基因技术有限公司 一种单细胞捕获装置及捕获方法
CN108896751A (zh) * 2018-05-24 2018-11-27 深圳市帝迈生物技术有限公司 一种微流控芯片和免疫荧光分析仪
CN108977404A (zh) * 2018-07-14 2018-12-11 北京航空航天大学青岛研究院 基于免疫磁珠标记细胞的分级筛选方法
CN109870567A (zh) * 2019-02-20 2019-06-11 广州睿辰生物科技有限公司 基于免疫法分选ApoE蛋白的微流控芯片及其分选方法
CN109874316A (zh) * 2018-05-25 2019-06-11 昆山汇先医药技术有限公司 用于从样本中富集筛选目标物例如细胞、细菌或生物分子的装置
WO2020000525A1 (zh) * 2018-06-29 2020-01-02 苏州百源基因技术有限公司 一种细胞分选装置及分选方法
CN111212900A (zh) * 2017-10-03 2020-05-29 Nok株式会社 细胞捕获装置
CN111349541A (zh) * 2018-12-24 2020-06-30 国家纳米科学中心 用于单细胞捕获和筛选的微流控芯片及其应用
CN111433372A (zh) * 2017-10-19 2020-07-17 生物辐射实验室股份有限公司 具有光致发光的非常规和/或反向变化的数字扩增试验
CN112435714A (zh) * 2020-11-03 2021-03-02 北京科技大学 一种肿瘤免疫亚型分类方法及系统
CN113145192A (zh) * 2021-05-28 2021-07-23 哈尔滨工业大学（深圳） 基于气动阀门打印单个微粒的微流控芯片和方法
CN113388501A (zh) * 2021-06-08 2021-09-14 杭州电子科技大学 一种具有细胞捕获、保持与释放功能的微流管道及方法
CN113996360A (zh) * 2021-11-05 2022-02-01 中山大学 捕获循环肿瘤细胞的超材料微流控芯片及其制备方法
CN114047333A (zh) * 2021-10-28 2022-02-15 烟台攀崖生物技术有限公司 一种胰腺癌循环肿瘤细胞检测试剂盒及其应用方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101234292A (zh) * 2007-11-09 2008-08-06 东南大学 方向可控的微流体介电泳颗粒分离装置
CN101285036A (zh) * 2008-05-16 2008-10-15 深圳先进技术研究院 一种自动化细胞培养微流控芯片装置及其方法
US20100044232A1 (en) * 2007-04-05 2010-02-25 Adam Yuh Lin Particle-Based Microfluidic Device for Providing High Magnetic Field Gradients
CN102360010A (zh) * 2011-08-05 2012-02-22 上海交通大学 一种全血癌细胞捕获集成微流控芯片

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100044232A1 (en) * 2007-04-05 2010-02-25 Adam Yuh Lin Particle-Based Microfluidic Device for Providing High Magnetic Field Gradients
CN101234292A (zh) * 2007-11-09 2008-08-06 东南大学 方向可控的微流体介电泳颗粒分离装置
CN101285036A (zh) * 2008-05-16 2008-10-15 深圳先进技术研究院 一种自动化细胞培养微流控芯片装置及其方法
CN102360010A (zh) * 2011-08-05 2012-02-22 上海交通大学 一种全血癌细胞捕获集成微流控芯片

Cited By (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104388301A (zh) * 2014-11-28 2015-03-04 清华大学 基于流体力学的单细胞高效捕获器件和系统
WO2016086374A1 (zh) * 2014-12-03 2016-06-09 士捷医疗设备(武汉)有限公司 一种模拟细胞体内环境的微流体器件及其应用
CN104498327A (zh) * 2014-12-17 2015-04-08 华中科技大学 一种高通量微流控芯片、细胞分析装置及方法
CN104614513A (zh) * 2015-01-26 2015-05-13 国家纳米科学中心 一种基于磁分离的弛豫时间免疫传感分析方法
CN104614513B (zh) * 2015-01-26 2016-05-25 国家纳米科学中心 一种基于磁分离的弛豫时间免疫传感分析方法
CN104651315A (zh) * 2015-03-19 2015-05-27 武汉大学 一种在微流控芯片中同时利用抗原抗体特异性识别和细胞尺寸差别分选肿瘤细胞的方法
CN104805011A (zh) * 2015-04-28 2015-07-29 中国科学院半导体研究所 一种微流控芯片及利用其捕获循环肿瘤细胞的方法
CN106047706B (zh) * 2016-06-15 2018-11-16 西北工业大学 一种基于单细胞捕获实现细胞定位培养芯片及其使用及制备方法
CN106047706A (zh) * 2016-06-15 2016-10-26 西北工业大学 一种基于单细胞捕获实现细胞定位培养芯片及其使用及制备方法
CN106867867A (zh) * 2017-01-24 2017-06-20 浙江大学 一种针对尿路上皮癌的尿脱落肿瘤细胞微流控芯片检测技术
CN111212900B (zh) * 2017-10-03 2023-09-29 Nok株式会社 细胞捕获装置
CN111212900A (zh) * 2017-10-03 2020-05-29 Nok株式会社 细胞捕获装置
CN111433372B (zh) * 2017-10-19 2024-01-26 生物辐射实验室股份有限公司 具有光致发光的非常规和/或反向变化的数字扩增试验
CN111433372A (zh) * 2017-10-19 2020-07-17 生物辐射实验室股份有限公司 具有光致发光的非常规和/或反向变化的数字扩增试验
CN108535239A (zh) * 2018-03-28 2018-09-14 上海艾瑞德生物科技有限公司 基于微液滴的微流控芯片和检测系统
CN108896751A (zh) * 2018-05-24 2018-11-27 深圳市帝迈生物技术有限公司 一种微流控芯片和免疫荧光分析仪
CN109874316A (zh) * 2018-05-25 2019-06-11 昆山汇先医药技术有限公司 用于从样本中富集筛选目标物例如细胞、细菌或生物分子的装置
WO2020000524A1 (zh) * 2018-06-29 2020-01-02 苏州百源基因技术有限公司 一种单细胞捕获装置及捕获方法
CN108865655B (zh) * 2018-06-29 2022-02-01 苏州百源基因技术有限公司 一种单细胞捕获装置及捕获方法
WO2020000525A1 (zh) * 2018-06-29 2020-01-02 苏州百源基因技术有限公司 一种细胞分选装置及分选方法
CN108865655A (zh) * 2018-06-29 2018-11-23 苏州百源基因技术有限公司 一种单细胞捕获装置及捕获方法
CN108977404A (zh) * 2018-07-14 2018-12-11 北京航空航天大学青岛研究院 基于免疫磁珠标记细胞的分级筛选方法
CN108977404B (zh) * 2018-07-14 2022-01-07 北京航空航天大学青岛研究院 基于免疫磁珠标记细胞的分级筛选方法
CN111349541A (zh) * 2018-12-24 2020-06-30 国家纳米科学中心 用于单细胞捕获和筛选的微流控芯片及其应用
CN109870567A (zh) * 2019-02-20 2019-06-11 广州睿辰生物科技有限公司 基于免疫法分选ApoE蛋白的微流控芯片及其分选方法
CN112435714A (zh) * 2020-11-03 2021-03-02 北京科技大学 一种肿瘤免疫亚型分类方法及系统
CN113145192B (zh) * 2021-05-28 2022-06-07 哈尔滨工业大学（深圳） 基于气动阀门打印单个微粒的微流控芯片和方法
CN113145192A (zh) * 2021-05-28 2021-07-23 哈尔滨工业大学（深圳） 基于气动阀门打印单个微粒的微流控芯片和方法
CN113388501A (zh) * 2021-06-08 2021-09-14 杭州电子科技大学 一种具有细胞捕获、保持与释放功能的微流管道及方法
CN114047333A (zh) * 2021-10-28 2022-02-15 烟台攀崖生物技术有限公司 一种胰腺癌循环肿瘤细胞检测试剂盒及其应用方法
CN113996360A (zh) * 2021-11-05 2022-02-01 中山大学 捕获循环肿瘤细胞的超材料微流控芯片及其制备方法
CN113996360B (zh) * 2021-11-05 2023-02-21 中山大学 捕获循环肿瘤细胞的超材料微流控芯片及其制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN103865752B (zh) 2015-10-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103865752B (zh) 循环肿瘤细胞捕获和分类磁性微流控芯片及其制造和使用
Hyun et al. Advances and critical concerns with the microfluidic enrichments of circulating tumor cells
Chen et al. Rare cell isolation and analysis in microfluidics
US11478797B2 (en) Micro-fluidic system using micro-apertures for high throughput detection of cells
Yu et al. Advances of lab-on-a-chip in isolation, detection and post-processing of circulating tumour cells
Warkiani et al. An ultra-high-throughput spiral microfluidic biochip for the enrichment of circulating tumor cells
Akpe et al. Circulating tumour cells: a broad perspective
CN103869060B (zh) 基于磁珠和微流控芯片的循环肿瘤干细胞检测试剂盒
Yin et al. Microfluidics-based approaches for separation and analysis of circulating tumor cells
Gao et al. Efficient separation of tumor cells from untreated whole blood using a novel multistage hydrodynamic focusing microfluidics
Hao et al. Microfluidic screening of circulating tumor biomarkers toward liquid biopsy
Rana et al. Advancements in microfluidic technologies for isolation and early detection of circulating cancer-related biomarkers
US9908117B2 (en) Microfluidic separation device, separation method using the same and kit for separating circulating rare cells from blood using the same
CN103266050A (zh) 用于分选的微流控芯片及其用途
CN106622411B (zh) 一种微流控芯片及其制备方法和应用
CN102360010A (zh) 一种全血癌细胞捕获集成微流控芯片
CN103170377B (zh) 血细胞分析芯片及应用该芯片的系统
Lien et al. Rapid isolation and detection of cancer cells by utilizing integrated microfluidic systems
CN206244772U (zh) 一种用于细胞捕获、荧光染色的微流控芯片
CN103589629A (zh) 循环肿瘤细胞分离系统
KR20150058955A (ko) 미세입자 분리 및 포획을 위한 장치
Chen et al. Combination of antibody-coated, physical-based microfluidic chip with wave-shaped arrays for isolating circulating tumor cells
US20130109011A1 (en) Methods of and devices for capturing circulating tumor cells
Islam et al. Cell elasticity-based microfluidic label-free isolation of metastatic tumor cells
Kim et al. Micro-/nanotechnology-based isolation and clinical significance of circulating tumor cells

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20190215

Address after: Room 601-1, Building No. 1158, Central Road, Jiuting Town, Songjiang District, Shanghai, 20114

Patentee after: Shanghai Dunhui Medical Technology Development Co., Ltd.

Address before: No. 180, Fenglin Road, Xuhui District, Shanghai

Patentee before: Zhongshan Hospital Affiliated to Fudan University

TR01 Transfer of patent right
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20190618

Address after: Room 601-1, Building No. 1158, Central Road, Jiuting Town, Songjiang District, Shanghai, 20114

Co-patentee after: Shanghai Puen Haihui Medical Laboratory Co., Ltd.

Patentee after: Shanghai Dunhui Medical Technology Development Co., Ltd.

Address before: Room 601-1, Building No. 1158, Central Road, Jiuting Town, Songjiang District, Shanghai, 20114

Patentee before: Shanghai Dunhui Medical Technology Development Co., Ltd.

TR01 Transfer of patent right