CN101343613B - 柔性高通量细胞电融合微电极阵列芯片装置 - Google Patents

Abstract

本发明提出了一种柔性高通量细胞电融合微电极阵列芯片装置，由阵列芯片和融合池组成。阵列芯片以柔性透明聚酰亚胺薄膜为基底，下表面通过蚀刻形成交叉梳状阵列化微电极组，电极组由两个相互交叉、互不接触、电气结构上互不连接的梳状微电极阵列电极构成，电极组内部微电极之间的微通道为工作通道；阵列芯片倒扣于融合池上，其上的交叉梳状阵列化微电极组与细胞电融合池相对应，落于细胞电融合池中。该芯片装置具备使用方便，加工方法简单，成本极为低廉，对操作人员及细胞无伤害等特点，可广泛应用于遗传学、动植物远缘杂交育种、发育生物学、药物筛选、单克隆抗体制备、哺乳动物克隆等领域。

Description

柔性高通量细胞电融合微电极阵列芯片装置

技术领域

本发明涉及生物细胞电融合的装置。具体地，本发明涉及提供细胞电融合的芯片，提供并产生细胞排队、电致穿孔、融合所需要的电场强度和电场梯度。本发明专利涉及细胞电融合中细胞的精确控制、细胞的高效融合，适用于遗传学、动植物远缘杂交育种、发育生物学、药物筛选、单克隆抗体制备、哺乳动物克隆等领域。

背景技术

生物细胞通过融合可以形成新的细胞，在现代生物医学工程基础领域有着重要的意义。细胞融合技术经历了生物、化学和物理诱导等几个发展阶段。到了20世纪80年代，随着电子信息技术的发展，细胞电融合技术得到了迅速发展，相对于传统的细胞电融合手段，该方法具有效率较高，操作简便、对细胞无毒害，便于观察，适于仪器应用和规范操作等优点，该技术近年来也得到了广泛的应用。

生物细胞处于非均匀电场中时，被电场激化形成偶极子，该偶极子在非均匀电场作用力下发生运动，即介电电泳(dielectrophoresis)，利用电介质电泳可以控制细胞的运动，在细胞电融合过程中，利用电介质电泳现象使细胞排列成串，压紧相互接触的细胞，完成细胞电融合过程所需的排队和融合后压紧。

细胞在强电场作用下，会导致细胞膜穿孔，这种效应称为细胞膜电致穿孔效应(electroporation)。在细胞电融合过程中利用电致穿孔效应，使两接触的细胞膜穿孔，细胞间进行膜内物质交换，使细胞质、膜融合，在一定强度的电场作用下的电穿孔是一种可逆穿孔，细胞膜会在减小或撤销电场强度时回复原状，致使细胞电融合过程的膜融合。

传统的细胞电融合仪，它多采用融合槽的方式进行融合，电极间的间距较大，要达到足够强度的细胞排队、融合及压紧信号，需要很高的外界驱动电压，往往高达几百上千伏，对系统的电气安全性要求高，系统的成本也因此而大为提高。

为解决这一问题，促进细胞电融合技术向集成化、便携式等方向发展，根据经典物理方程E＝V/d，可知在外界电压V恒定的情况下通过缩短电极的间距即d的大小以得到更高的电场强度E。在柔性细胞电融合微电极阵列芯片结构的设计中，微电极阵列和平板电极间的间距可以低至50μm，仅需要10⁰或10¹级的外界电压即可实现细胞融合，大大降低了外围电路的设计、制造难度，降低了系统成本，提高了系统的电气安全性和细胞电融合后细胞的成活率，可以促进细胞电融合技术向集成化、便携式等方向发展。同时，传统的平行板电极在两电极板间产生的是均匀电场，不利于获得较高的电场梯度，故在本发明中，柔性高通量细胞电融合微电极阵列芯片选用了以下三种电极排布方式：对称型电极、交错型电极和电极—平板型电极。

目前国内在柔性高通量细胞电融合微电极阵列芯片领域研究开发基本上空白，中国专利200610054121.x是基于芯片概念的细胞融合装置，国外在次领域的专利相对较多，如Pohl在1982年申请的美国专利(4326934)、Chang在1994年的美国专利(5304486)等。但是上述专利普遍存在微电极数量上较少，不能实现高通量融合，另一方面，微电极产生的电场强度和电场梯度比较弱，在细胞的精确控制方面显得比较弱。中国专利200610054121.x基于芯片的概念提出了一种细胞融合装置，在一定程度上解决了高通量融合，但是该芯片加工材料选择方面上抗腐蚀、抗氧化能力考虑较少，存在已被腐蚀、氧化的缺点，另外，硅基底芯片带来的封装较为不便，芯片系统不利于细胞的进样、出样，进而影响细胞的筛选、分离和培养等后期工作。另外，硅基底芯片的加工成本较高，能够开展相关加工的服务商较少，加工条件也受到限制，细胞电融合芯片的推广收到影响，本发明能够解决上述问题。

国内外相关专利如下：

200610054121.x，2006年，重庆大学，赵志强等；

CN1482234，2003年，中国科学院上海技术物理研究所，张涛等；

CN86210174，1995年，辽宁肿瘤研究所，梁伟；

4326934，April27，1982，Pohl；

441972，April10，1982，Pohl；

4578168，March25，1986，Hofman；

4695547，September22，1987，Hillard；

4699881，October13，1987，Matschke；

5007995，April16，1991，Takahizuki.

发明内容

本发明针对现有技术的不足和细胞电融合技术的发展需要，提出了一种柔性高通量细胞电融合微电极阵列芯片装置，其阵列芯片采用透明柔性聚酰亚胺薄膜作为基底材料，通过刻蚀聚酰亚胺薄膜上沉积的铜箔层形成微电极阵列，阵列中的微通道为细胞电融合工作通道，通过导线将柔性高通量细胞电融合微电极阵列芯片与外围电刺激装置相连，引入电刺激信号促进微通道内部的细胞发生细胞排队和细胞融合。该阵列芯片的采用降低了芯片的设计难度，特别是后期封装难度，实现了细胞的自动进样、自动出样及后期培养的难度。

本发明的技术方案如下：

一种柔性高通量细胞电融合微电极阵列芯片装置，它由阵列芯片和融合池组成；所述阵列芯片以柔性透明聚酰亚胺薄膜为基底，在柔性透明聚酰亚胺薄膜基底上采用柔性印刷电路板加工技术(Flexible Printed Circuit board，FPC)，形成从上至下以镀金层—铜箔层—聚酰亚胺薄膜—铜箔层—镀金层构成的纵向层状结构；在该结构的下表面通过蚀刻聚酰亚胺薄膜上的铜箔层形成交叉梳状阵列化微电极组，交叉梳状阵列化微电极组由两个相互交叉、互不接触、电气结构上互不连接的梳状微电极阵列电极构成，梳状微电极阵列电极经过孔与芯片上表面蚀刻铜箔层形成的引线层相连，经引线层上的焊盘焊接引线引入外界电刺激信号，电极组内部微电极之间的微通道为工作通道。

所述融合池是在玻璃或有机玻璃硬质透明材料中央区域加工矩形凹槽而形成细胞电融合池，细胞电融合池的四周池壁加工有与外界连通的进、出样孔，柔性细胞电融合微电极阵列芯片倒扣于融合池上，其上的交叉梳状阵列化微电极组与细胞电融合池相对应，置于落于细胞电融合池中，使交叉梳状阵列化微电极组浸入样品液中，当施加外界电刺激信号，即在微电极阵列与融合池中的平板电极间的微小间距中产生高强度的非均匀梯度电场，细胞在电场中被极化，在介电力的作用下被吸附到微电极上，并连接成串状，并在电场作用下发生电融合，实现细胞电融合过程，提高细胞电融合效率，融合后样品经底部出样孔流出，以进行后期的融合细胞的筛选、培养。

该芯片装置可实现每平方厘米最高10⁴的集成度，根据实验需要可选择不同面积的芯片，以达到高通量细胞融合的要求。

所述芯片的梳状微电极阵列电极上包含多个梳脊，微电极分布于梳脊上，相邻梳脊上微电极排布方式可以分为对称型，即齿状微电极呈现水平对称的排布方式，或者平板—电极型，即一边为齿状微电极，一边为平板电极的排队方式，或者交错型，即齿状微电极呈现水平交错的排布方式。

所述芯片的微通道的深度由铜箔层厚度决定，在加工过程中，可根据实验对象细胞尺寸进行调整，调整范围在35～140μm。

所述芯片的梳状微电极阵列电极上的齿状微电极长度为50～100μm，宽度为50～100μm，相对微电极之间的间距设定在50～500μm，同一梳脊上相邻齿状微电极间距设定在50～200μm。

本发明提出的柔性高通量细胞电融合微电极阵列芯片装置具有以下优点：

本发明采用现代柔性印刷电路板加工技术，可以实现在透明柔性聚酰亚胺薄膜上精密加工微电极，保证细胞电融合过程的精确实施与控制；同时，由于精密加工工艺可实现每平方厘米最高10⁴的集成度，利用聚酰亚胺薄膜面积可根据需要扩大的优势，通过增大聚酰亚胺薄膜面积的方式可以实现任意集成度的阵列化电极结构，可以提供大量的微电极，提高细胞电融合的通量；柔性透明薄膜选用聚酰亚胺薄膜具有柔软、透明、耐高温消毒、具备良好生物相融合性和能够兼容柔性等特点，能够通过精密加工工艺，针对对象细胞的多样化，设计、加工多样化的微电极结构；实现高通量的精确电融合控制能力，以获取更好的融合效果；微电极上通过电镀沉积金膜，可以提高微电极的电气性能，改善内部电场分布，金的惰性也可以改善芯片的抗氧化能力和抗腐蚀性能；同时，聚酰亚胺和金良好的生物相融性和抗腐蚀能力改善了微电极阵列的生物相容性，保证了融合细胞的安全性和细胞活力，进一步提高了细胞电融合效率。另外，柔性高通量细胞电融合微电极阵列芯片良好的柔性降低了芯片系统的整体设计难度，特别是后期封装难度，可以实现融合池及各种自动进样及出样装置的无缝连接，芯片装置达到的全封闭、无菌水平；融合池的使用可以实现自动进样和自动出样；整个装置能够实现细胞液保存、细胞环境液体置换、细胞电融合和融合后细胞培养的整个过程，减小对融合后细胞的物理损伤，提高其存活能力；另外，较硅基芯片而言，其通透性更好，观察效果佳。

柔性高通量细胞电融合微电极阵列芯片装置中的柔性高通量细胞电融合微电极阵列芯片采用通用的柔性印刷电路板加工技术进行加工，融合池采用机床或者激光即可进行加工，两种加工方法都已经相当成熟，便于批量化生产，有利于细胞电融合技术的推广。

附图说明

图1柔性高通量细胞电融合微电极阵列芯片装置示意图；

图2柔性高通量细胞电融合微电极阵列芯片装配示意图

图3融合池示意图

图4柔性高通量细胞电融合微电极阵列芯片示意图，图4A是下表面，图4B是上表面

图5柔性高通量细胞电融合微电极阵列芯片剖面结构图

图6柔性高通量细胞电融合微电极阵列芯片三种微电极结构的示意图，其中图6A平板—电极型，图6B是交错型，图6C是对称型；

具体实施方式

以下结合附图详细说明本发明的结构：

参见图1、图2、图3和图4，融合池2由玻璃或有机玻璃等硬质透明材料加工而成，通过在片状硬质透明材料中央区域加工一固定深度的矩形凹槽5形成融合池。将导线焊在柔性高通量细胞电融合微电极阵列芯片1的焊盘8上(图4B)，随后将其倒扣于融合池2上，交叉梳状阵列化微电极组9与中央矩形凹槽5相对应，使用黏合剂进行粘合，形成密闭空腔。试验中将柔性高通量细胞电融合微电极阵列芯片装置反置，形成柔性高通量细胞电融合微电极阵列芯片1在下的形势。含有待融合细胞的缓冲液经顶部的进样孔3注入凹槽5内，当施加外界电刺激信号的过程中，首先施加交流信号，即在微电极阵列7(图4A)之间的微通道9中产生高强度的非均匀梯度电场，细胞在电场中被极化，在介电力的作用下被吸附到微电极上，并连接成串状，并在直流电形成的高强度电场作用下发生电融合，随后再施加交流电信号60s左右，促进细胞的进一步融合，实现细胞电融合过程，提高细胞电融合效率。整个实验过程可在显微镜下观测录像，完成融和后的细胞在芯片中静置5～10min后，再次施加交流信号，使密闭空腔内部的细胞都吸附到微电极上，此时通过侧面的出样口4吸出缓冲液，从顶部进样口3注入细胞培养液，融合后细胞可在此密闭空腔内部进行后期培养；当然在融合完成后也可以直接从侧面的出样口4吸出含有细胞的缓冲液，在柔性细胞电融合芯片装置外进行后期的筛选和培养工作。

柔性高通量细胞电融合微电极阵列芯片1的尺寸为3cm×3.6cm，见图5，芯片“镀金层10-铜箔层11-聚酰亚胺薄膜6-铜箔层11-镀金层10”结构中聚酰亚胺薄膜6厚度可根据需要在12.5μm至50μm之间进行调节，铜箔层11的厚度在35μm至140μm之间调节，镀金层10的厚度为1μm，以保证芯片具有较强的抗腐蚀、抗氧化能力，并获得尽可能好的生物相容性，提高细胞的存活能力，焊盘8直径为200μm，柔性细胞电融合芯片上集成了10⁴组微电极，微电极结构分为平板—电极型12，即一边为齿状微电极，一边为平板电极的排队方式(见图6A)，或者对称型13，即齿状微电极呈现水平对称的排布方式(见图6B)，或者交错型14，即齿状微电极呈现水平交错的排布方式(见图6C)。上述电极结构中，齿状微电极长度为50～100μm，宽度为50～100μm，相对微电极之间的间距设定在50～500μm，同一梳脊上相邻齿状微电极间距设定在50～200μm。

融合池2尺寸为8cm×10cm，中央凹槽深度5可根据融合量在为200μm～1000μm范围内调节，顶部进样口尺寸3为内径500μm，外径1000μm，侧面出样口4尺寸为内径500μm，外径1000μm，以充分保证细胞能够顺利的进入通道内部。

上述柔性高通量细胞电融合微电极阵列芯片1的加工采用柔性印刷电路板加工工艺，选用聚酰亚胺薄膜作为基板加工材料，加工步骤如下：

1、聚酰亚胺薄膜裁切：将聚酰亚胺薄膜裁切成需要尺寸；

2、烤板；

3、清洗材料，以获得更好的光面平整度和光洁度

4、钻孔：在聚酰亚胺薄膜上过孔所在位置进行钻孔，得到所需要的过孔；

5、磨板：对聚酰亚胺薄膜表面进行打磨处理以满足铜沉积；

6、沉积铜：在聚酰亚胺薄膜表面沉积铜箔，厚度范围35～140μm；

7、层压、露光：利用感光干膜层压在铜箔上，通过UV线照射下在干膜上形成微电极阵列、引线等图形；

8、显影：将已经曝光过的感光干膜利用显影液进行处理，除去未感光的感光干膜，使图形基本成型；

9、蚀刻：在铜箔表面均匀喷淋蚀刻药液，腐蚀铜箔，在铜箔上形成所需图形，随后剥离感光干膜，得到微电极阵列、引线和焊盘等微结构；

10、镀金：在微电极阵列、引线等图形上镀金，以获得较好的生物相容性及抗腐蚀、抗氧化能力；

11、喷锡：在焊盘位置喷锡；

12、外围成形：剪裁芯片，得到最终的外形；

13、等离子清洗：使用等离子机对芯片进行清洗；

14、防氧阻焊处理；

加工完成柔性高通量细胞电融合微电极阵列芯片后，通过焊接的方式实现外围电刺激信号的引入，将完成焊接后的芯片反扣在融合池上，并使用黏合剂固定，形成密闭的空间，边获得了完整的芯片装置。

Claims (5)

1.一种柔性高通量细胞电融合微电极阵列芯片装置，其特征在于：芯片装置由阵列芯片和细胞电融合池组成；

所述阵列芯片以柔性透明聚酰亚胺薄膜为基底，在柔性透明聚酰亚胺薄膜基底上采用柔性印刷电路板加工技术，形成从上至下以镀金层-铜箔层-聚酰亚胺薄膜-铜箔层-镀金层构成的纵向层状结构；在所述结构的下表面通过蚀刻聚酰亚胺薄膜上的铜箔层形成交叉梳状阵列化微电极组，交叉梳状阵列化微电极组由两个相互交叉、互不接触、电气结构上互不连接的梳状微电极阵列电极构成，梳状微电极阵列电极经过孔与芯片上表面蚀刻铜箔层形成的引线相连，经引线上的焊盘焊接引线引入外界电刺激信号；电极组内部微电极之间的微通道为工作通道；

所述细胞电融合池是在玻璃或有机玻璃硬质透明材料中央区域加工矩形凹槽而形成，细胞电融合池的四周池壁加工有与外界连通的进、出样孔，阵列芯片倒扣于细胞电融合池上，其上的交叉梳状阵列化微电极组与细胞电融合池相对应，落于细胞电融合池中。

2.根据权利要求1所述的柔性高通量细胞电融合微电极阵列芯片装置，其特征在于：所述交叉梳状阵列化微电极的每个梳状微电极阵列电极上包含多个梳脊，梳脊上分布微电极，相邻梳脊上的微电极排布方式采用对称型，即相邻梳脊上有齿状微电极，并呈现水平对称的排布方式；或者采用平板-电极型，即一边梳脊上为齿状微电极，另一边梳脊上为平板电极的排布方式；或者采用交错型，即相邻梳脊上为齿状微电极，并呈现水平交错的排布方式。

3.根据权利要求1或2所述的柔性高通量细胞电融合微电极阵列芯片装置，其特征在于：所述阵列芯片的微通道的深度根据细胞尺寸和试验需要设定在35～140μm。

4.根据权利要求1或2所述的柔性高通量细胞电融合微电极阵列芯片装置，其特征在于：齿状微电极长度为50～100μm，宽度为50～100μm，相对齿状微电极之间的间距设定在50～500μm，同一梳脊上相邻齿状微电极间距设定在50～200μm。

5.权利要求1或2所述的柔性高通量细胞电融合微电极阵列芯片装置的加工工艺，其特征在于：

(1)加工柔性高通量细胞电融合微电极阵列芯片：采用柔性印刷电路板加工工艺，选用聚酰亚胺薄膜作为基板加工材料，加工步骤如下：

A、聚酰亚胺薄膜裁切：将聚酰亚胺薄膜裁切成需要尺寸；

B、烤板；

C、清洗材料，以获得更好的光面平整度和光洁度

D、钻孔：在聚酰亚胺薄膜上过孔所在位置进行钻孔，得到所需要的过孔；

E、磨板：对聚酰亚胺薄膜表面进行打磨处理以满足铜沉积；

F、沉积铜：在聚酰亚胺薄膜表面沉积铜箔，厚度范围35～140μm；

G、层压、露光：利用感光干膜层压在铜箔上，通过UV线照射下在干膜上形成微电极阵列、引线的图形；

H、显影：将已经曝光过的感光干膜利用显影液进行处理，除去未感光的感光干膜，使图形基本成型；

I、蚀刻：在铜箔表面均匀喷淋蚀刻药液，腐蚀铜箔，在铜箔上形成所需图形，随后剥离感光干膜，得到微电极阵列、引线和焊盘的微结构；

J、镀金：在微电极阵列、引线的图形上镀金，以获得较好的生物相容性及抗腐蚀、抗氧化能力；

K、喷锡：在焊盘位置喷锡；

L、外围成形：剪裁芯片，得到最终的外形；

M、等离子清洗：使用等离子机对芯片进行清洗；

N、防氧阻焊处理；

(2)加工完成的柔性高通量细胞电融合微电极阵列芯片，通过焊接的方式实现外围电刺激信号的引入，将完成焊接后的芯片反扣在融合池上，并使用黏合剂固定，形成密闭的空间。

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