CN103820311B - 用于单分子测序的纳米孔装置及其使用方法、制作方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于单分子测序的纳米孔装置及其使用方法、制作方法，应用于单分子测序装置中，所述单分子测序装置包括正负电解池，所述纳米孔装置用于分隔所述正负电解池。本发明将固态纳米孔和石墨烯纳米孔结构相结合形成三明治结构，一方面由于三明治结构中固态酒杯形沟槽的存在，可以延伸石墨烯纳米孔的直径，保证生物分子在较低的电压下仍然可以有较高的被捕获率，这样可以通过降低电压对单分子通过石墨烯纳米孔的过程进行速度控制，解决当前纳米孔单分子测序的过程中生物分子穿孔过快的问题，提高单分子通孔过程中的时间分辨率，另一方面该装置最终进行检测的是石墨烯纳米孔，保证单分子检测具有好的分辨效果。

Description

用于单分子测序的纳米孔装置及其使用方法、制作方法

技术领域

本发明涉及一种用于单分子测序的纳米孔装置及其使用方法、制作方法。

背景技术

DNA是自然界中所有生命的蓝图，它包含的遗传信息是构建细胞内其它化合物，如RNA编码和蛋白质形成所必须，并影响着所有细胞的活性。DNA是由两条核苷酸以互补配对原则所构成的双螺旋结构的分子化合物，每个核苷酸包含一个糖-磷酸骨架和一个碱基。碱基共有四种，分别是腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和鸟嘌呤，这4种碱基排列的顺序决定了一个有机体所有特征的遗传信息。检测DNA中碱基的排列顺序对生命科学的研究、人类的健康和医药卫生事业都起着越来越重要的作用，作为第三代测序技术的典型代表，纳米孔单分子检测技术有望实现可靠、快速、低廉的检测。

利用纳米孔进行DNA等生物单分子测序时包括两个过程：分子被纳米孔捕获，以及生物分子在外场的驱动下通过纳米孔。其中单分子在外场的作用下被捕获进孔的过程决定了纳米孔的检测通量，单分子通过纳米孔的时间决定了检测在时间上的分辨率。WanunuM.等在ElectrostaticfocusingofunlabeledDNAintonanoscaleporesusingasaltgradient.NatNanotechnol2010(5):160-165一文中描述了DNA分子在溶液池中被捕获的过程，他们指出DNA分子开始在溶液中随机扩散，直至进入一个由临界半径r*所定义的半球内时由电学力将其向纳米孔聚集，随后DNA分子进入并通过纳米孔，该临界半径定义如公式（1）所示：

$r^{*}\text{=}\frac{d^2\mathrm{\μ}}{8\mathrm{lD}}\mathrm{\ΔV}---\left(1\right)$

其中，d是纳米孔的直径，l为纳米孔的深度，D为扩散常数，μ为DNA分子的电泳迁移率，ΔV为外加的电势差。

从式中可以看出，在纳米孔参数一定的情况下，要保证DNA分子的捕获率，施加的外在电压必须要足够的大，文中分析出了DNA捕获率随施加电压增加而增大的结论，其他报道中也证实了低电压下单分子不能被捕获的事实。但是，施加电压增大的情况下，单分子通过纳米孔的时间大大减少，目前应用纳米孔进行单分子检测一个最大的问题就是单分子通过纳米孔速率过快，检测数据在时间上的分辨率不可靠，因此要保证单分子以较慢的速率通过纳米孔，必须尽可能的降低施加的电压，而要保证单分子以较高的概率被纳米孔捕获，又必须要有一个大的外在电压。通过分析式（1）可以发现，当增加纳米孔的直径d时，可以增加纳米孔在低电压下捕获单分子的概率，但只有当纳米孔的直径和单分子直径相当时，单分子才能有较好的分辨效果。当前针对单分子通孔速率过快的问题，主要采取的方法是：一方面采用较大的电压保证单分子的捕获率，另一方面对纳米孔进行化学或生物修饰，修饰后的纳米孔会进一步控制单分子运动的速率，但修饰纳米孔的方法操作困难，而且容易对单分子的检测效果产生影响。如何在保证单分子有较高的捕获率的情况下，降低单分子通孔的速率，是纳米孔用于DNA等单分子测序需要解决的关键问题。

发明内容

本发明提供了一种用于单分子测序的纳米孔装置，一方面降低单分子通孔的速率，另一方面保证纳米孔对单分子的捕获率。

为了解决上述技术难题，本发明提供了一种用于单分子测序的纳米孔装置，应用于单分子测序装置中，所述单分子测序装置包括正负电解池，所述纳米孔装置用于分隔所述正负电解池，所述纳米孔装置包括：

包括半导体硅片11和40，位于硅片11下端面的掩膜衬底12和位于硅片11上端面的第一绝缘层13，掩膜衬底12上刻蚀有窗口14，半导体硅片11上刻蚀有与窗口14连通的锥形空腔15，第一绝缘层13上刻蚀有连通锥形空腔15上底面的固态纳米孔16，在固态纳米孔16上覆盖着石墨烯17，在石墨烯17中央刻蚀有石墨烯纳米孔18，半导体硅片40上端面有掩膜衬底41，掩膜衬底41上刻蚀有窗口42，半导体硅片40刻蚀有与掩膜衬底41连通的酒杯形沟槽43，半导体硅片40下端面覆盖有第二绝缘层44，第二绝缘层44上刻蚀有连通酒杯形沟槽43的纳米孔45，掩膜衬底41、半导体硅片40和第二绝缘层44覆盖在石墨烯17上表面。

优选的，所述半导体沟槽43、石墨烯纳米孔18与半导体空腔15同轴。

优选的，第一绝缘层13和/或第二绝缘层44为氧化硅、氮化硅或碳化硅中的一种。

优选的，掩膜衬底12和/或掩膜衬底41为氧化硅或金属涂层。

优选的，酒杯形沟槽43大端直径为1-3μm，石墨烯上端固态纳米孔45的直径为300-500nm，石墨烯下端固态纳米孔16直径为100-300nm。

优选的，所述的石墨烯17为单层石墨烯，石墨烯纳米孔18的直径为1.5nm-10nm。

本发明还提供了一种上述任一项所述的纳米孔装置的使用方法，其特征在于：

提供正负电解池；

将所述纳米孔装置置于正负电解池的正负连接处；

向电解池中加入含有单分子的电解液；

分别将正负电极插入到电解液；

调节施加到正负电极两端的电压进行电解。

优选的，该方法还包括：

根据当前电解池内电解液的高度差调节纳米孔两端的压强差。

优选的，所述电解液为NaCl或者KCl，电解液浓度为0.1-4mol/L，PH值为8。

本发明还提供了一种上述任一项所述的纳米孔装置的制作方法，包括：

步骤1：在半导体硅片11上端面制作第一绝缘层13，半导体硅片11的下端面制备掩膜衬底12；

步骤2：采用光刻技术在掩膜衬底12上制作窗口14；

步骤3：利用步骤2中得到的窗口14，在碱性溶液中对硅片11的下端面进行湿法刻蚀，去除部分硅片，得到锥形的刻蚀空腔15，并形成了悬空在锥形空腔15上底的第一绝缘层13；

步骤4：利用聚焦离子束刻蚀法在悬空的第一绝缘层13上制备纳米通孔16；

步骤5：在半导体硅片40上端面制作掩膜衬底41，下端面制作第二绝缘层44；

步骤6：采用光刻技术在掩膜衬底41上制作窗口42；

步骤7：采用湿法刻蚀的方法在硅片40上刻蚀酒杯形沟槽43;

步骤8：采用离子束刻蚀方法在第二绝缘层44上刻蚀纳米通孔45；

步骤9：将单层石墨烯17转移到第一绝缘层13表面，使石墨烯薄片17完全覆盖整个第一绝缘层上的纳米孔16，且使纳米孔16处于石墨烯17中央；

步骤10：采用透射电子显微镜加工石墨烯17，得到位于固态纳米孔16上的石墨烯纳米孔18，形成悬空在固态通孔16上面的石墨烯纳米孔；

步骤11：将步骤8得到的硅片40、酒杯形沟槽43、第二绝缘层44、固态纳米孔45转移至被支撑的石墨烯纳米孔18表面，保证酒杯形沟槽43、纳米通孔45、石墨烯纳米孔18、固态纳米孔16和锥形空腔15同轴。

本发明和现有技术相比，具有以下优点：

（1）将固态纳米孔和石墨烯纳米孔结构相结合形成三明治结构，固态纳米孔可以克服生物分子纳米孔的结构不可控和不稳定性，单层石墨烯纳米孔由于超薄的厚度可以对DNA单个碱基序列进行测序。最为重要的是，该三明治结构中一方面由于固态酒杯形沟槽的存在，可以延伸石墨烯纳米孔的直径，保证生物分子在较低的电压下仍然可以有较高的被捕获率，这样可以通过降低电压对单分子通过石墨烯纳米孔的过程进行速度控制，解决当前纳米孔单分子测序的过程中生物分子穿孔过快的问题，提高单分子通孔过程中的时间分辨率，另一方面该装置最终进行检测的是同单分子直径相近的石墨烯纳米孔，保证单分子检测具有好的分辨效果；

（2）该装置有被纳米孔分隔的两个电解池，可以通过调节电解池中电解液的高度差来控制三明治纳米孔两端的压强，从而可以很方便地引入第二控制因素压强对生物分子通孔的速率进行进一步控制，结合三明治结构这一控制因素，可以在低电压下进一步保证数据分析的信噪比；

（3）该装置制作方法基于当前比较成熟的湿法刻蚀和离子束、电子束干法刻蚀，石墨烯纳米孔的加工以及固态纳米孔的加工方法已经比较可靠，与文献中提到的对纳米孔进行修饰从而降低单分子穿孔的速率相比，该方法简单易行；

（4）该装置由于酒杯形沟槽的存在，结合电解池电解液高度差这一控制因素，可以捕获长度更短的单分子进入石墨烯纳米孔，从而扩展了纳米孔对单分子的检测范围，促进纳米孔在单分子测序方面的进一步发展。

附图说明

图1为本发明实施例提供的用于单分子测序的纳米孔装置的结构示意图；

图2为本发明实施例提供的用于单分子测序的纳米孔装置的使用方法的流程示意图；

图3表示本发明实施例提供的用于单分子测序的纳米孔装置的制作方法的示意图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。

本发明实施例提供了一种用于单分子测序的纳米孔装置，应用于单分子测序装置中，如图1所示，所述单分子测序装置包括正负电解池2，电解池2中装有电解液3，电解液3中分别接有电极4，电极4连接电源5和电流表6组成电源施加和电流检测回路，纳米孔装置1用于分隔正负电解池2：

纳米孔装置1包括半导体硅片11和40，位于硅片11下端面的掩膜衬底12和位于硅片11上端面的第一绝缘层13，上述的掩膜衬底12上刻蚀有窗口14，上述半导体硅片11上刻蚀有与窗口14连通的锥形空腔15，上述第一绝缘层13上刻蚀有连通锥形空腔15上底面的固态纳米孔16，在固态纳米孔16上覆盖着石墨烯17，在石墨烯17中央刻蚀有石墨烯纳米孔18，上述半导体硅片40上端面有掩膜衬底41，掩膜衬底41上刻蚀有窗口42，上述半导体硅片40刻蚀有与掩膜衬底41连通的酒杯形沟槽43，上述半导体硅片40下端面覆盖有第二绝缘层44，第二绝缘层44上刻蚀有连通酒杯形沟槽43的纳米孔45，上述掩膜衬底41、半导体硅片40和第二绝缘层44覆盖在石墨烯17上表面。

本发明中，将固态纳米孔和石墨烯纳米孔结构相结合形成三明治结构，固态纳米孔可以克服生物分子纳米孔的结构不可控和不稳定性，单层石墨烯纳米孔由于超薄的厚度可以对DNA单个碱基序列进行测序。最为重要的是，该三明治结构中一方面由于固态酒杯形沟槽的存在，可以延伸石墨烯纳米孔的直径，保证生物分子在较低的电压下仍然可以有较高的被捕获率，这样可以通过降低电压对单分子通过石墨烯纳米孔的过程进行速度控制，解决当前纳米孔单分子测序的研究中生物分子穿孔过快的问题，提高单分子通孔过程中的时间分辨率，另一方面该装置最终进行检测的是同单分子直径相近的石墨烯纳米孔，保证单分子检测具有好的分辨效果；

优选的，保证半导体沟槽43、石墨烯纳米孔18与半导体空腔15同轴。

这样能够使得生物单分子顺利通过纳米孔。

优选的，所述的生物单分子包括DNA、RNA分子以及蛋白质分子。

优选的，第一绝缘层13和/或第二绝缘层44可以为氧化硅、氮化硅或碳化硅中的一种。

优选的，掩膜衬底12和/或掩膜衬底41为氧化硅或金属涂层。

优选的，酒杯形沟槽43大端直径为1-3μm，石墨烯上端固态纳米孔45的直径为300-500nm，石墨烯下端固态纳米孔16直径为100-300nm。

本申请发明人经过大量的实验和统计发现，将上述的各个结构设置成上述参数，能够取得最好的通过率，获得最好的捕获效果。

优选的，所述的石墨烯17为单层石墨烯，石墨烯纳米孔18的直径为1.5nm-10nm。

本发明还提供了一种任一项所述的纳米孔装置的使用方法，如图2所示，包括：

步骤201，提供正负电解池2；

步骤202，将纳米孔装置1置于正负电解池2的正负连接处；

步骤203，向电解池2中加入含有单分子的电解液3；

步骤204，分别将正负电极4插入到电解液3；

步骤205，调节施加到正负电极两端的电压进行电解。

优选的，该方法还包括：

根据当前电解池2内电解液3的高度差调节纳米孔两端的压强差。

这样由于通过调节电解池中电解液的高度差来控制三明治纳米孔两端的压强，从而可以很方便地引入第二控制因素压强对生物分子通孔的速率进行进一步控制，结合三明治结构这一控制因素，可以在低电压下进一步保证数据分析的信噪比。

优选的，电解液3为NaCl或者KCl，电解液浓度为0.1-4mol/L，PH值为8。当然实际应用中，本领域技术人员也可以采用其他的电解液，并调节相应的浓度和PH范围，本发明优选的实施方式不能理解为本申请保护范围的限定。

优选的，电流测量装置6在数值上分辨率应为皮安级，在时间上分辨率应为微秒级，电压施加装置5施加范围在0.01V-1V。

上述用于单分子测序的三明治结构，其制作步骤如下：

步骤301：在半导体硅片11上端面制作第一绝缘层13，半导体硅片11的下端面制备掩膜衬底12；经步骤301后，得到的结构如图3a所示；

步骤302：采用光刻技术在掩膜衬底12上制作出直径为1-3μm的窗口14；经步骤302后，得到的结构如图3b所示；

步骤303：利用步骤2中得到的窗口14，在碱性溶液中对硅片11的下端面进行湿法刻蚀，去除部分硅片，得到锥形的刻蚀空腔15，锥形空腔15的下底直径同窗口14直径相同，锥形空腔15的上底直径为100-300nm，并形成了悬空在锥形空腔15上底的第一绝缘层13；

经步骤303后，得到的结构如图3c所示；

步骤304：利用聚焦离子束（FocusedIonBeam,FIB）刻蚀的方法在悬空的第一绝缘层3上制备出直径为100-300nm的纳米通孔16；

经步骤304后，得到的结构如图3d所示；

步骤305：在半导体硅片40上端面制作掩膜衬底41，下端面制作第二绝缘层44；

经步骤305后，得到的结构如图3e所示；

步骤306：采用光刻技术在掩膜衬底41上制作直径为1-3μm窗口42；

经步骤306后，得到的结构如图3f所示；

步骤307：采用湿法刻蚀的方法在硅片40上刻蚀酒杯形沟槽43，沟槽下底直径为300-500nm；

经步骤307后，得到的结构如图3g所示；

步骤308：采用离子束刻蚀方法在第二绝缘层44上刻蚀直径为300-500nm的纳米通孔45；

经步骤308后，得到的结构如图3h所示；

步骤309：将化学气相沉积（Chemicalvapordeposition,CVD）方法制备得到的单层石墨烯17转移到第一绝缘层13表面，保证石墨烯薄片17完全覆盖整个第一绝缘层上的纳米孔16，尽可能使纳米孔16处于石墨烯17中央；

经步骤309后，得到的结构如图3i所示；

步骤310：采用透射电子显微镜（Transmissionelectronmicroscope，TEM）加工石墨烯17，得到位于固态纳米孔16上的石墨烯纳米孔18，石墨烯纳米孔18的直径在1.5-10nm，形成悬空在固态通孔16上面的石墨烯纳米孔；

经步骤310后，得到的结构如图3j所示；

步骤311：将步骤308得到的硅片40、酒杯形沟槽43、第二绝缘层44、固态纳米孔45转移至被支撑的石墨烯纳米孔18表面，保证酒杯形沟槽43、纳米通孔45、石墨烯纳米孔18、固态纳米孔16和锥形空腔15同轴。

经步骤311后，本发明提供的纳米孔装置制作完成，得到的结构如图3k所示。

在步骤311之后，还可以采用如下步骤制作电解池：

步骤312：采用3D打印的方法加工电解池2，将上述得到的三明治结构1用高分子包被，并用其将电解池隔开，形成三明治纳米孔连接的电解池；

步骤313：将电解液3加入电解池中，电解池中分别接有电极4，电极4连接电源5、电流检测设备6形成回路，最后得到固态酒杯形沟槽-石墨烯纳米孔-固态锥形空腔的三明治装置，该装置可以用于生物单分子的检测。

该装置制作方法基于当前比较成熟的湿法刻蚀和离子束、电子束干法刻蚀，石墨烯纳米孔的加工以及固态纳米孔的加工方法已经比较可靠，与文献中提到的对纳米孔进行修饰从而降低单分子穿孔的速率相比，该方法简单易行。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种用于单分子测序的纳米孔装置，其特征在于，应用于单分子测序装置中，所述单分子测序装置包括正负电解池，所述纳米孔装置用于分隔所述正负电解池，所述纳米孔装置包括：

包括半导体硅片(11，40)，位于硅片(11)下端面的掩膜衬底(12)和位于硅片(11)上端面的第一绝缘层(13)，掩膜衬底(12)上刻蚀有窗口(14)，半导体硅片(11)上刻蚀有与窗口(14)连通的锥形空腔(15)，第一绝缘层(13)上刻蚀有连通锥形空腔(15)上底面的固态纳米孔(16)，在固态纳米孔(16)上覆盖着石墨烯(17)，在石墨烯(17)中央刻蚀有石墨烯纳米孔(18)，半导体硅片(40)上端面有掩膜衬底(41)，掩膜衬底(41)上刻蚀有窗口(42)，半导体硅片(40)刻蚀有与掩膜衬底(41)连通的酒杯形沟槽(43)，半导体硅片(40)下端面覆盖有第二绝缘层(44)，第二绝缘层(44)上刻蚀有连通酒杯形沟槽(43)的纳米孔(45)，掩膜衬底(41)、半导体硅片(40)和第二绝缘层(44)覆盖在石墨烯(17)上表面。

2.如权利要求1所述的纳米孔装置，其特征在于，

所述半导体沟槽(43)、石墨烯纳米孔(18)与半导体空腔(15)同轴。

3.如权利要求1所述的纳米孔装置，其特征在于，

第一绝缘层(13)和/或第二绝缘层(44)为氧化硅、氮化硅或碳化硅中的一种。

4.如权利要求1所述的纳米孔装置，其特征在于，

掩膜衬底(12)和/或掩膜衬底(41)为氧化硅或金属涂层。

5.如权利要求1所述的纳米孔装置，其特征在于，

酒杯形沟槽(43)大端直径为1-3μm，石墨烯上端固态纳米孔(45)的直径为300-500nm，石墨烯下端固态纳米孔(16)直径为100-300nm。

6.如权利要求1所述的纳米孔装置，其特征在于，

所述的石墨烯(17)为单层石墨烯，石墨烯纳米孔(18)的直径为1.5nm-10nm。

7.如权利要求1-6任一项所述的纳米孔装置的使用方法，其特征在于：

提供正负电解池；

将所述纳米孔装置置于正负电解池的正负连接处；

向电解池中加入含有单分子的电解液；

分别将正负电极插入到电解液；

调节施加到正负电极两端的电压进行电解。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，还包括：

根据当前电解池内电解液的高度差调节纳米孔两端的压强差。

9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，

所述电解液为NaCl电解液或者KCl电解液，电解液浓度为0.1-4mol/L，PH值为8。

10.一种制作如权利要求1-6任一项所述的纳米孔装置的方法，其特征在于，包括：

步骤1：在半导体硅片(11)上端面制作第一绝缘层(13)，半导体硅片(11)的下端面制备掩膜衬底(12)；

步骤2：采用光刻技术在掩膜衬底(12)上制作窗口(14)；

步骤3：利用步骤2中得到的窗口(14)，在碱性溶液中对硅片(11)的下端面进行湿法刻蚀，去除部分硅片，得到锥形的刻蚀空腔(15)，并形成了悬空在锥形空腔(15)上底的第一绝缘层(13)；

步骤4：利用聚焦离子束刻蚀法在悬空的第一绝缘层(13)上制备纳米通孔(16)；

步骤5：在半导体硅片(40)上端面制作掩膜衬底(41)，下端面制作第二绝缘层(44)；

步骤6：采用光刻技术在掩膜衬底(41)上制作窗口(42)；

步骤7：采用湿法刻蚀的方法在硅片(40)上刻蚀酒杯形沟槽(43)；

步骤8：采用离子束刻蚀方法在第二绝缘层(44)上刻蚀纳米通孔(45；

步骤9：将单层石墨烯(17)转移到第一绝缘层(13)表面，使石墨烯薄片(17)完全覆盖整个第一绝缘层上的纳米孔(16)，且使纳米孔(16)处于石墨烯(17)中央；

步骤10：采用透射电子显微镜加工石墨烯(17)，得到位于固态纳米孔(16)上的石墨烯纳米孔(18)，形成悬空在固态通孔(16)上面的石墨烯纳米孔；

步骤11：将步骤8得到的硅片(40)、酒杯形沟槽(43)、第二绝缘层(44)、固态纳米孔(45)转移至被支撑的石墨烯纳米孔(18)表面，保证酒杯形沟槽(43)、纳米通孔(45)、石墨烯纳米孔(18)、固态纳米孔(16)和锥形空腔(15)同轴。