CN104498327A - 一种高通量微流控芯片、细胞分析装置及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种高通量微流控芯片、细胞分析装置及方法。所述控芯片包括细胞观察池、刺激物通道、细胞引入通道、缓冲液通道和废液通道；刺激物通道与细胞观察池口部相连，细胞引入通道与细胞观察池侧面相连，连接处靠近口部，缓冲液通道与细胞观察池底部相连，废液通道与细胞观察池口部相连。所述细胞分析装置，包括所述微流控芯片、信号采集装置和电气比例转换阀，所述微流控芯片的通道入口端通分别与独立的电气比例转换阀相连；所述信号采集装置，设置在细胞观察池处，用于采集细胞信号或对细胞进行成像。所述分析方法，包括步骤：细胞捕获、细胞刺激、细胞释放。本发明提供的芯片、装置及方法能实现高通量、多种模式的细胞刺激和分析。

Description

一种高通量微流控芯片、细胞分析装置及方法
技术领域
本发明属于医疗器械领域，更具体地，涉及一种高通量微流控芯片、细胞分析装置及方法。
背景技术
细胞是除病毒以外自然界所有已知生命体的基本单位，是一切生命活动的基础，因此，对细胞的深入研究是揭开生命奥秘、改造生命的关键。细胞通过信号转导对其微环境识别与应答的能力对于生物体的发育、组织修复以及免疫等至关重要。细胞在受到不同化学药物刺激时会引发细胞响应的时空变化，调节细胞的电生理活性从而影响细胞的生长、分化以及维持细胞的生理平衡。
许多动态细胞内反应，比如蛋白质转运，蛋白质的相互作用，翻译后的修饰，胞内物质的扩散和运输等等，都需要高时空分辨的成像技术才能探测到。单细胞实时成像技术以其能够动态捕捉到单细胞的信号成为细胞和系统生物学的金方法。活细胞成像和单细胞动态分析技术极大的促进了我们对细胞免疫反应，细胞信号转导，细胞对药物的响应等过程的了解和认识。流式细胞术和多孔板细胞培养技术是两种细胞分析的传统技术。流式细胞术能够实现高通量单细胞细胞信号采集，但是其不能采集时间依赖的瞬时单细胞刺激信号。多孔板细胞技术能够实现大量细胞的实时刺激信号，但是其不能快速有效的采集单个细胞的信号且其不能快速改变细胞外环境。
微流控芯片技术以其微型化、集成化、自动化、高通量等优点，成为解决传统方法不足的有力武器之一。微流控芯片细胞培养技术能够实现对细胞外环境的精确控制，并且其培养细胞消耗很少。现有微流控细胞捕获技术能够基本实现单细胞捕获、刺激和单细胞动态信号采集，但也存在以下的缺点，1)细胞捕获芯片加工工艺复杂，常需要多层结构才能实现捕获细胞功能，2)细胞捕获通量不高，3)细胞捕获刺激实验结束后，细胞不能快速释放，进而不能实现重复捕获和刺激，4)细胞捕获芯片多为一次性的，不能重复使用，5)不能快速改变捕获细胞的微环境，且刺激时间不可控，刺激物单一，6)不能对捕获的细胞进行多模式刺激。
发明内容
针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种高通量微流控芯片、细胞分析装置及方法，其目的在于通过对微流控芯片的平面设计和压力操作，实现细胞重复捕获和刺激，由此解决现有的微流控芯片实现高通量细胞采集工艺复杂、通量不高技术问题。
为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种微流控芯片，包括细胞观察池、刺激物通道、细胞引入通道、缓冲液通道和废液通道；所述细胞观察池底部有八字形微结构，八字形微结构的宽口朝向细胞观察池口部，其窄口朝向细胞观察池底部，所述刺激物通道与细胞观察池口部相连，所述细胞引入通道与细胞观察池侧面相连，连接处靠近口部，所述缓冲液通道与细胞观察池底部相连，所述废液通道与细胞观察池口部相连。
优选地，所述微流控芯片，其缓冲液通道为两条对称设置与细胞观察池两边的微管道。
优选地，所述微流控芯片，其刺激物通道为一条或多条。
优选地，所述微流控芯片，其刺激物通道为两条，对称设置在细胞观察池两边。
优选地，所述微流控芯片，其细胞引入通道为一条或多条。
按照本发明的另一方面，提供了一种应用所述的微流控芯片的细胞分析装置，包括所述微流控芯片、信号采集装置和电气比例转换阀，所述微流控芯片的刺激物通道、细胞引入通道、缓冲液通道和废液通道的入口端通分别与独立的电气比例转换阀相连，每个电气比例转换阀根据不同电信号，输出相应气压；所述信号采集装置，设置在细胞观察池处，用于采集细胞信号或对细胞进行成像。
按照本发明的另一方面，提供了一种应用所述细胞分析装置进行细胞分析的方法，包括以下步骤：
细胞捕获：增大细胞引入通道的电气比例转换阀的输出气压，使得细胞引入通道内压力大于细胞观察池，将细胞引入细胞观察池内，此时恢复细胞引入通道的电气比例转换阀至原状态并减小缓冲液通道的电气比例转换阀的输出气压，使得细胞观察池底部的八字形微结构捕获待观测细胞；
细胞刺激：增大刺激物通道的电气比例转换阀的输出气压，使得刺激物进入细胞观察池，对捕获的细胞进行刺激，当刺激时间结束，恢复刺激物通道的电气比例转换阀的输出气压至原状态，结束刺激；
细胞释放：增大缓冲液通道的电气比例转换阀的输出气压，维持废液通道的电气比例转换阀的输出气压低于其他通道，使得已捕获的细胞脱离细胞观察池底部的八字形微结构，进入废液通道。
优选地，所述细胞分析的方法，当所述微流控芯片有多条刺激物通道时，细胞刺激步骤增大一条或多条刺激物通道的电气比例转换法的输出气压。
优选地，所述细胞分析的方法，当所述微流控芯片有多条细胞引入通道时，细胞捕获步骤增大其中一条或多条细胞引入通道的电气比例转换法的输出气压。
总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，能够取得下列有益效果：
(1)本发明提供的微流控芯片，结构简单，仅通过平面设计通道，即可实现连续的细胞捕获、细胞刺激过程。所述芯片装置和系统能够实现周期性细胞捕获，刺激，释放的功能，并能实时采集到细胞的响应信号，此功能就可以实现高通量的单细胞动态信号分析。
(2)本发明提供的微流控芯片在刺激技术后，细胞能快速释放，不影响下一批细胞的捕获和刺激，能重复使用。
(3)本发明提供的细胞分析装置，能快速改变捕获细胞的微环境，刺激时间可控，刺激物可根据需求，设计相应的芯片即可。该装置为高通量的单细胞动态信号分析和药物筛选提供了一种新的途径。
(4)本发明提供的细胞分析方法，可灵活的实现多种模式的细胞刺激，如多种药物的时序刺激、对两种或以上的单细胞的捕获以及时序刺激、两种或两种以上的药物对同一种细胞的同时刺激，从而满足不同的实验需求。
附图说明
图1是实施例1的微流控芯片结构示意图；
图2是观察池底部八字形微结构示意图；
图3是实施例1的细胞分析装置结构示意图；
图4是实施例1的细胞分析方法过程，其中图4(a)是单一细胞捕获过程，图4(b)是刺激物刺激过程，图4(c)是刺激过程完成后细胞释放的过程；
图5是实施例2的微流控芯片结构示意图；
图6是实施例2的细胞分析装置结构示意图；
图7是实施例2的细胞分析方法过程，其中图7(a)是2种细胞捕获过程，图7(b)是刺激物1刺激过程，图7(c)是刺激物2刺激过程，图7(d)是刺激完成后细胞释放的过程；
图8是实施例2的实验效果图，其中图8(a)是细胞捕获过程，图8(b)是刺激物1刺激过程，图8(c)是刺激物2刺激过程，图8(d)是刺激结束后细胞释放的过程。
在所有附图中，相同的附图标记用来表示相同的元件或结构，其中：1为细胞观察池，2为刺激物通道，3为细胞引入通道，4为缓冲液通道，5为废液通道，6为信号采集装置，7为电器比例转换阀。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
本发明提供的微流控芯片，包括细胞观察池1、刺激物通道2、细胞引入通道3、缓冲液通道4和废液通道5。
所述细胞观察池1，用于捕获细胞并观察细胞状态，底部有八字形微结构，八字形微结构的宽口朝向细胞观察池1口部，其窄口朝向细胞观察池1底部。所述刺激物通道2，与细胞观察池1口部相连，用于引入刺激物对细胞观察池1内的细胞进行刺激，可有一条或多条，多条刺激物通道2可引入不同的刺激物，对细胞观察池1内的细胞进行依次刺激或者混合刺激。优选地，所述刺激物通道2为两条，对称设置在细胞观察池1两边。所述细胞引入通道3与细胞观察池1侧面相连，用于将细胞引入细胞观察池1，连接处靠近口部，可有一条或多条，多条细胞引入通道3可引入不同的细胞。所述缓冲液通道4与细胞观察池1底部相连，用于控制细胞捕获和释放，优选为两条对称设置于细胞观察池1两边的微管道。所述废液通道5与细胞观察池1口部相连。
本发明提供的细胞分析装置，包括本发明提供的微流控芯片、信号采集装置6和电气比例转换阀7，所述微流控芯片的刺激物通道2、细胞引入通道3、缓冲液通道4废液通道5的入口端分别与独立的电气比例转换阀7相连，每个电气比例转换阀7根据不同电信号，输出相应气压；所述信号采集装置6，设置在细胞观察池1处，用于采集细胞信号或对细胞进行成像。
应用所述细胞分析装置，进行细胞分析的方法，包括以下步骤：
细胞捕获：增大细胞引入通道3的电气比例转换阀7的输出气压，使得细胞引入通道3内压力大于细胞观察池1，将细胞引入细胞观察池1内，此时恢复细胞引入通道3的电气比例转换阀7至原状态并减小缓冲液通道4的电气比例转换阀7的输出气压，使得细胞观察池1底部的八字形微结构捕获待观测细胞；
细胞刺激：增大刺激物通道2的电气比例转换阀7的输出气压，使得刺激物进入细胞观察池1，对捕获的细胞进行刺激，当刺激时间结束，恢复刺激物通道2的电气比例转换阀7的输出气压至原状态，结束刺激；当所述微流控芯片有多条刺激物通道2时，细胞刺激步骤增大一条或多条刺激物通道2的电气比例转换法的输出气压。
细胞释放：增大缓冲液通道4的电气比例转换阀7的输出气压，维持废液通道5的电气比例转换阀7的输出气压低于其他通道，使得已捕获的细胞脱离细胞观察池1底部的八字形微结构，进入废液通道5；当所述微流控芯片有多条细胞引入通道3时，细胞捕获步骤增大其中一条细胞引入通道3的电气比例转换阀7的输出气压。
该方法，并不限于上述文字所反映的顺序，其他步骤的重复次数及任意顺序的组合都落入本发明的保护范围，尤其是：细胞刺激步骤，可对一次捕获的细胞重复一次或多次，可采用不同的刺激物轮流刺激，也可同时刺激。
以下为实施例：
实施例1
一种微流控芯片，为聚二甲基硅氧烷(PDMS)微流控芯片，其由刻有微通道结构的聚二甲基硅氧烷(PDMS)薄层与玻璃片键合而成，芯片高度优选为30μm。
所述PDMS薄层表面加工有微通道结构，其局部微结构如图1所示，包括细胞观察池1、刺激物通道2、细胞引入通道3、缓冲液通道4废液通道5。
本实施例中所述细胞观察池1，用于捕获细胞并观察细胞状态，底部有八字形微结构，八字形微结构的宽口朝向细胞观察池1口部，其窄口朝向细胞观察池1底部，八字形微结构具体尺寸如图2所示。所述刺激物通道2为一条微通道，与细胞观察池1口部相连，用于引入刺激物对细胞观察池1内的细胞进行刺激。所述细胞引入通道3为一条微通道，与细胞观察池1侧面相连，用于将细胞引入细胞观察池1，连接处靠近口部。所述缓冲液通道4为一条微通道，与细胞观察池1底部相连，用于控制细胞捕获和释放。所述废液通道5与细胞观察池1口部相连。
本发明提供的细胞分析装置，如图3所示，包括本发明提供的微流控芯片、信号采集装置6、电气比例转换阀7、主机和连接管，所述微流控芯片的刺激物通道2、细胞引入通道3、缓冲液通道4废液通道5的入口端分别通过连接管与独立的电气比例转换阀7相连，每个电气比例转换阀7根据不同电信号，输出相应气压；所述信号采集或成像单元为便携式CCD或PMT，设置在细胞观察池1处，用于采集细胞信号或对细胞进行成像；主机为微操作系统或个人电脑，控制电气比例转换阀7的实时压力和细胞信号的存储和处理。
本实施例中应用所述细胞分析装置，进行细胞分析的方法，如示意图4所示，其包括以下步骤：
如图4(a)所示，细胞捕获：增大细胞引入通道3的电气比例转换阀7的输出气压，使得细胞引入通道3内压力大于细胞观察池1，将细胞引入细胞观察池1内，此时恢复细胞引入通道3的电气比例转换阀7至原状态并减小缓冲液通道4的电气比例转换阀7的输出气压，使得细胞观察池1底部的八字形微结构捕获待观测细胞；
如图4(b)所示，细胞刺激：增大刺激物通道2的电气比例转换阀7的输出气压，使得刺激物进入细胞观察池1，对捕获的细胞进行刺激，当刺激时间结束，恢复刺激物通道2的电气比例转换阀7的输出气压至原状态。
如图4(c)所示，细胞释放：增大缓冲液通道4的电气比例转换阀7的输出气压，维持废液通道5的电气比例转换阀7的输出气压低于其他通道，使得已捕获的细胞脱离细胞观察池1底部的八字形微结构，进入废液通道5。
实施例2
一种微流控芯片，为聚二甲基硅氧烷(PDMS)微流控芯片，其由刻有微通道结构的聚二甲基硅氧烷(PDMS)薄层与玻璃片键合而成，芯片高度优选为30μm。
所述PDMS薄层表面加工有微通道结构，其局部微结构如图5所示，包括细胞观察池1、刺激物通道2、细胞引入通道3、缓冲液通道4废液通道5。
本实施例中所述细胞观察池1，用于捕获细胞并观察细胞状态，底部有八字形微结构，八字形微结构的宽口朝向细胞观察池1口部，其窄口朝向细胞观察池1底部。所述刺激物通道2为2条，与细胞观察池1口部相连，用于引入刺激物对细胞观察池1内的细胞进行刺激，2条刺激物通道可引入2种不同的刺激物，对细胞观察池1内的细胞进行依次刺激或者混合刺激。所述细胞引入通道3为2条，与细胞观察池1侧面相连，用于将细胞引入细胞观察池1，连接处靠近口部，2条细胞引入通道3可引入2种不同的细胞。所述缓冲液通道4与细胞观察池1底部相连，用于控制细胞捕获和释放，为两条对称设置于细胞观察池1两边的微管道。所述废液通道5与细胞观察池1口部相连。
本发明提供的细胞分析装置，如图6所示，包括本发明提供的微流控芯片、信号采集装置6、电气比例转换阀7、主机和连接管，所述微流控芯片的刺激物通道2、细胞引入通道3、缓冲液通道4和废液通道5的入口端通分别通过连接管与独立的电气比例转换阀7相连，每个电气比例转换阀7根据不同电信号，输出相应气压；所述信号采集装置6，即信号采集或成像单元为便携式CCD或PMT，设置在细胞观察池1处，用于采集细胞信号或对细胞进行成像；主机为微操作系统或个人电脑，控制电气比例转换阀7的实时压力和细胞信号的存储。
应用本实施例中所述细胞分析装置，进行细胞分析的方法，包括以下步骤：
如图7(a)所示，2种细胞捕获：增大细胞引入通道3的电气比例转换阀7的输出气压，使得细胞引入通道3内压力大于细胞观察池1，将细胞引入细胞观察池1内，此时恢复细胞引入通道3的电气比例转换阀7至原状态并减小缓冲液通道4的电气比例转换阀7的输出气压，使得细胞观察池1底部的八字形微结构捕获待观测细胞,如示意图7(a)中所示，一条细胞引入通道3中引入A类细胞A,另一条细胞引入通道3中引入B类细胞B，八字形微结构同时捕获A、B两类细胞；
如图7(b)至图7(c)所示,2种刺激物对细胞刺激：增大一条刺激物通道2的电气比例转换阀7的输出气压，使得刺激物1进入细胞观察池1，对捕获的细胞进行刺激，当刺激时间结束，恢复刺激物通道2的电气比例转换阀7的输出气压至原状态，结束刺激；接下来，增大另一条刺激物通道2的电气比例转换阀7的输出气压，使得刺激物2进入细胞观察池1，对捕获的细胞进行刺激，当刺激时间结束，恢复刺激物通道2的电气比例转换阀7的输出气压至原状态，结束刺激；
如图7(b)至图7(c)所示，细胞释放：增大缓冲液通道4的电气比例转换阀7的输出气压，维持废液通道5的电气比例转换阀7的输出气压低于其他通道，使得已捕获的细胞脱离细胞观察池1底部的八字形微结构，进入废液通道5；
至此，2种细胞捕获、2种刺激物顺序刺激、同步释放的过程完成，重复上述步骤就能实现周期性的高通量细胞刺激。
下面以HeLa细胞实时捕获刺激为例，具体说明本发明的特点和性能，如图8所示，为方便描述，刺激物1、刺激物2、缓冲液为不同浓度的荧光素溶液，细胞悬液为HeLa细胞的悬液(细胞密度大约为106个/毫升)，整个刺激捕获过程和图7示意的基本相同，从图8(a)至图8(d)中可以看出,上述的发明系统能精确的实现细胞捕获，刺激物1的刺激，刺激物2的刺激，刺激结束后的细胞释放的整个过程，重复这个过程就能实现高通量的单细胞实时动态信号分析。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种微流控芯片，其特征在于，包括细胞观察池、刺激物通道、细胞引入通道、缓冲液通道和废液通道；所述细胞观察池底部有八字形微结构，八字形微结构的宽口朝向细胞观察池口部，其窄口朝向细胞观察池底部，所述刺激物通道与细胞观察池口部相连，所述细胞引入通道与细胞观察池侧面相连，连接处靠近口部，所述缓冲液通道与细胞观察池底部相连，所述废液通道与细胞观察池口部相连。
2.如权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述缓冲液通道为两条对称设置于细胞观察池两边的微管道。
3.如权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述刺激物通道为一条或多条。
4.如权利要求3所述的微流控芯片，其特征在于，所述刺激物通道为两条，对称设置在细胞观察池两边。
5.如权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述细胞引入通道为一条或多条。
6.应用如权利要求1至5任意一项所述的微流控芯片的细胞分析装置，其特征在于，包括所述微流控芯片、信号采集装置和电气比例转换阀，所述微流控芯片的刺激物通道、细胞引入通道、缓冲液通道和废液通道的入口端通分别与独立的电气比例转换阀相连，每个电气比例转换阀根据不同电信号，输出相应气压；所述信号采集装置，设置在细胞观察池处，用于采集细胞信号或对细胞进行成像。
7.应用如权利要求6所述细胞分析装置进行细胞分析的方法，其特征在于，包括以下步骤：
细胞捕获：增大细胞引入通道的电气比例转换阀的输出气压，使得细胞引入通道内压力大于细胞观察池，将细胞引入细胞观察池内，此时恢复细胞引入通道的电气比例转换阀至原状态并减小缓冲液通道的电气比例转换阀的输出气压，使得细胞观察池底部的八字形微结构捕获待观测细胞；
细胞刺激：增大刺激物通道的电气比例转换阀的输出气压，使得刺激物进入细胞观察池，对捕获的细胞进行刺激，当刺激时间结束，恢复刺激物通道的电气比例转换阀的输出气压至原状态，结束刺激；
细胞释放：增大缓冲液通道的电气比例转换阀的输出气压，维持废液通道的电气比例转换阀的输出气压低于其他通道，使得已捕获的细胞脱离细胞观察池底部的八字形微结构，进入废液通道。
8.如权利要求7所述的细胞分析的方法，其特征在于，当所述微流控芯片有多条刺激物通道时，细胞刺激步骤增大一条或多条刺激物通道的电气比例转换法的输出气压。
9.如权利要求7所述的细胞分析的方法，其特征在于，当所述微流控芯片有多条细胞引入通道时，细胞捕获步骤增大其中一条或多条细胞引入通道的电气比例转换法的输出气压。
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