CN102174388B - 基于表面电极技术的高通量细胞电融合芯片装置 - Google Patents

Abstract

一种基于表面电极的高通量细胞电融合芯片装置，其由微电极阵列芯片和带进出样导管的盖片构成。微电极阵列芯片自下而上依次分为石英基底层、多聚物微通道层和顶层保护层；在石英基底层上制作底层梳状微电极阵列，多聚物微通道层的中间有微通道，其上制作与底层梳状微电极阵列形状和位置均对应的顶层梳状微电极阵列，并在微通道的侧壁上形成侧壁表面电极，侧壁表面电极分别连接底层梳状微电极阵列和顶层梳状微电极阵列对应的每一对梳齿，使三者电气联通组成三明治结构。本发明通过使微电极阵列贴附与多聚物微通道层上，避免传统的齿状突出电极结构带来的细胞堵塞问题，同时保证微电极的集成度和较好的融合效率。

Description

基于表面电极技术的高通量细胞电融合芯片装置

技术领域

本发明涉及细胞电融合技术，具体涉及一种基于表面电极的高通量细胞电融合芯片装置，其主要使用范围为动物、植物、微生物细胞的融合细胞制备，同时也可应用于电穿孔、电转染等研究中，可广泛应用于遗传学、动植物远缘杂交育种、发育生物学、药物筛选、单克隆抗体制备、哺乳动物克隆等领域。

背景技术

细胞电融合技术自上世纪80年代起，因为其效率较高、操作简便、对细胞无毒害，便于观察，适于仪器应用和规范操作等优点，得到了快速发展和广泛应用。

细胞电融合可以分为两个主要阶段：细胞排队和细胞融合。

细胞排队的原理在于：生物细胞处于非均匀电场中时，被电场极化形成偶极子，该偶极子在非均匀电场作用中会受到特定的力而发生运动，即介电电泳（dielectrophoresis）。利用介电电泳可以控制细胞的运动，在细胞电融合过程中，利用介电电泳现象使细胞排列成串，压紧相互接触的细胞，完成细胞电融合过程所需的排队和融合后压紧。

细胞融合的原理在于：强电场作用会导致细胞膜穿孔，这种效应称为细胞膜电致穿孔效应（electroporation）。在细胞电融合过程中利用电致穿孔效应，使两接触的细胞膜穿孔，从而使细胞间进行膜内物质交换，使细胞质、膜融合，在一定强度的电场作用下的电穿孔是一种可逆穿孔，细胞膜会在减小或撤销电场强度时回复原状，产生细胞电融合过程的膜融合。

传统的细胞电融合系统通常都采用大型融合槽，其优点在于：（1）操作较为简便，采用大型融合槽降低了包括样品进样与出样等步骤的难度；（2）加工简便，大型融合槽的尺寸一般都在厘米量级，利用传统的机械加工手段可以较为方便地加工出所需要的融合槽结构；（3）融合量大，传统的融合槽可以容纳数毫升样品，一次实验即可获得足够的细胞进行后期筛选、培养等工作。

但传统的细胞电融合设备也存在一些缺点：（1）由于融合槽中的电极间距较大，要达到够强度的细胞排队、融合及压紧信号，需要很高的外界驱动电压，往往高达几百上千伏，对系统的电气安全性要求高，系统的成本也因此大为提高；（2）电极间的较大间距不利于对细胞的精确控制等。

为解决这一问题，研究者将细胞电融合技术与MEMS加工技术相结合。MEMS技术的加工范围通常在1 ~ 50 μm，这与细胞的直径范围相当，所产生的微结构能有效控制细胞。有多家研究机构开始研究利用微流控芯片技术或者微电极阵列技术构建生物芯片来实现细胞电融合操作。

例如，美国MIT的研究人员提出了利用微流控芯片技术实现对细胞的精确控制，达到高效的细胞配对和融合；国内赵志强等研究人员也提出了利用MEMS技术构建微电极阵列，通过构建微米量级间距的微电极阵列，实现在低电压条件下的细胞电融合。日本研究者提出的利用一对微电极，通过流路控制细胞的流动，使细胞运动到微电极对位置区域后，利用电场作用使两个细胞形成配对，再借助于电脉冲实现电融合。

但上述芯片仍然存在一定的问题，如美国MIT所研究的微流控芯片虽然较好的解决了细胞配对的问题，但该芯片两电极间的间距较大，仍然需要较高的外界电压才能够实现电融合。而赵志强提出的芯片所集成的微电极数量较少，不能实现高通量融合；微电极所产生的电场强度和电场梯度也比较弱，难以实现细胞的精确控制；所选择的加工材料的抗腐蚀、抗氧化能力也较差；同时，由于未集成进出样装置，操作也较为不便。日本研究者提出的方法效率较低，融合通量远不能满足融合后细胞研究的要求。

重庆大学胡宁等研究人员在上述芯片的基础上也提出了包括三维微电极阵列、柔性微电极阵列、基于微小室结构的细胞电融合芯片等结构，解决了一些问题；本发明的专利是对上述研究的进一步深入探索。

国内外相关专利如下：

200610054121.x，2006年，重庆大学，赵志强等；

CN1482234，2003年，中国科学院上海技术物理研究所，张涛等；

CN86210174，1995年，辽宁肿瘤研究所，梁伟；

4326934, April 27, 1982, Pohl;

441972, April 10, 1982, Pohl;

4578168, March 25, 1986, Hofman;

4695547, Sep 22, 1987, Hillard;

4699881, Oct 13, 1987, Matschke, et al.;

5007995, Apr 16, 1991, Takahizuki。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提出一种基于表面电极的高通量细胞电融合芯片装置，芯片上集成阵列化的微电极结构，保证微电极的集成度和较好的融合效率，微电极贴附于多聚物微通道层上，避免传统的齿状突出电极结构带来的细胞堵塞问题。

本发明的技术方案如下：

基于表面电极的高通量细胞电融合芯片装置，其由微电极阵列芯片和带进出样导管的盖片构成；其特征在于：

所述微电极阵列芯片它自下而上依次分为石英基底层、多聚物微通道层和顶层保护层。

在所述石英基底层上形成有底层梳状微电极阵列，所述底层梳状微电极阵列在石英基底层上以梳齿相对的形式对称设置两组。

所述多聚物微通道层的中间加工有上下开敞的微通道，其位置对应于底层梳状微电极阵列两组之间的位置，微通道的两端为储样孔。

在所述多聚物微通道层上形成有与底层梳状微电极阵列形状和位置均对应的顶层梳状微电极阵列，并在微通道的侧壁上形成有侧壁表面电极，侧壁表面电极分别连接底层梳状微电极阵列和顶层梳状微电极阵列对应的每一对梳齿，使底层梳状微电极阵列、侧壁表面电极和顶层梳状微电极阵列电气联通；所述底层梳状微电极阵列和顶层梳状微电极阵列的电信号输出和输出端分别通过金丝采用金丝键合工艺与在各自的外侧形成键合点，实现与外界控制电路的电气连接，使外围电信号在芯片内部形成细胞电融合所需的电场。

所述带进出样导管的盖片通过表面等离子处理后键合在所述微电极阵列芯片上，其上的进出样导管分别连通微通道两端的储样孔。

本发明通过底层梳状微电极阵列、侧壁电极和顶层梳状微电极阵列电气联通，结合多聚物微通道层，组成“三明治”结构，使多聚物微通道层中的微通道形成光滑的流路通道。电极的材料一致，均选用导电性优异、抗氧化能力强、生物相容性好的金、铂等材料，厚度在0.1~0.5μm。多聚物微通道层的厚度为40~50μm，微通道的宽度为60~100μm，以保证细胞在微通道内部的自由流动，同时，微通道的拐角处均做圆角处理，以降低细胞在微通道内部流动受到的阻力，多聚物的材料选用光敏聚酰亚胺。

石英基底层选用透光度高的石英玻璃，其厚度在500μm~1000μm，以为芯片提供较好的支撑。

盖片选用PDMS等生物相容性好，透光的材料进行加工制造，其上集成了进样和出样导管，以保证样品能够顺利在其内部流动。 

本发明具有如下优点：

本装置可借助底层梳状微电极阵列、侧壁电极和顶层梳状微电极阵列电气联通，结合多聚物微通道层组成的“三明治”结构，在保证微电极的集成度和较好的融合效率的同时，由于侧壁电极和顶层梳状微电极阵列是制作在多聚物微通道层上的，相当于与多聚物微通道层贴附，电极可以做得较薄，由此形成光滑的流路通道，其光滑的微通道流路结构有利于细胞在微通道内部的流动，降低了现有的具有锯齿状电极结构的微通道易使细胞堵塞的可能，消除了以往的齿状电极存在的突出电极影响微通道内部细胞流动的弊端。同时，金质的电极使微电极阵列结构芯片具有良好的电导通特性，结合微电极梳齿间较小的间距可以保证低压驱动条件下的高效融合。本芯片材料具有良好的生物相容性及抗腐蚀性能，这保证了芯片的可靠性，也提高了细胞融合的安全性。同时，芯片内部集成了大量的微电极阵列，可实现大量细胞的同时融合，融合效率高。

附图说明

图1  基于表面电极技术的高通量细胞电融合芯片装置示意图；

图2  基于表面电极技术的高通量细胞电融合芯片装置组装示意图；

图3  基于表面电极技术的高通量细胞电融合芯片装置的各功能层的分解示意图；

图4  基于表面电极技术的高通量细胞电融合芯片的电极的分布结构示意图；

图5  基于表面电极技术的高通量细胞电融合芯片的剖面结构示意图。

具体实施方式

实施例1

参见图1、图2和图3，基于表面电极技术的高通量细胞电融合芯片装置由高通量细胞电融合芯片1和带进出样导管的盖片2组成。

参见图3，高通量细胞电融合芯片1自下而上依次为石英基底层3、多聚物微通道层5和顶层保护层8。

底层梳状微电极阵列4、侧壁表面电极层6、顶层梳状微电极阵列层7、其特点在于底层梳状微电极阵列层4、侧壁电极层6和顶层梳状微电极阵列层7电气联通，并组成“三明治”结构的侧壁表面电极阵列9，结合石英基底层3和多聚物微通道层5，形成光滑的流路通道10。

底层梳状微电极阵列层4采用微加工技术制作在石英基底层3上，以梳齿相对的形式对称设置两组，材料选用导电性能优异，生物相容性强的金、铂等材料，厚度为0.1~0.5 μm。结合图4可见，其梳齿11的宽度为20 μm，同一梳脊12上两相邻梳齿11间的间距为60 μm，梳齿11的长度为100 μm，梳脊12的宽度为100 μm。梳脊12的长度可根据集成微电极的数目进行调整，梳脊12上有两个外围键合点13。

多聚物微通道层5的厚度为20~40 μm，材料选用光敏聚酰亚胺便于加工成型。多聚物微通道层5中间设置有上下未封闭的微通道10，微通道的宽度为60 μm，其两端各有一整个储样孔14，储样孔14的直径为200~500 μm。

顶层梳状微电极阵列7是在完成多聚物微通道层5的加工后，通过溅射、光刻等工艺手段在多聚物微通道层5上加工而得，顶层梳状微电极阵列层7与底层梳状微电极阵列形状和位置均对应，并在多聚物微通道层5的微通道的侧壁上形成有侧壁表面电极，侧壁表面电极分别连接底层梳状微电极阵列和顶层梳状微电极阵列对应的每一对梳齿，使底层梳状微电极阵列、侧壁表面电极和顶层梳状微电极阵列电气联通。侧壁表面电极的宽度为20 μm，高度为多聚物微通道层5的高度（20~40 μm），厚度与顶层微电极阵列6的厚度一样，为0.1~0.5 μm。顶层微电极阵列层7依然有两个键合点15。

在制作完成顶层微电极阵列7后，再次使用光敏聚酰亚胺材料在其表面制作一层保护层8，主要作用在于保护顶层微电极阵列7。

底层梳状微电极阵列4和顶层梳状微电极阵列7的电信号输出和输出端分别通过金丝采用金丝键合工艺在各自的外侧形成键合点13和15，与外界形成电气连接。

带进出样导管的盖片2由PDMS盖片16和导管17组成。PDMS盖片上设置有进样口18和出样口19，进样口和出样口的直径为500 μm，其上安装导管17.

以上高通量细胞电融合芯片1和带进出样导管的盖片2键合而成，外界电信号可直接加载于键合点13或15上（加载方式可采用键合或者直接用一夹具夹住键合点，进而加载电信号）。

实施例2：本装置的使用方法

在实验中，可使用微量泵将细胞悬浮液从实施例1中的进样口18注入芯片内部，当细胞悬浮液流经微通道10时，经键合点13或15加载正弦波电刺激信号，相对的侧壁微电极间将形成一非均匀梯度电场，微电极间的两个细胞将在介电电泳力作用下进行细胞排队。完成排队后，施加方波脉冲序列信号，完成排队的细胞对将在微电极间高强度的脉冲电场作用下完成细胞电穿孔-细胞电融合等过程。完成细胞电融合过程后，再利用微量泵注入细胞培养液，将微通道内的细胞经微通道10、储样孔14、出样口19及导管17流出，获得细胞缓冲液可利用培养皿进行收集，进行后期的培养。随后，再次使用微量泵注入细胞悬浮液，再次进行上述的电融合过程，进而实现连续的细胞电融合。

实施例3：高通量细胞电融合芯片装置的制作

采用MEMS加工工艺，其加工工艺如下：

A.  清洗石英玻璃片；

B.  将石英玻璃片置于蒸发炉中，蒸发沉积形成2000                                                

的金膜；

C.  旋涂AZ4620于金膜表面，曝光显影后形成与底层微电极阵列结  构相同的图形；

D.  将石英玻璃片先后置于金腐蚀液和HF腐蚀液中，去除多余的金膜，形成底层微电极阵列结构；

E.  丙酮去除底层微电极阵列结构表面残余的AZ4620；

F.   清洗；

G.  旋涂PI7510于石英玻璃片表面，曝光显影形成多聚物微通道层，显影后置于固化炉中固化PI7510形成微通道结构；

H.   清洗；

I.   旋涂AZ4620于石英玻璃片上，曝光显影后置于丙酮中去除多余残胶，形成于底层微电极阵列结构相同的形状结构；

J.   将石英玻璃片置于溅射炉中，溅射金属（金或铂）形成底层微电极阵列结构，由于凹槽较底层微电极阵列结构及多聚物微通道层宽，因此将在多聚物微通道的侧壁形成一层金属层，形成侧壁表面电极；

K.  完成溅射后将石英玻璃片置于丙酮中去除多余残留的PI7510胶及多余金属，形成最终的底层微电极阵列结构和侧壁表面电极结构；

L.  清洗；

M.  旋涂PI2210于石英玻璃片上，曝光显影形成多聚物顶层保护层，显影后置于固化炉中固化PI2210，仅露出侧壁表面电极、键合区和微通道区域；

N. 清洗，获得芯片。

PDMS盖片的加工通过倒模工艺实现，材料选用PDMS，加工步骤如下：

A.  利用印刷电路板制作工艺，模具结构为细胞悬浮液进样口和出样口；

B.  将模具固定于一培养皿上；

C.  倒入混合好的PDMS混合胶，静止后抽真空；

D.  置于加热台上75℃固化；

E.  揭下固化后PDMS，根据底层结构形状剪裁，并去除进样口、出样口的胶即可。

完成上述加工后，将芯片与PDMS盖片键合形成一密闭腔体，仅通过进样口和出样口进行细胞悬浮液的进出样。

Claims (3)

1.基于表面电极的高通量细胞电融合芯片装置，其由微电极阵列芯片和带进出样导管的盖片构成；其特征在于：

所述微电极阵列芯片自下而上依次分为石英基底层、多聚物微通道层和顶层保护层，所述多聚物微通道层的材料为光敏聚酰亚胺；

在所述石英基底层上制作有底层梳状微电极阵列，所述底层梳状微电极阵列在石英基底层上以梳齿相对的形式对称布置两组；

所述多聚物微通道层的中间加工有上下开敞的微通道，其位置对应于底层梳状微电极阵列两组之间的位置，微通道的两端为储样孔；

在所述多聚物微通道层上制作有与底层梳状微电极阵列形状和位置均对应的顶层梳状微电极阵列，并在微通道的侧壁上形成有侧壁表面电极，侧壁表面电极分别连接底层梳状微电极阵列和顶层梳状微电极阵列对应的每一对梳齿，使底层梳状微电极阵列、侧壁表面电极和顶层梳状微电极阵列电气联通；

所述底层梳状微电极阵列和顶层梳状微电极阵列的电信号输入和输出端分别通过金丝采用金丝键合工艺在各自的外侧形成键合点，实现与外界控制电路的电气连接；

所述带进出样导管的盖片通过表面等离子处理后键合在所述微电极阵列芯片上，其上的进出样导管分别连通微通道两端的储样孔。

2.根据权利要求1所述的基于表面电极的高通量细胞电融合芯片装置，其特征在于：所述底层梳状微电极阵列、侧壁表面电极和顶层梳状微电极阵列厚度为0.1~0.5mm。

3.根据权利要求1所述的基于表面电极的高通量细胞电融合芯片装置，其特征在于：所述多聚物微通道层的厚度为40~50mm，微通道的宽度为60~100mm。

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