CN106085845A - 基于u形凹槽微电极阵列的细胞电穿孔芯片装置及其加工方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种基于U形凹槽微电极阵列的细胞电穿孔芯片装置及其加工方法，所述的基于U形凹槽微电极阵列的细胞电穿孔芯片在芯片上集成了大量的U形凹槽微电极，使微通道内的电场聚焦在凹槽内，可实现低电压条件下的高效细胞电穿孔；集成的电极阵列，可实现大量细胞的同时穿孔。同时凹槽结构易于捕捉细胞，可通过芯片内流体的控制实现单细胞捕捉，进而完成单细胞穿孔。凹槽之间用二氧化硅+多晶硅隔离，该部分不上电，因此细胞不会在该区聚集和穿孔。铝引线层保证了芯片具有良好的电气导通性能；二氧化硅钝化层和芯片材料保证了芯片具有良好的生物相容性及抗腐蚀性能。该装置可广泛应用于细胞裂解、细胞电转染、细胞电融合等研究中。

Description

基于U形凹槽微电极阵列的细胞电穿孔芯片装置及其加工 方法

技术领域

本发明属于细胞电穿孔技术领域，涉及一种基于U形凹槽微电极阵列的细胞电穿孔芯片装置及其加工方法。

背景技术

在细胞上施加电场会在细胞膜内外形成一个电压差，即跨膜电位，当跨膜电位超过穿孔的阈值时导致细胞膜结构紊乱，在细胞膜上产生纳米孔，进而使得细胞电导率和细胞膜的通透性大大增加，这一效应通常被称为电穿孔(Electroporation)或者电通透(Electropermeabilization)。在一定范围内细胞膜穿孔后可以还原，称为可逆性电穿孔，细胞膜上这一可逆性电穿孔特性可应用于基因转染(即细胞电转染)等研究中，研究人员通过电穿孔效应在细胞膜上形成纳米级微孔，改变膜的通透性，形成外界物质进入细胞的传递通道，这一研究在近年来得到了广泛关注。除细胞电转染外，细胞可逆电穿孔效应还可应用于细胞融合研究领域。当超过一定范围纳米孔不能还原，称为不可逆性电穿孔，可用于裂解细胞等。

传统的细胞电穿孔系统通常采用大型平板电极，这种系统加工简便，容易操作，穿孔量大，但是传统的细胞电穿孔设备遇到很多问题：细胞的存活率和电穿孔效率不足，对细胞不能精确控制，导致一些细胞已经裂解，而另一些细胞未能穿孔。同时，这些装置的尺寸较大，需要较大的电压来产生足够的电场强度来使细胞完成穿孔。这样，操作过程中需要对操作人员进行特殊的保护措施，系统的成本也较高。

近年来，随着微机电系统技术和微流控技术的快速发展，推动着细胞电融合研究逐渐进入微观层面。微流控芯片上细胞电融合技术研究起源于1989年Masuda S等人所研制的一种“微通道+微电极”结合的细胞电融合芯片。2009年东京大学的Gel等人研制了基于微孔阵列的电融合芯片，使电场聚焦在微孔区域，可实现细胞接触点的有效穿孔及融合，但是该方法对微孔的定位要求很高，无法进行大规模应用，同时，该方法依然采用距离较大的平板电极实现电融合，工作电压高(M.Gel,Y.Kimura,O.Kurosawa,etal.Dielectrophoreticcell trapping and parallel one-to-one fusion based on field constrictioncreated by a micro-orifice array,Biomicrofluidics,2010)。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于U形凹槽微电极阵列的细胞电穿孔芯片装置及其加工方法，通过在SOI结构的顶层低阻硅层通过干法刻蚀形成U形凹槽微电极，两凹槽微电极之间通过二氧化硅+多晶硅隔离槽分割成离散式的凹槽微电极结构，保证了电场在凹槽内的聚焦，进而实现细胞在凹槽内的高效穿孔。本发明可以实现为动物、植物、微生物细胞的电穿孔，能够很好的应用于细胞裂解、细胞电转染、细胞电融合等研究中。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种基于U形凹槽微电极阵列的细胞电穿孔芯片装置，该装置由基于U形凹槽微电极阵列的细胞电穿孔芯片和流路控制层组成；

所述基于U形凹槽微电极阵列的细胞电穿孔芯片利用SOI(Silicon-on-Insulator)作为基底层，在硅基底层上设置有二氧化硅绝缘层，在二氧化硅绝缘层上有顶层低阻硅层，在顶层低阻硅层中形成有微通道和U形凹槽微电极，所述U形凹槽微电极包括底面和两侧壁微电极；两相邻的凹槽微电极之间采用二氧化硅或多晶硅填充形成离散式的凹槽结构；所述顶层低阻硅层上覆盖二氧化硅氧化层，二氧化硅氧化层内有接触孔；所述二氧化硅氧化层上覆盖有铝引线层，通过接触孔与凹槽微电极接通；在铝引线层上覆盖有二氧化硅钝化层并留出部分铝引线层，作为与外界电信号电气连接的键合区；

所述流路控制层由PDMS(polydimethylsiloxane)盖片和导管组成，PDMS盖片盖在细胞电穿孔芯片上，PDMS盖片上有出样口和进样口，对应于细胞电穿孔芯片的微通道的两端，连通微通道，导管安装于出样口和进样口上。

进一步，所述硅基底层的厚度为300～450μm，二氧化硅绝缘层的厚度为0.5～2μm，顶层硅层的厚度在40～50μm，所述二氧化硅氧化层厚度为0.3～2μm，铝引线层为0.5～2μm厚的金属铝，二氧化硅钝化层厚度为1～2μm。

进一步，所述顶层低阻硅层的电导率为7～9Ω/cm。

进一步，所述PDMS盖片的厚度为0.5～2mm，出样口和进样口的直径为0.3～0.5mm。

本发明还提供了一种基于U形凹槽微电极阵列的细胞电穿孔芯片装置的加工方法，包括以下步骤：

细胞电穿孔芯片的加工：

1)选取SOI晶圆，对晶圆进行清洗；

2)对顶层低阻硅层进行离子注入，使其电导率下降到7-9Ω/m；

3)ICP刻蚀形成大的“U”形槽；

4)在大的“U”形槽侧壁上高温氧化形成二氧化硅绝缘层；

5)将多晶硅填充于二氧化硅深槽中，形成隔离；

6)选用表面平整化工艺去除表面多余的多晶硅和二氧化硅直至低阻硅层；

7)在基片表面生成一层二氧化硅氧化层，以完全消耗多晶硅，彻底消除多晶硅引起的跨接短路；

8)ICP技术刻蚀形成微孔(接触孔)，用以低阻硅和铝引线层之间建立电气连接；

9)溅射铝；

10)光刻形成铝引线层；

11)等离子气相沉积在铝引线层表面形成二氧化硅钝化层；

12)干法刻蚀二氧化硅去除微通道及键合区表面的二氧化硅钝化层；

13)干法刻蚀顶层低阻硅层形成微通道及U形凹槽微电极阵列；

流路控制盖片选用PDMS，通过倒模工艺实现；

完成上述加工后，将细胞电穿孔芯片和顶层流路控制层通过键合形成一密闭流路，仅通过进样口和出样口进行细胞悬浮液的进出样。

进一步，所述流路控制盖片选用PDMS，通过倒模工艺实现的步骤具体包括：

1)利用印刷电路板制作工艺，模具结构为细胞悬浮液进样口和出样口；

2)将模具固定于一培养皿上；

3)倒入混合好的PDMS混合胶(10：1)，静止后抽真空；

4)置于加热台上75℃固化一小时；

5)揭下固化后PDMS，根据底层结构形状剪裁，用打孔器打孔形成进样口、出样口。

本发明的有益效果在于：本装置形成的U形凹槽微电极阵列结构使微通道内的电场聚焦在凹槽内，可实现低电压条件下的高效细胞电穿孔；集成的电极阵列，可实现大量细胞的同时穿孔；同时凹槽结构易于捕捉细胞，可通过芯片内流体的控制实现单细胞捕捉，进而完成单细胞穿孔；凹槽之间用二氧化硅+多晶硅隔离，该部分不上电，因此细胞不会在该区聚集和穿孔；铝引线层保证了芯片具有良好的电气导通性能；二氧化硅钝化层和芯片材料保证了芯片具有良好的生物相容性及抗腐蚀性能。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为基于U形凹槽微电极阵列的细胞电穿孔芯片装置总体示意图；

图2为基于U形凹槽微电极阵列的细胞电穿孔芯片装置两主要功能模块示意图；

图3为基于U形凹槽微电极阵列的细胞电穿孔芯片组装示意图；

图4为基于U形凹槽微电极结构示意图。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。

如图1至图4所示，基于U形凹槽微电极阵列的细胞电穿孔芯片装置由基于U形凹槽微电极阵列的细胞电融合芯片1和流路控制层2组成。

基于U形凹槽微电极阵列的细胞电融合芯片1自下而上依次有硅基底层3、二氧化硅绝缘层4、顶层低阻硅层5(包括U形凹槽微电极阵列、隔离槽、微通道)、二氧化硅氧化层6、铝引线层7、二氧化硅钝化层8。

硅基底层3选用SOI晶圆，直径为3～4″，厚度为300～450μm，为芯片提供机械支撑。

二氧化硅绝缘层4的厚度为0.5～2μm，其功能在于提供良好的电气绝缘性能。

顶层低阻硅层5通过离子注入处理提高其电导率，其电导率降至7～9Ω/cm的水平，厚度为40～50μm。通过干法刻蚀工艺在顶层低阻硅层5刻蚀形成深至二氧化硅绝缘层4的宽度为2～3μm大U形槽，结合高温氧化工艺在深槽表面形成一层厚度为0.2～1μm的二氧化硅绝缘槽11，随后再使用多晶硅12填充二氧化硅绝缘槽11，再借助表面平整化工艺去除多余的多晶硅12和二氧化硅11直至低阻硅层，进而形成所需要的隔离槽。隔离槽与微通道之间的低阻硅13因被二氧化硅、多晶硅与凹槽微电极阵列隔离，因此在通电工作时无电压，不会在此区域形成梯度电场。两隔离槽之间通过干法刻蚀形成U形凹槽微电极，其长度、宽度均为20μm，因其基体材料为低阻硅，厚度为40～50μm。

为了避免少量多晶硅的残留，采用高温氧化工艺在顶层低阻硅层5表面生成一层厚度为300nm的SiO₂氧化层，以完全消耗多晶硅，彻底消除多晶硅引起的跨接短路；由于采用氧化工艺生成SiO₂氧化层表面平整度较差，采用ICP工艺去除该氧化层，并采用等离子化学气相沉积在基片表面构建一层厚度为300nm的二氧化硅氧化层6。采用ICP工艺在铝引线层对应的区域刻蚀形成小于引线尺度的接触孔(铝引线的宽度为50μm，接触孔的边长为25μm)，以在铝线层7和低阻硅层5之间建立电气连接；同时，在键合点对应的区域也应开出接触窗。溅射一层厚度为0.5～2μm厚的金属铝，并通过光刻形成铝引线层7；在铝引线层7的表面通过PECVD工艺形成了一层厚度为2～3μm的二氧化硅钝化层8，以保护铝引线层7在通电工作条件下不被腐蚀；二氧化硅钝化层8和铝引线层7之间形成的窗为外围信号的键合/连接区14，可采用金丝键合工艺与外界电信号形成电气连接，进而引入电信号。

流路控制层2由PDMS盖片9和导管10组成，PDMS盖片9上集成了进样口15和出样口16，分别连接导管10。

基于U形凹槽微电极阵列的细胞电穿孔芯片装置由基于U形凹槽微电极阵列的细胞电穿孔芯片1和顶层流路控制层2通过键合实现形成一密闭流路，仅通过进样口15和出样口16进行细胞悬浮液的进出样。

实验时，连接注射泵将细胞悬浮液从进样口15注入芯片内部，当细胞悬浮液流经微通道17时，经键合/连接区14加载正弦交流信号，相对的U形凹槽微电极18间将形成一非均匀梯度电场，微通道17内的细胞将在正向介电电泳力作用下进入凹槽内。此时，可能会出现两两排队的情形。随后，减小外界正弦信号强度，使得作用于细胞上的介电电泳力减小，此时向微通道内注入缓冲液。由于在凹槽电极内的细胞受到的介电电泳力更强，而且可以有凹槽结构的保护，不会冲刷走。这时，将会在绝大多数的凹槽微电极内只吸附一个细胞。完成吸附以后，施加高强度的方波脉冲信号，凹槽内的细胞将在U形凹槽微电极18间高强度的脉冲电场作用下完成细胞电穿孔。

在本实施例中，基于U形凹槽微电极阵列的细胞电穿孔芯片，其加工工艺流程为：

1)选取SOI晶圆，对晶圆进行清洗；

2)对顶层低阻硅层进行离子注入，使其电导率下降到7-9Ω/m；

3)ICP刻蚀形成大的“U”形槽；

4)在大的“U”形槽侧壁上高温氧化形成二氧化硅绝缘层；

5)将多晶硅填充于二氧化硅深槽中，形成隔离；

6)选用表面平整化工艺去除表面多余的多晶硅和二氧化硅直至低阻硅层；

7)在基片表面生成一层二氧化硅氧化层，以完全消耗多晶硅，彻底消除多晶硅引起的跨接短路；

8)ICP技术刻蚀形成微孔(接触孔)，用以低阻硅和铝引线层之间建立电气连接；

9)溅射铝；

10)光刻形成铝引线层；

11)等离子气相沉积在铝引线层表面形成二氧化硅钝化层；

12)干法刻蚀二氧化硅去除微通道及键合区表面的二氧化硅钝化层；

13)干法刻蚀顶层低阻硅层形成微通道及U形凹槽微电极阵列。

PDMS盖片的加工步骤如下：

1)利用印刷电路板制作工艺，模具结构为细胞悬浮液进样口和出样口；

2)将模具固定于一培养皿上；

3)倒入混合好的PDMS混合胶(10：1)，静止后抽真空；

4)置于加热台上75℃固化一小时；

5)揭下固化后PDMS，根据底层结构形状剪裁，用打孔器打孔形成进样口、出样口。

完成上述加工后，基于U形凹槽微电极阵列的细胞电穿孔芯片装置由基于U形凹槽微电极阵列的细胞电穿孔芯片和顶层流路控制层通过键合实现一密闭流路，将导管插入进样口和出样口用于细胞悬浮液的进出样。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (6)

1.一种基于U形凹槽微电极阵列的细胞电穿孔芯片装置，其特征在于：该装置由基于U形凹槽微电极阵列的细胞电穿孔芯片和流路控制层组成；

所述基于U形凹槽微电极阵列的细胞电穿孔芯片利用SOI(Silicon-on-Insulator)作为基底层，在硅基底层上设置有二氧化硅绝缘层，在二氧化硅绝缘层上有顶层低阻硅层，在顶层低阻硅层中形成有微通道和U形凹槽微电极，所述U形凹槽微电极包括底面和两侧壁微电极；两相邻的凹槽微电极之间采用二氧化硅或多晶硅填充形成离散式的凹槽结构；所述顶层低阻硅层上覆盖二氧化硅氧化层，二氧化硅氧化层内有接触孔；所述二氧化硅氧化层上覆盖有铝引线层，通过接触孔与凹槽微电极接通；在铝引线层上覆盖有二氧化硅钝化层并留出部分铝引线层，作为与外界电信号电气连接的键合区；

所述流路控制层由PDMS(polydimethylsiloxane)盖片和导管组成，PDMS盖片盖在细胞电穿孔芯片上，PDMS盖片上有出样口和进样口，对应于细胞电穿孔芯片的微通道的两端，连通微通道，导管安装于出样口和进样口上。

2.根据权利要求1所述的一种基于U形凹槽微电极阵列的细胞电穿孔芯片装置，其特征在于：所述硅基底层的厚度为300～450μm，二氧化硅绝缘层的厚度为0.5～2μm，顶层硅层的厚度在40～50μm，所述二氧化硅氧化层厚度为0.3～2μm，铝引线层为0.5～2μm厚的金属铝，二氧化硅钝化层厚度为1～2μm。

3.根据权利要求1所述的一种基于U形凹槽微电极阵列的细胞电穿孔芯片装置，其特征在于：所述顶层低阻硅层的电导率为7～9Ω/cm。

4.根据权利要求1所述的一种基于U形凹槽微电极阵列的细胞电穿孔芯片装置，其特征在于：所述PDMS盖片的厚度为0.5～2mm，出样口和进样口的直径为0.3～0.5mm。

5.制备如权利要求1至4中任一项所述的基于U形凹槽微电极阵列的细胞电穿孔芯片装置的加工方法，其特征在于：包括以下步骤：

细胞电穿孔芯片的加工：

1)选取SOI晶圆，对晶圆进行清洗；

2)对顶层低阻硅层进行离子注入，使其电导率下降到7-9Ω/m；

3)ICP刻蚀形成大的“U”形槽；

4)在大的“U”形槽侧壁上高温氧化形成二氧化硅绝缘层；

5)将多晶硅填充于二氧化硅深槽中，形成隔离；

6)选用表面平整化工艺去除表面多余的多晶硅和二氧化硅直至低阻硅层；

7)在基片表面生成一层二氧化硅氧化层，以完全消耗多晶硅，彻底消除多晶硅引起的跨接短路；

8)ICP技术刻蚀形成微孔(接触孔)，用以低阻硅和铝引线层之间建立电气连接；

9)溅射铝；

10)光刻形成铝引线层；

11)等离子气相沉积在铝引线层表面形成二氧化硅钝化层；

12)干法刻蚀二氧化硅去除微通道及键合区表面的二氧化硅钝化层；

13)干法刻蚀顶层低阻硅层形成微通道及U形凹槽微电极阵列；

流路控制盖片选用PDMS，通过倒模工艺实现；

完成上述加工后，将细胞电穿孔芯片和顶层流路控制层通过键合形成一密闭流路，仅通过进样口和出样口进行细胞悬浮液的进出样。

6.根据权利要求5所述的基于U形凹槽微电极阵列的细胞电穿孔芯片装置的加工方法，其特征在于：所述流路控制盖片选用PDMS，通过倒模工艺实现的步骤具体包括：

1)利用印刷电路板制作工艺，模具结构为细胞悬浮液进样口和出样口；

2)将模具固定于一培养皿上；

3)倒入混合好的PDMS混合胶(10：1)，静止后抽真空；

4)置于加热台上75℃固化一小时；

5)揭下固化后PDMS，根据底层结构形状剪裁，用打孔器打孔形成进样口、出样口。