CN101168724A - 一种细胞电融合芯片及加工方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种细胞电融合芯片，由陶瓷管芯、安装在陶瓷管芯的安装窗口中的芯片和将芯片封装在窗口内的盖玻片组成；芯片的绝缘基底材料上加工有独立可控的融合小池，融合小池中加工有梳状微电极组，梳状电极组的梳齿呈交叉插入状，并引出导线，梳状微电极组的梳齿两侧加工有矩形微电极，同一融合小池中的矩形微电极按阵列分布，并且相邻梳齿上的矩形微电极交错相向，梳齿之间形成连续的微流通道，微流通道与该融合小池的细胞进样通道连通。本发明对芯片从结构、材料、加工工艺、封装进行了重新设计，使融合过程中的电场诱导力达到最大，可提高细胞聚集排队和电穿孔的能力，从而提高了细胞电融合效率。

Description

一种细胞电融合芯片及加工方法

技术领域

本发明涉及生物细胞电融合的装置。具体地，本发明涉及提供细胞电融合的芯片，提供并产生细胞排队、电致穿孔、融合所需要的电场强度和电场梯度。

背景技术

生物细胞通过融合可以形成新的细胞，在现代生物医学工程基础领域有着重要的意义。细胞融合有化学融合方法(如PEG)、物理融合方法，其中物理融合方法中，电场融合方法因其便于精确控制、重复性好、融合率高等优点而得到了广泛的应用。

生物细胞处于非均匀电场中时，被电场激化形成偶极子，该偶极子在非均匀电场作用力下发生运动，即介电电泳(dielectrophoresis)，利用电介质电泳可以控制细胞的运动，在细胞电融合过程中，利用电介质电泳现象使细胞排列成串，压紧相互接触的细胞，完成细胞电融合过程所需的排队和融合后压紧。

细胞在强电场作用下，会导致细胞膜穿孔，这种效应称为细胞膜电致穿孔效应(electroporation)。在细胞电融合过程中利用电致穿孔效应，使两接触的细胞膜穿孔，细胞间进行膜内物质交换，使细胞质、膜融合，在一定强度的电场作用下的电穿孔是一种可逆穿孔，细胞膜会在减小或撤销电场强度时回复原状，致使细胞电融合过程的膜融合。

根据上述分析，为了实现细胞电融合，最关键的是将细胞置于非均匀电场中，使细胞受到电介质电泳力和强电场穿孔力。根据电场基本理论电场强度E＝V/d，为了获得较强的电场强度，必须靠增加电压或缩短电极间距来实现，在细胞电融合芯片的设计中，以减小电极间距来实现高电场强度，所以，电极间距可以根据细胞大小进行设计选择，在细胞尺寸数量级范围内，产生足以是细胞膜穿孔所需电压降低至十几伏至几十伏即可，大大降低了细胞电融合信号发生器设计制造难度，提高了细胞电融合后细胞的成活率。为了获得非均匀电场，需要设计合适的电极形状和电信号，为此，本发明设计了能在相同条件下产生强电场梯度的电场，即：矩形非对称梳状电极。

目前国内在细胞电融合芯片研究开发较少，中国专利200610054121.x是基于芯片概念的细胞融合装置，国外在该领域的专利相对较多，如Pohl在1982年申请的美国专利(4326934)、Chang在1994年的美国专利(5304486)等。目前的细胞电融合芯片一方面在微电极数量上较少，不能实现高通量融合，另一方面，微电极产生的电场强度和电场梯度比较弱，在细胞的精确控制方面显得比较弱，而且加工材料选择方面抗腐蚀、抗氧化能力也较弱，本发明能较好解决以上问题。

国内外相关专利如下：

200610054121.x，2006年，重庆大学，赵志强等；

CN1482234，2003年，中国科学院上海技术物理研究所，张涛等；

CN86210174，1995年，辽宁肿瘤研究所，梁伟；

4326934，April 27，1982，Pohl；

441972，April 10，1982，Pohl；

4578168，March 25，1986，Hofman；

4695547，September 22，1987，Hillard；

4699881，Oct.13，1987，Matschke et.al；

5007995，Apr.16，1991，Takahizuki.

发明内容

针对现有技术存在的上述不足，本发明提出一种细胞电融合芯片及加工方法，对芯片从结构、材料、加工工艺、封装进行了重新设计，以使融合过程中的电场诱导力达到最大，提高细胞聚集排队和电穿孔的能力，从而提高细胞电融合效率。

本发明的技术方案如下：

一种细胞电融合芯片，由陶瓷管芯、安装在陶瓷管芯的安装窗口中的芯片和将芯片封装在窗口内的盖玻片组成。其中，芯片的绝缘基底材料上加工有独立可控的融合小池，融合小池中加工有梳状微电极组，梳状电极组的梳齿呈交叉插入状，并引出导线，梳状微电极组的梳齿两侧加工有矩形微电极，同一融合小池中的矩形微电极按阵列分布，并且相邻梳齿上的矩形微电极交错相向，梳齿之间形成连续的微流通道，微流通道与该融合小池的细胞进样通道连通。

所述芯片上的融合小池至少有两个，各融合小池中的梳状电极组尺寸各不相同，各融合小池中相邻梳齿上交错相向的相邻矩形微电极的近角距离的范围从20微米到100微米不等，但同一融合小池中相邻梳齿上交错相向的相邻矩形微电极的近角距离是相同的。以相邻梳齿上交错相向的相邻矩形微电极的近角连线为斜边d，以相邻梳齿上交错相向的矩形微电极的横向和纵向平行间距为两直角边c和a，它们形成的直角三角形满足够勾股定理，a∶c∶d＝3∶4∶5。矩形微电极的宽度b为50微米，同一梳齿上相邻矩形微电极的间距为2a+b。

每个小池中梳状微电极组引出导线各自独立成对，连接独立的控制电信号，这样可以单独对每个小池的微电极施加融合电信号，而其它融合小池不会受到干扰。所述电极的引出导线采用金丝键合。

梳状微电极组从上到下依次由金电镀层、金溅射层、铬溅射层和绝缘基底构成。所述铬溅射层的厚度为200-300纳米，金溅射层的厚度为1-2微米。

所述芯片的绝缘基底材料选用玻璃、硅或聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane(PDMS)。

细胞电融合芯片微电极加工工艺采用以下工艺流程：溅射铬-刻蚀电极-溅射铬-刻蚀铬-蒸发金-电镀金-刻蚀金。

本发明的优点如下：

1、在芯片的微电极结构、排列、分布上进行了系统设计和优化，采用了独特结构的矩形非对称梳状电极，其结构、分布、排列可以提高微电极周围和微通道内部的电场强度和电场梯度，同时对细胞在微通道内的流场分布更加有利于细胞运动，该结构的微电极组成形成的电场强度和电场梯度能够达到最大，即融合过程中的电场诱导力达到最大，该诱导力大大提高了细胞聚集排队和电穿孔的能力，从而提高细胞电融合效率。

2、芯片在结构上由多个细胞融合小池组成，各融合小池内微电极结构尺寸各不相同，以满足不同尺寸的细胞能在同意中芯片中进行融合。各小池分别独立可控并互不影响，使细胞电融合控制可一做得更加精确。

3、芯片对微电极的形状和尺寸进行了特殊的设计，这是保证获得强电场和较大梯度电场的重要因素。

4、在材料选择上，以玻璃为基底，提高芯片抗腐蚀、抗氧化能力，而且具有很高的绝缘性能和机械强度，适宜采用MEMES加工技术完成电极和微通道的加工，保证加工精度和电极形状。同时由于玻璃的透光性，能清楚观察细胞电融合的全过程，便于计算机监控。该芯片可以清洗，再次使用，降低了实施细胞电融合成本。

5、在芯片微电极上溅射铬/金材料，提高芯片微电极的导电性能，提高微电极在纵/横向电压分布的均匀性，使加工后的电极形成的电场更加符合设计要求。特别是克服了硅材料导电电阻大造成电极深度方向电压不均匀和随机性，使得电场分布达不到预先设计的缺陷。

附图说明

图1细胞电融合芯片内部结构图；

图2芯片封装图；

图3微电极结构尺寸图；

图4芯片加工工艺流程图；

图5微电极3-D示意图；

图6细胞排队实验的电镜图片；

图7细胞融合实验的电镜图片。

具体实施方式

实施例1：

参见图2，细胞电融合芯片封装结构图，图中1是标准40DIP封装的陶瓷管芯，2是芯片安装窗口，3是封装玻璃。加工完成的玻璃基底芯片4置于芯片安装窗口2处，并黏合在窗口底部，然后通过键合技术用金丝将芯片电极与管芯内的引脚相连，最后用盖玻片将芯片4封装在芯片安装窗口2中。

如图1所示，芯片4是在玻璃基底上加工独立可控的六融合小池5、6、7、8、9、10构成，各融合小池中加工有梳状微电极组11，梳状电极组11的梳齿12呈交叉插入状，并引出导线，在梳齿12两侧加工矩形微电极13，同一融合小池中的矩形微电极13按阵列分布，并且相邻梳齿上的矩形微电极交错相向，梳齿之间形成连续的微流通道14，微流通道14与该融合小池的细胞进样通道15连通。

图3为矩形非对称梳状电极分布、结构、排列示意图，六个小池的电极结构、形状、分布完全相同，不同的是电极大小尺寸不同，使同一种芯片能够至少满足六种尺度的细胞进行电融合。以相邻梳齿上交错相向的相邻矩形微电极13的近角连线为斜边d，以相邻梳齿上交错相向的矩形微电极的横向和纵向平行间距为两直角边c和a，矩形微电极的宽度b，同一梳齿上相邻矩形微电极的间距为e，微电极的其尺度为：a、c、d尺度构成直角三角形的条边且满足勾股定理(3∶4∶5比例)，d的尺度分别为20、40、50、60、80、100微米(对应于六个小池)，b的尺度均为50微米，e的尺寸＝a尺寸的2倍+b尺寸。微电极高度(可根据图3看出)等于图3中d的尺寸。形成的直角三角形满足够勾股定理，a∶c∶d＝3∶4∶5。

本细胞电融合芯片是采用玻璃作为基底，采用MEMES技术在玻璃上刻蚀矩形非对称梳状电极并形成容纳细胞及缓冲液的微通道，微电极表层采用铬/金材料，利用溅射和电镀技术使铬/金材料均匀覆盖整个微电极。芯片加工工艺基本流程见图4，主要工艺为：A、溅射铬(Cr)：便于刻蚀玻璃后能在显微镜下看清楚电极；B、刻蚀电极：首先刻蚀掉Cr，然后采用离子刻蚀技术保证垂直断面两次刻蚀玻璃，两次刻蚀确保刻蚀深度；C、溅射铬(Cr)：确保金与玻璃之间有良好的粘附力；D、刻蚀底层Cr：确保横向电极之间绝缘；E、蒸发金：约几500-600埃；F、电镀Au(约1μm)；G、刻蚀底层Au：确保横向电极之间绝缘。

图5是微电极、微通道的3-D示意图。其材料分别为：16是玻璃基底，厚度为1mm，17是金属铬，厚度为200-300纳米(根据加工工艺设备决定)，目的是保证金与玻璃能够有很好的粘附力，18是蒸发的金(Au)，厚度为500--600埃，19是电镀的金，厚度为1-2微米，不一次蒸发到1-2微米的金是为了降低加工成本。

实验效果：

我们采用MEMES加工技术，制作了细胞电融合芯片原型，并进行了动物、微生物、植物原生质体(黄瓜叶片细胞)的融合研究。

在施加排对信号(一种类正弦信号)后可以观察到，绝大多数细胞沿电极对角方向排列，更多地集中于接近电极尖端的地方(见图6)。

在40V直流脉冲控制电压条件下，紧挨在一起的植物原生质体间出现了明显的融合(见图7)。根据计算得到的融合效率达到了40％左右，大大高于传统的化学(PEG小于1％)方法和电融合方法(小于10％)。这表明，该设计方案可以大大提高融合效率，实现高通量的细胞融合。

Claims (10)

1.一种细胞电融合芯片，由陶瓷管芯、安装在陶瓷管芯的安装窗口中的芯片和将芯片封装在窗口内的盖玻片组成；其特征在于：芯片的绝缘基底材料上加工有独立可控的融合小池，融合小池中加工有梳状微电极组，梳状电极组的梳齿呈交叉插入状，并引出导线，梳状微电极组的梳齿两侧加工有矩形微电极，同一融合小池中的矩形微电极按阵列分布，并且相邻梳齿上的矩形微电极交错相向，梳齿之间形成连续的微流通道，微流通道与该融合小池的细胞进样通道连通。

2.根据权利要求1所述的细胞电融合芯片，其特征在于：融合小池至少有两个，各融合小池中的梳状电极组尺寸各不相同，各融合小池中相邻梳齿上交错相向的相邻矩形微电极的近角距离的范围从20微米到100微米不等，但同一融合小池中相邻梳齿上交错相向的相邻矩形微电极的近角距离是相同的。

3.根据权利要求1或2所述的细胞电融合芯片，其特征在于：以相邻梳齿上交错相向的相邻矩形微电极的近角连线为斜边d，以相邻梳齿上交错相向的矩形微电极的横向和纵向平行间距为两直角边c和a，形成的直角三角形满足够勾股定理，a∶c∶d＝3∶4∶5。

4.根据权利要求3所述的细胞电融合芯片，其特征在于：矩形微电极的宽度b为50微米，同一梳齿上相邻矩形微电极的间距e为2a+b。

5.根据权利要求4所述的细胞电融合芯片，其特征在于：每个小池中梳状微电极组引出导线各自连接独立的控制电信号。

6.根据权利要求5所述的细胞电融合芯片，其特征在于：所述电极的引出导线采用金丝键合。

7.根据权利要求6所述的细胞电融合芯片，其特征在于：梳状微电极组从上到下依次由金电镀层、金溅射层、铬溅射层和绝缘基底构成。

8.根据权利要求7所述的细胞电融合芯片，其特征在于：所述铬溅射层的厚度为200-300纳米，金溅射层的厚度为1-2微米。

9.根据权利要求8所述的细胞电融合芯片，其特征在于：所述芯片的绝缘基底材料选用玻璃、硅或聚二甲基硅氧烷。

10.权利要求9所述的细胞电融合芯片的加工方法，其步骤如下：

(1)在玻璃基底上溅射铬Cr：

(2)刻蚀电极：首先刻蚀掉Cr，然后采用离子刻蚀技术保证垂直断面两次刻蚀玻璃，两次刻蚀确保刻蚀深度；

(3)再溅射铬Cr，确保金与玻璃之间有良好的粘附力；

(4)刻蚀底层Cr，确保横向电极之间绝缘；

(5)蒸发金，约500-600埃；

(6)电镀Au，约1μm；

(7)刻蚀底层Au，确保横向电极之间绝缘，获得玻璃基底芯片；

(8)采用标准40DIP封装的陶瓷管芯，加工完成的玻璃基底芯片置于芯片安装窗口处，并黏合在窗口底部，然后通过键合技术用金丝将芯片电极与管芯内的引脚相连，最后用盖玻片将芯片封装在芯片安装窗口中。

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