CN101693875B - 基于柱状微电极阵列的细胞电融合芯片装置及电融合方法 - Google Patents

Abstract

本发明提出基于柱状微电极阵列的细胞电融合芯片装置，由柱状微电极阵列芯片、印制电路板和流路控制模块组成。柱状微电极阵列芯片从下至上依次为石英基底层、金属导线层、多聚物绝缘层和柱状微电极层组成；柱状微电极阵列芯片的金属导线层通过键合的方式与外围印制电路板形成电连接，将外界电信号引入到柱状微电极上，使相邻的柱状微电极间形成足够强度的梯度电场；流路控制模块覆盖在所述柱状微电极阵列芯片之上。本发明通过在柱状微电极上加载电信号，控制细胞间的排队与融合，同时，利用柱状微电极阵列有利细胞在腔道内流动的优势，实现细胞的连续流融合，结合阵列化柱状微电极的设计，实现细胞在装置内部连续、高效、高通量的融合。

Description

基于柱状微电极阵列的细胞电融合芯片装置及电融合方法

技术领域

本发明涉及生物细胞电融合的装置。具体地，本发明涉及提供细胞电融合的芯片，提供并产生细胞排队、电致穿孔、融合所需要的电场强度和电场梯度。本发明专利涉及细胞电融合中细胞的精确控制、细胞的高效融合，适用于遗传学、动植物远缘杂交育种、发育生物学、药物筛选、单克隆抗体制备、哺乳动物克隆等领域。

背景技术

细胞电融合技术自上世纪80年代起，因为其效率较高、操作简便、对细胞无毒害，便于观察，适于仪器应用和规范操作等优点，得到了快速的发展和广泛的应用。

细胞电融合可以分为两个阶段：细胞排队和细胞融合。

细胞排队的原理在于：生物细胞处于非均匀电场中时，被电场激化形成偶极子，该偶极子在非均匀电场作用力下发生运动，即介电电泳(dielectrophoresis)，利用电介质电泳可以控制细胞的运动，在细胞电融合过程中，利用电介质电泳现象使细胞排列成串，压紧相互接触的细胞，完成细胞电融合过程所需的排队和融合后压紧。

细胞融合的原理在于：细胞在强电场作用下，会导致细胞膜穿孔，这种效应称为细胞膜电致穿孔效应(electroporation)。在细胞电融合过程中利用电致穿孔效应，使两接触的细胞膜穿孔，细胞间进行膜内物质交换，使细胞质、膜融合，在一定强度的电场作用下的电穿孔是一种可逆穿孔，细胞膜会在减小或撤销电场强度时回复原状，致使细胞电融合过程的膜融合。

传统的细胞电融合系统通常都是适用大型的融合槽，其优点在于：(1)操作较为简便，采用大型的融合槽降低了包括样品的进样与出样等步骤的难度；(2)加工简便，大型融合槽的尺寸一般都在厘米量级，利用传统的机械加工手段可以较为方便的加工出所需要的融合槽结构；(3)融合量大，传统的融合槽以此可以容纳数毫升的样品，一次实验即可获得足够的细胞进行后期的筛选、培养等工作。

但传统的细胞电融合设备也存在一些缺点：(1)由于融合槽的中的电极间距较大，要达到够强度的细胞排队、融合及压紧信号，需要很高的外界驱动电压，往往高达几百上千伏，对系统的电气安全性要求高，系统的成本也因此而大为提高；(2)电极间较大间距不利于对细胞的精确控制等。

为解决这一问题，研究者将细胞电融合技术与MEMS加工技术相结合，MEMS技术的加工范围通常在1～50μm，这与细胞的直径范围相仿，二者技术的结合具有良好的切入点。有多家研究机构开始研究利用微流控芯片技术或者微电极阵列技术构建生物芯片，进行细胞电融合的研究。

如美国麻省理工大学的研究人员提出了利用微流控芯片技术在实现对细胞的精确控制，达到高效的细胞配对和融合；国内赵志强等研究人员也提出了利用MEMS技术构建微电极阵列，通过构建微米量级间距的微电极阵列，实现在低电压条件下的细胞电融合。日本研究者提出的利用一对微电极，通过流路控制细胞的流动，使细胞运动到微电极对位置区域后，利用电场作用使两个细胞形成配对，再借助于电脉冲实现电融合。

但上述芯片仍然存在一定的问题，如美国MIT所研究的利用微流控芯片虽然较好的解决了细胞配对的问题，但该芯片两电极间的间距较大，仍然需要较高的外界电压才能够实现电融合。而赵志强提出了芯片集成的微电极数量上较少，不能实现高通量融合；微电极产生的电场强度和电场梯度比较弱，在细胞的精确控制方面显得比较弱；加工材料选择方面抗腐蚀、抗氧化能力也较弱；另外，由于该芯片采用平面二维微电极阵列，细胞在芯片内部流动过程中，有很大的堵塞的风险；同时，由于未集成进出样装置，操作也较为不便。日本研究者提出的方法效率较低，融合通量远远不能满足融合后细胞进行研究。

国内外相关专利如下：

CN200810069511.3，2008年，重庆大学，杨军

CN200810070158.0，2008年，重庆大学，杨军

CN200810070159.5，2008年，重庆大学，杨军

CN200710092892.2，2007年，重庆大学，杨军

CN200610054121.x，2006年，重庆大学，赵志强等；

CN1482234，2003年，中国科学院上海技术物理研究所，张涛等；

CN86210174，1995年，辽宁肿瘤研究所，梁伟；

4326934，April 27，1982，Pohl；

441972，April 10，1982，Pohl；

4578168，March 25，1986，Hofman；

4695547，Sep 22，1987，Hillard；

4699881，Oct 13，1987，Matschke，et.al；

5007995，Apr 16，1991，Takahizuki.

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提出基于柱状微电极阵列的细胞电融合芯片装置及连续流细胞电融合方法，通过在芯片上集成阵列化的柱状微电极，利用三维的柱状微电极阵列结构降低细胞在芯片内部流动过程中堵塞的可能，同时，结合微电极控制技术实现极高的细胞两两排队效率及后期的两两融合率；基于该装置建立的连续流融合方法和芯片的阵列化微电极结构可大大提高装置的融合通量。

本发明的技术方案如下：

基于柱状微电极阵列的细胞电融合芯片装置，所述细胞电融合芯片装置由柱状微电极阵列芯片、印制电路板和流路控制模块组成；

所述柱状微电极阵列芯片从下至上依次为石英基底层、金属导线层、多聚物绝缘层和柱状微电极层组成；所述芯片是采用微加工技术在石英基底层上构建金属导线层，形成相互交错的梳状引线阵列，并利用多聚物构建一层多聚物绝缘层在金属导线层上，仅在与各柱状微电极对应区域开孔，以形成电气连接，并利用电镀工艺在开孔位置生长出阵列化柱状微电极，形成柱状微电极层。

所述柱状微电极阵列芯片的金属导线层通过键合的方式与外围印制电路板形成电连接，将外界电信号引入到柱状微电极上，这样外围电信号就通过外围印制电路板加载于柱状微电极阵列芯片上，进而使相邻的柱状微电极间产生足够强度的梯度电场，利用该电场作用控制细胞在芯片上的运动、排队和电融合。

所述流路控制模块的功能在于实现样品在装置中的进样、出样和流动。流路控制模块覆盖在所述柱状微电极阵列芯片之上，由PDMS流路控制盖片和导管构成，在PDMS流路控制盖片的面向柱状微电极阵列芯片一面上形成有与阵列化柱状微电极区域面积相当的储样池，储样池两侧有微通道和进样口、出样口，在进样口出样口处分别连接导管。

金属微电极层材料尽量选择导电性好的材料，如铝、铜等材料，厚度控制在1～3μm。金属导线层的梳状引线阵列的梳脊宽度控制在100～500μm范围内，梳齿的宽度根据柱状微电极阵列的密度确定，在20～50μm范围内。

柱状微电极材料尽量选择导电性好，抗腐蚀、抗氧化能力强，生物相容性好的材料，如金、铂等材；微电极可为圆柱状、规则多边形柱状结构；柱高在15～30μm，直径控制在50μm以下，以保证较高的集成密度，微电极间间距在40～100μm，以适应不同尺寸的细胞进行电融合，同时可使细胞在微电极间自由流动。

多聚物绝缘层的多聚物材料也应具备较好的生物相容性的透明材料(提高芯片的观察效果)，可选择聚酰亚胺、聚对二甲苯等材料。多聚物绝缘层厚度在2～5μm。

所述的外围印制电路板上布置多个与柱状微电极阵列芯片上的阵列化微电极进行键合连接的键合点，并分布有与外界电信号进行连接的焊盘。

所述PDMS流路控制盖片的微通道和储样池的深度与柱状微电极高度相同或略深于柱状微电极1～2μm；进样口与出样口的直径为2mm。

利用上述装置进行连续流细胞电融合的方法过程如下：

从所述装置的进样口注入细胞悬浮液；

当细胞悬浮液进入储样池后，细胞悬浮液在柱状微极阵列较宽的空间中自由流动；

通过想装置施加正弦波电刺激信号，在相对的柱状微电极间形成非均匀梯度电场，微电极间的两个细胞在介电电泳力作用下进行细胞排队；

完成排队后，对装置施加方波脉冲序列信号，完成排队的细胞对在微电极间高强度的脉冲电场作用下完成细胞电穿孔-细胞电融合过程；

完成细胞电融合过程后，再通过流路控制装置注入细胞培养液，将储样池中的细胞悬浮液冲出，获得的细胞悬浮液利用培养皿进行收集，进行后期的培养；

随后，再次注入细胞悬浮液，再次进行上述的电融合过程，进而实现连续流的细胞电融合。

本发明具有如下优点：

本发明提出了一种集成高密度柱状微电极阵列芯片，并结合流路控制装置和外围印制电路板形成了基于柱状微电极阵列的细胞电融合芯片装置。样品可在芯片中较好的流动，解决了细胞在微芯片内流动的这一难题。同时，利用微电极控制技术可以较好的解决细胞的两两配对的问题；而借助于阵列化的结构，使芯片具有较高的融合通量，可为后期研究提供足够的融合细胞。特别的是，利用该装置构建了一种连续流的细胞电融合方法，在该芯片中，柱状阵列化微电极阵列可使细胞在芯片内部自由流动，结合进样/出样装置使装置具有了连续流融合的功能，在该装置中，融合完一批次细胞后，通过流路控制装置抽取融合后悬浮液，再注入一批新的待融合样品，进而以连续流的方式进行电融合，大大提高了融合效率。

附图说明

图1基于柱状微电极阵列的细胞电融合芯片装置的结构示意图；

图2基于柱状微电极阵列的细胞电融合芯片装置的组装示意图；

图3基于微阵列结构的细胞电融合芯片的各功能层分解示意图；

图4柱状微电极阵列芯片的金属引线层局部示意图

图5柱状微电极阵列芯片的多聚物绝缘层的示意图

图6流路控制模块的结构示意图；

图7外围印制电路板的结构示意图；

具体实施方式

实施例1：

参见图1和图2，基于柱状微电极阵列的细胞电融合芯片装置由柱状微电极阵列芯片1、流路控制模块2和外围印制电路板3组成。

参见图3，微小室阵列芯片1由下至上依次由石英基底层4、金属导线层5、多聚物绝缘层6和柱状微电极阵列层7组成。

参见图4，金属导线层5采用微加工技术构建于石英基底层4上，为交错的梳状引线阵列，材料选用导电性较好的铝、铜等金属，厚度在1～3μm，梳状引线阵列的梳脊9宽度可以较宽，可控制在100～500μm范围内，以保证良好的导通性与可靠性；梳齿10的宽度根据微电极阵列的密度确定；同时，该阵列上还设置了两个键合点8，用于和外围印制电路板3之间的键合。

参见图5，多聚物绝缘层6为一厚度在2～5μm的多聚物材料，可选用聚酰亚胺、聚对二甲苯等，多聚物绝缘层6上开有用于生长柱状微电极的且阵列分布的微孔11，并在边缘开有用于暴露键合点8的键合孔12，键合孔12的尺寸略大于键合点8的尺寸，微孔11的尺寸略小于柱状微电极的尺寸。

柱状微电极构建于微孔11上，微电极材料可选择尽量选择导电性好，抗腐蚀、抗氧化能力强，生物相容性好的材料，如金、铂等材料；微电极可为圆柱状、规则多边形柱状结构，柱高在15～30μm，柱状微电极水平方向下直径控制在50μm以下，以保证较高的集成密度，微电极间间距在40～100μm，以适应不同尺寸的细胞进行电融台，同时可使细胞在微电极间自由流动。

参见图6，流路控制模块3则由PDMS流路控制盖片14和导管13组成。PDMS流路控制盖片14上集成了进样口18、出样口19、微通道16和与阵列化微电极区域面积相当的储样池17。储样池17为一与阵列化微电极区域面积相同的凹槽，其功用在于将PDMS流路控制盖片14反扣于柱状微电极阵列芯片1后，柱状微电极阵列结构能与凹槽相吻合，形成一空腔用于细胞电融合，并通过盖片上集成的进样口、出样口和连接凹槽与进样口/出样口的微通道进行细胞悬浮液的进样，控制细胞在芯片内部的流动，以及融合后细胞悬浮液的出样。微通道16和储样池17的深度均为40μm；进样口和出样口的需要贯穿PDMS流路控制盖片14，进样口18和出样口19置于储样池17的两侧，它们的直径为2mm，可根据实际情况进行调节。PDMS盖片两侧同样设置了与柱状微电极阵列芯片1上的键合点8对应的缺口15，以进行后期键合处理。导管13的外径与进样口和出样口一致，内径可自由设定，连接在进样口和出样口处。

参见图7，外围印制电路板3采用标准印制电路板工艺进行设计与制造，印制电路板3上开有面积与柱状微电极阵列芯片1面积相当的窗20，以保证装置的透光性，使其具有较好的观察效果；同时，还布置了多个可与柱状微电极阵列芯片1上的键合点8进行键合连接的键合点21，并分布有与外界电信号进行连接的焊盘22，键合点21和焊盘22之间采用金属导线23进行一一对应连接。

上述装置的封装为：将柱状微电极阵列芯片1和流路控制模块2用氧等离子体处理30秒钟，再将流路控制装置2反扣于微小室阵列芯片1上，储样池17与柱状微电极阵列区域吻合，二者将在物理作用下紧密结合在一起，形成一用于细胞电融合过程的空腔；随后，将柱状微电极阵列芯片1和流路控制模块2的结合体置于外围印制电路板3上，利用金丝，采用键合工艺连接微小室阵列芯片1上键合点8的端头和外围印制电路板上的键合点24，形成电气连接即可。

实施例2：本装置各部分的加工：

1、柱状微电极阵列芯片采用MEMS加工工艺实现，加工步骤如下(此处所描述的金属阵列电极层材料选金Au，多聚物层材料选用聚酰亚胺)：

A.选用石英作为加工芯片的基片；

B.在石英基片上建设一层铝，厚度1～3μm；

C.通过光刻的方式在铝层上可是出梳状微阵列结构，形成金属导线层；

D.旋涂聚酰亚胺胶于上述结构表面，形成一层厚度3～5μm的聚酰亚胺绝缘层；

E.光刻聚酰亚胺形成微孔；

F.在光刻微孔暴露处的铝表面溅射一层Ti/W，厚度为50nm；

G.通过电镀的方式在Ti/W层表面电镀一层金，厚度在20μm；

H.通过光刻的方式在Ti/W/Au层上刻蚀出柱状微电极阵列结构；

2、外围印制电路板采用标准印制电路板工艺进行设计与制造，印制电路板上主要布置了多个可与柱状微电极阵列芯片上的阵列化微电极进行键合连接的键合点，并分布有与外界电信号进行连接的焊盘。

3、PDMS流路控制盖片的加工通过倒模工艺实现，加工步骤如下：

A.利用印刷电路板制作工艺，加工厚度为与柱状微电极相同或略高于柱状微电极(1～2μm)的模具，模具结构为细胞悬浮液储样池、进样口、出样口和微通道；

B.将模具固定于一培养皿上；

C.倒入混合好的PDMS混合胶，静止后抽真空；

D.置于加热台上75℃固化；

揭下固化后PDMS，根据柱状微电极阵列芯片形状剪裁，去除进样口、出样口的胶即可。

实施例3：连续流融合方法

从实施例1中所述的进样口18中，使用微量泵注入细胞悬浮液；当细胞悬浮液经导管14、进样口18及微通道16组成的通路进入储样池17后；柱状微极阵列较宽的空间可使细胞自由流动；通过外围印制电路板3向金属导线层5施加正弦波电刺激信号，相对的柱状微电极间将形成一非均匀梯度电场，微电极间的两个细胞将在介电电泳力作用下进行细胞排队；完成排队后，施加方波脉冲序列信号，完成排队的细胞对将在微电极间高强度的脉冲电场作用下完成细胞电穿孔-细胞电融合等过程。完成细胞电融合过程后，再结合流路控制装置2，利用微量泵注入细胞培养液，将储样池17中的细胞悬浮液经微通道16、出样口19和导管14通路冲出。获得细胞悬浮液可利用培养皿进行收集，进行后期的培养。随后，再次使用微量泵注入细胞悬浮液，再次进行上述的电融合过程，进而实现连续流的细胞电融合。

Claims (7)

1.基于柱状微电极阵列的细胞电融合芯片装置，其特征在于：所述细胞电融合芯片装置由柱状微电极阵列芯片、印制电路板和流路控制模块组成；

所述柱状微电极阵列芯片从下至上依次为石英基底层、金属导线层、多聚物绝缘层和柱状微电极层组成；所述芯片是采用微加工技术在石英基底层上构建金属导线层，形成相互交错的梳状引线阵列，并利用多聚物构建一层多聚物绝缘层在金属导线层上，仅在与各柱状微电极对应区域开孔，以形成电气连接，并利用电镀工艺在开孔位置生长出阵列化柱状微电极，形成柱状微电极层；

所述柱状微电极阵列芯片的金属导线层通过键合的方式与外围印制电路板形成电连接，将外界电信号引入到柱状微电极上，使相邻的柱状微电极间形成足够强度的梯度电场；

所述流路控制模块覆盖在所述柱状微电极阵列芯片之上，由PDMS流路控制盖片和导管构成，在PDMS流路控制盖片的面向柱状微电极阵列芯片一面上形成有与阵列化柱状微电极区域面积相同的储样池，储样池两侧有微通道和进样口、出样口，在进样口出样口处分别连接导管。

2.根据权利要求1所述的基于柱状微电极阵列的细胞电融合芯片装置，其特征在于：所述金属导线层厚度控制在1～3μm；所述金属导线层的梳状引线阵列的梳脊宽度控制在100～500μm范围内，梳齿的宽度根据微电极阵列的密度确定，在20～50μm范围内。

3.根据权利要求1所述的基于柱状微电极阵列的细胞电融合芯片装置，其特征在于：所述的多聚物绝缘层厚度在2～5μm；多聚物材料选择聚酰亚胺或聚对二甲苯。

4.根据权利要求1所述的基于柱状微电极阵列的细胞电融合芯片装置，其特征在于：所述的柱状微电极材料选择金或铂；柱状微电极为圆柱状或规则多边形柱状结构；柱高在15～30μm，直径控制在50μm以下，微电极间间距在40～100μm。

5.根据权利要求1所述的基于柱状微电极阵列的细胞电融合芯片装置，其特征在于：所述的外围印制电路板上布置多个与柱状微电极阵列芯片上的阵列化微电极进行键合连接的键合点，并分布有与外界电信号进行连接的焊盘。

6.根据权利要求1所述的基于柱状微电极阵列的细胞电融合芯片装置，其特征在于：所述PDMS流路控制盖片的微通道和储样池的深度与柱状微电极高度相同或略深于柱状微电极1～2μm；进样口与出样口的直径为2mm。

7.一种利用权利要求1-6之任一项所述的装置进行连续流细胞电融合的方法，所述方法过程如下：

从所述装置的进样口注入细胞悬浮液；

当细胞悬浮液进入储样池后，细胞悬浮液在柱状微极阵列较宽的空间中自由流动；

通过装置施加正弦波电刺激信号，在相对的柱状微电极间形成非均匀梯度电场，微电极间的两个细胞在介电电泳力作用下进行细胞排队；

完成排队后，对装置施加方波脉冲序列信号，完成排队的细胞对在微电极间高强度的脉冲电场作用下完成细胞电穿孔-细胞电融合过程；

完成细胞电融合过程后，再通过流路控制装置注入细胞培养液，将储样池中的细胞悬浮液冲出，获得的细胞悬浮液利用培养皿进行收集，进行后期的培养；

随后，再次注入细胞悬浮液，再次进行上述的电融合过程，进而实现连续流的细胞电融合。

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