CN102321536A - 基于微孔阵列薄膜的高通量细胞电融合装置 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种基于微孔阵列薄膜的高通量细胞电融合装置，包括微孔阵列薄膜、分别与微孔阵列薄膜两面贴合的两个样品池、设在微孔阵列薄膜和两个样品池上面的盖片；所述微孔阵列薄膜的中部设有微孔阵列，两电极板的下端分别穿过盖片插入两个样品池内。由于利用微加工技术加工集成了大量微孔的微孔阵列薄膜，利用微孔结构改变两电极板之间电场分布，使得微孔中央区域为电场最高区域，可利用介电电泳效应操控样品池中的细胞向高电场区运动，在微孔两侧都吸附一个细胞并在微孔中央形成细胞配对与连接；微孔中央电场强度最高，融合几率最大，避免了多细胞融合发生；具有良好的生物相容性及抗腐蚀性能，保证了装置的可靠性，也提高了细胞融合的安全性。

Description

基于微孔阵列薄膜的高通量细胞电融合装置

技术领域

本发明涉及一种基于微孔阵列薄膜的高通量细胞电融合装置，其主要使用范围为动物、植物、微生物细胞的融合细胞制备，同时也可应用于电穿孔、电转染等研究中，可广泛应用于遗传学、动植物远缘杂交育种、发育生物学、药物筛选、单克隆抗体制备、哺乳动物克隆等领域。

背景技术

细胞电融合技术自上世纪80年代起，因为其效率较高、操作简便、对细胞无毒害，便于观察，适于仪器应用和规范操作等优点，得到了快速发展和广泛应用。细胞电融合可以分为两个主要阶段：细胞排队和细胞融合。

细胞排队的原理在于：生物细胞处于非均匀电场中时，被电场极化形成偶极子，该偶极子在非均匀电场作用中会受到特定的力而发生运动，即介电电泳（Dielectrophoresis）。利用介电电泳可以控制细胞的运动，在细胞电融合过程中，利用介电电泳现象使细胞排列成串，压紧相互接触的细胞，完成细胞电融合过程所需的排队和融合后压紧。

细胞融合的原理在于：强电场作用会导致细胞膜穿孔，这种效应称为细胞膜电致穿孔效应（Electroporation）。在细胞电融合过程中利用电致穿孔效应，使两接触的细胞膜穿孔，从而使细胞间进行膜内物质交换，使细胞质、膜融合，在一定强度的电场作用下的电穿孔是一种可逆穿孔，细胞膜会在减小或撤销电场强度时回复原状，产生细胞电融合过程的膜融合。

传统的细胞电融合系统通常都采用大型融合槽，其优点在于：

（1）操作较为简便，采用大型融合槽降低了包括样品进样与出样等步骤的难度；

（2）加工简便，大型融合槽的尺寸一般都在厘米量级，利用传统的机械加工手段可以较为方便地加工出所需要的融合槽结构；

（3）融合量大，传统的融合槽可以容纳数毫升样品，一次实验即可获得足够的细胞进行后期筛选、培养等工作。

但传统的细胞电融合设备也存在一些缺点：

（1）由于融合槽中的电极间距较大，要达到够强度的细胞排队、融合及压紧信号，需要很高的外界驱动电压，往往高达几百上千伏，对系统的电气安全性要求高，系统的成本也因此大为提高；

（2）电极间的较大间距不利于对细胞的精确控制等。

为解决这一问题，研究者将细胞电融合技术与MEMS加工技术相结合。MEMS技术的加工范围通常在1～50μm，这与细胞的直径范围相当，所产生的微结构能有效控制细胞。有多家研究机构开始研究利用微流控芯片技术或者微电极阵列技术构建生物芯片来实现细胞电融合操作。例如，美国MIT的研究人员提出了利用微流控芯片技术实现对细胞的精确控制，达到高效的细胞配对和融合；国内赵志强等研究人员也提出了利用MEMS技术构建微电极阵列，通过构建微米量级间距的微电极阵列，实现在低电压条件下的细胞电融合。日本研究者提出的利用一对微电极，通过流路控制细胞的流动，使细胞运动到微电极对位置区域后，利用电场作用使两个细胞形成配对，再借助于电脉冲实现电融合。

但上述芯片仍然存在一定的问题，如美国MIT所研究的微流控芯片虽然较好的解决了细胞配对的问题，但该芯片两电极间的间距较大，仍然需要较高的外界电压才能够实现电融合。而赵志强提出的芯片所集成的微电极数量较少，不能实现高通量融合；微电极所产生的电场强度和电场梯度也比较弱，难以实现细胞的精确控制；所选择的加工材料的抗腐蚀、抗氧化能力也较差；同时，由于未集成进出样装置，操作也较为不便。日本研究者提出利用微孔的方式实现两个通道的分隔，进而实现不同细胞的独立进样完成细胞配对，但该方法对微孔的定位要求很高，无法进行大规模应用，同时，该方法依然采用距离较大的平板电极实现电融合，工作电压高。（国内外相关专利如下：200610054121.x，2006年，重庆大学，赵志强等；CN1482234，2003年，中国科学院上海技术物理研究所，张涛等；CN86210174，1995年，辽宁肿瘤研究所，梁伟；4326934, April 27, 1982, Pohl；441972, April 10, 1982, Pohl；4578168, March 25, 1986, Hofman；4695547, Sep 22, 1987, Hillard；4699881, Oct 13, 1987, Matschke, et al.；5007995, Apr 16, 1991, Takahizuki。）

重庆大学胡宁等研究人员在上述芯片的基础上也提出了包括三维微电极阵列、柔性微电极阵列、基于微小室结构的细胞电融合芯片等结构，解决了一些问题；本发明的专利是对上述研究的进一步深入探索。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种基于微孔阵列薄膜的高通量细胞电融合装置，该细胞电融合装置借助于微孔改变电场分布这一特性，实现两样品池内部细胞吸附于微孔上，形成一对一的细胞配对，同时，还借助于微孔区域电场最强这一特点，利用电压调节使得微孔内部的细胞连接处获得适宜的融合电场强度，达到高效融合，并避免多细胞融合的发生。

本发明利用微加工技术加工集成了大量微孔的微孔阵列薄膜，以提高装置整体的融合通量；结合样品池形成两个独立的空腔，进而可以分别加载不同的细胞，解决不同细胞配对的问题；同时，利用微孔改变两电极板之间电场分布这一特点，在微孔中央区域为整个通道中电场最高区域，进而可以利用介电电泳效应操控样品池中的细胞向高电场区运动，在微孔上吸附，又因为微孔的直径小于细胞的直径，故细胞无法穿过微孔，最终在微孔两侧都吸附一个细胞并在微孔中央形成细胞配对与连接；此外，由于形成细胞连接后，微孔中央区域仍然是电场最高区，在此区域发生细胞电融合几率最大，进而可通过调节电压控制细胞电融合，避免多细胞融合的发生。

本发明所述的一种基于微孔阵列薄膜的高通量细胞电融合装置，包括微孔阵列薄膜、分别与微孔阵列薄膜两面贴合的两个样品池、设在微孔阵列薄膜和两个样品池上面的盖片，其特征是：所述微孔阵列薄膜的中部设有微孔阵列、四角部分别设有一第一定位孔，两块电极板的下端分别穿过盖片插入两个样品池内。

进一步，所述两个样品池的形状及结构相同并左右对称，两个样品池内分别设有一用于加注细胞缓冲液的空腔和与空腔联通的凹槽，在两个样品池上面的角部分别设有两个第二定位孔；在两个样品池相对侧面的四个角部分别设有一个第三定位孔，这四个第三定位孔与微孔阵列薄膜上的四个第一定位孔一一对应，以实现两个样品池和微孔阵列薄膜在水平方向上的定位连接。

进一步，所述盖片的四个角部分别设有一个第四定位孔，这四个第四定位孔与两个样品池上面的四个第二定位孔一一对应，以实现两个样品池与盖片在竖直方向上的定位连接；在盖片上还设有两个相互对称的矩形槽口和两个相互对称的进/出样孔，两个矩形槽口分别与两个样品池内的凹槽一一对应，两个进/出样孔分别与两个样品池内的空腔一一对应。

进一步，所述两块电极板的下端分别穿过盖片上的两个矩形槽口并分别与两个样品池内的两个凹槽配合。

进一步，所述微孔阵列薄膜的厚度为3-5μm，长度为5cm，宽度为4cm，设在中部的，微孔阵列的区域面积为3.2cm                                                

2.8cm，区域面积上集成有800 700的微孔；微孔之间水平和垂直方向上间距均为40μm，微孔的直径小于待融合的细胞的最小直径，以保证细胞不能穿过微孔到对面的样品池中，达到不同细胞配对控制的目的。

微孔阵列薄膜的材料应选用生物相容性好、电绝缘性、韧度好的有机物材料，光敏多聚物材料最适合，可利用软光刻技术实现微孔阵列的高精度快速加工。

样品池在纵向剖面上与微孔阵列薄膜大小一致，长度为5cm，宽度为4cm，厚度为2cm；样品池内有一用于加注细胞缓冲液的空腔，空腔在纵向剖面尺寸应大于微孔阵列面积，长宽为3.3cm

2.5cm，空腔的厚度为0.5-2mm；同时，样品池内还有一个用于放置电极板的凹槽；凹槽纵向剖面尺寸为3.5cm

3cm，厚度为0.5mm；样品池的材料应选择具有良好生物相容性、电绝缘性、易加工、低成本的材料，如PMMA等材料，可通过机械加工成型。

盖片的厚度为2-3mm，面积为两个样品池和一层微孔阵列薄膜之和（5cm

4cm）；盖片上有两个进/出样孔，与用于加注细胞缓冲液的空腔对应，孔径为1mm；有两个用于露出电极板的矩形框，其尺寸为3.5cm

0.5mm；盖片材料可选择与样品池一致的具有良好生物相容性、电绝缘性、易加工、低成本的材料，如PMMA等材料，可通过机械加工成型。

电极板面积为3.5cm4cm，厚度为0.5mm，插入并固定于样品池内凹槽中，加载盖片电极板上端还将露出盖片0.7-0.8cm，可用于外界电信号与电极板的连接，便于加载电信号于装置内；电极板的材料应选择具有良好电导特性、生物相容性、抗氧化、抗腐蚀的金、铂、钛等材料。

本发明提出了一种基于微孔阵列薄膜的高通量细胞电融合装置。所述的基于微孔阵列薄膜的高通量细胞电融合装置由样品池、微孔阵列薄膜、盖片和电极板组成。微孔阵列薄膜置于两个样品池之间，三者通过螺栓紧密固定，并形成由微孔阵列薄膜隔离的两个样品池；电极板置于样品池的凹槽中，外部电信号可加载于电极板露出盖片的区域上，进而加载信号于两样品池中；盖片上有与两样品池对应的进/出样孔，以及与电极板对应的矩形孔，实现样品池的整体密封，进/出样和信号的加载。本发明通过微孔阵列薄膜将两样品池隔离，薄膜上的微孔改变了垂直方向上电场的分布，使得微孔内部区域的电场强度最高，进而可以利用介电电泳效应实现细胞向高电场区（微孔）运动，由于微孔的直径小于细胞的直径，两样品池中的细胞均不能穿过微孔，仅能在微孔侧面上形成细胞吸附，并在微孔中央与另一侧面所吸附的细胞形成细胞连接，进而达到细胞配对的目的；同时，由于细胞连接处处于微孔内部，进而细胞连接处电场强度也为最高，可实现微孔处配对细胞发生融合，而其他区域细胞不融合，提高融合效率，避免发生多细胞融合。此外，两电极板之间间距较短，有助于在低电压条件下实现电融合，而薄膜上大量集成的微孔可保证装置的高通量。此外，装置各部分的材料均具有良好生物相容性及抗腐蚀性能，这保证了装置的可靠性，也提高了细胞融合的安全性。该方法可广泛应用于遗传学、动植物远缘杂交育种、发育生物学、药物筛选、单克隆抗体制备、哺乳动物克隆等领域。

本发明具有如下优点：

（1）由于利用微加工技术加工集成了大量微孔的微孔阵列薄膜，利用微孔结构改变两电极板之间电场分布，使得微孔中央区域为整个通道中电场最高区域，一方面可利用介电电泳效应操控样品池中的细胞向高电场区运动，在微孔上吸附，又因为微孔的直径小于细胞的直径，故细胞无法穿过微孔，最终在微孔两侧都吸附一个细胞并在微孔中央形成细胞配对与连接；另一方面，由于形成细胞连接后，微孔中央区域仍然是电场最高区，在此区域发生细胞电融合几率最大，进而可通过调节电压控制细胞电融合，避免多细胞融合的发生，具有重要应用价值。

（2）具有良好的生物相容性及抗腐蚀性能，这保证了装置的可靠性，也提高了细胞融合的安全性。同时，微孔阵列薄膜上集成了大量的微孔阵列，可实现大量细胞的同时融合，融合效率高，融合通量高。

（3）加工过程简便，成本低廉，有助于细胞电融合技术的推广应用。

附图说明

图1 是本发明的总体示意图；

图2 是本发明的功能模块组装示意图；

图3 是微孔阵列薄膜的示意图；

图4 是样品池的示意图；

图5 是盖片的示意图；

图6-9 是本发明的工作原理图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明。

参见图1、图2、图3、图4和图5所示的基于微孔阵列薄膜的高通量细胞电融合装置，包括微孔阵列薄膜1、分别与微孔阵列薄膜1两面贴合的两个样品池2、设在微孔阵列薄膜和两个样品池上面的盖片3；

所述微孔阵列薄膜1的中部设有微孔5阵列、四角部分别设有一第一定位孔6，两块电极板4的下端分别穿过盖片3插入两个样品池2内。

进一步，所述两个样品池2的形状及结构相同并左右对称，两个样品池2内分别设有一用于加注细胞缓冲液的空腔7和与空腔联通的凹槽8，在两个样品池2上面的角部分别设有两个第二定位孔9；在两个样品池相对侧面的四个角部分别设有一个第三定位孔10，这四个第三定位孔与微孔阵列薄膜1上的四个第一定位孔6一一对应，以实现两个样品池和微孔阵列薄膜在水平方向上的定位连接。

进一步，所述盖片3的四个角部分别设有一个第四定位孔13，这四个第四定位孔与两个样品池上面的四个第二定位孔9一一对应，以实现两个样品池与盖片在竖直方向上的定位连接；在盖片3上还设有两个相互对称的矩形槽口11和两个相互对称的进/出样孔12，两个矩形槽口11分别与两个样品池2内的凹槽8一一对应，两个进/出样孔12分别与两个样品池2内的空腔7一一对应。

进一步，所述两块电极板4的下端分别穿过盖片3上的两个矩形槽口11并分别与两个样品池2内的两个凹槽8配合。

进一步，所述微孔阵列薄膜1的厚度为3-5μm，长度为5cm，宽度为4cm，设在中部的，微孔5阵列的区域面积为3.2cm

2.8cm，区域面积上集成有800

700的微孔5；微孔5之间水平和垂直方向上间距均为40μm，微孔5的直径小于待融合的细胞的最小直径。

基于微孔阵列结构的细胞电融合装置，其细胞电融合过程实施过程如下：

参见图1、图6、图7、图8和图9，细胞悬浮液A（内为A细胞）和细胞悬浮液B（内为B细胞）分别经过盖片3上的进样孔12注入样品池2的内部空腔7中。因为微孔阵列薄膜1上的微孔5直径小于A、B细胞的最小直径，故两种细胞均不能通过微孔5进入对方的空腔7中；加载正弦排队信号于两电极板4上，由于微孔5改变了两电极板4间的电场分布，微孔5内部的电场强度最高，在介电电泳效应的作用下，细胞将向高电场区运动，并在微孔5两侧各自吸附固定，由于微孔5直径小，厚度薄（3-5μm），A、B细胞将在微孔5中央形成一对一的细胞连接。加载脉冲穿孔信号于电极板4上，空腔7内部将产生高强度电场以实现细胞融合，同样因为微孔5内部电场分布的特异性，故仅能在微孔5中央的细胞连接处产生足够强度的膜电压差，进而实现微孔5中央连接处细胞的一对一融合，避免了多细胞融合的发生。完成融合后，加注PBS缓冲液于样品池2内，微孔5内的融合子将在负向介电电泳效应下从微孔5中脱离，进而可通过出样孔12收集，进而完成细胞电融合过程。

微孔阵列薄膜，其加工流程如下：

（1）    选择硅片作为基底；

（2）    通过蒸发沉积或溅射工艺在硅片表面形成一层厚度为500nm的铝膜（牺牲层）；

（3）    旋涂一层厚度为5-8微米的聚酰亚胺胶于铝膜表面；

（4）    利用光刻形成微孔阵列图形；

（5）    置于350°C环境下40分钟固化形成微孔阵列薄膜；

（6）    置于稀HCl溶液中腐蚀铝膜（牺牲层），释放微孔阵列薄膜。

Claims (5)

1.基于微孔阵列薄膜的高通量细胞电融合装置，包括微孔阵列薄膜（1）、分别与微孔阵列薄膜两面贴合的两个样品池（2）、设在微孔阵列薄膜和两个样品池上面的盖片（3），其特征是：所述微孔阵列薄膜（1）的中部设有微孔（5）阵列、四角部分别设有一第一定位孔（6），两块电极板（4）的下端分别穿过盖片（3）插入两个样品池（2）内。

2.根据权利要求1所述的基于微孔阵列薄膜的高通量细胞电融合装置，其特征是：所述两个样品池（2）的形状及结构相同并左右对称，两个样品池内分别设有一用于加注细胞缓冲液的空腔（7）和与空腔联通的凹槽（8），在两个样品池（2）上面的角部分别设有两个第二定位孔（9）；在两个样品池相对侧面的四个角部分别设有一个第三定位孔（10），这四个第三定位孔与微孔阵列薄膜上的四个第一定位孔（6）一一对应，以实现两个样品池和微孔阵列薄膜在水平方向上的定位连接。

3.根据权利要求1或2所述的基于微孔阵列薄膜的高通量细胞电融合装置，其特征是：所述盖片（3）的四个角部分别设有一个第四定位孔（13），这四个第四定位孔与两个样品池上面的四个第二定位孔（9）一一对应，以实现两个样品池与盖片在竖直方向上的定位连接；在盖片（3）上还设有两个相互对称的矩形槽口（11）和两个相互对称的进/出样孔（12），两个矩形槽口分别与两个样品池（2）内的凹槽（8）一一对应，两个进/出样孔分别与两个样品池（2）内的空腔（7）一一对应。

4.根据权利要求1、2或3所述的基于微孔阵列薄膜的高通量细胞电融合装置，其特征是：所述两块电极板（4）的下端分别穿过盖片（3）上的两个矩形槽口（11）并分别与两个样品池（2）内的两个凹槽（8）配合。

5.根据权利要求1、2、3或4所述的基于微孔阵列薄膜的高通量细胞电融合装置，其特征在是：所述微孔阵列薄膜（1）的厚度为3-5μm，长度为5cm，宽度为4cm，设在中部的，微孔（5）阵列的区域面积为3.2cm                                               

2.8cm，区域面积上集成有800

700的微孔（5）；微孔（5）之间水平和垂直方向上间距均为40μm，微孔（5）的直径小于待融合的细胞的最小直径。

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