CN110452807B - 一种向细胞递送目标分子的生物芯片及其制备方法和应用 - Google Patents

一种向细胞递送目标分子的生物芯片及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN110452807B
CN110452807B CN201910623229.3A CN201910623229A CN110452807B CN 110452807 B CN110452807 B CN 110452807B CN 201910623229 A CN201910623229 A CN 201910623229A CN 110452807 B CN110452807 B CN 110452807B
Authority
CN
China
Prior art keywords
biochip
cell
cells
array
electric field
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201910623229.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110452807A (zh
Inventor
常凌乾
郝永存
常洪龙
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Zaiyu Biotechnology Co.,Ltd.
Original Assignee
Beihang University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beihang University filed Critical Beihang University
Priority to CN201910623229.3A priority Critical patent/CN110452807B/zh
Publication of CN110452807A publication Critical patent/CN110452807A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110452807B publication Critical patent/CN110452807B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61M—DEVICES FOR INTRODUCING MEDIA INTO, OR ONTO, THE BODY; DEVICES FOR TRANSDUCING BODY MEDIA OR FOR TAKING MEDIA FROM THE BODY; DEVICES FOR PRODUCING OR ENDING SLEEP OR STUPOR
    • A61M37/00—Other apparatus for introducing media into the body; Percutany, i.e. introducing medicines into the body by diffusion through the skin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61M—DEVICES FOR INTRODUCING MEDIA INTO, OR ONTO, THE BODY; DEVICES FOR TRANSDUCING BODY MEDIA OR FOR TAKING MEDIA FROM THE BODY; DEVICES FOR PRODUCING OR ENDING SLEEP OR STUPOR
    • A61M37/00—Other apparatus for introducing media into the body; Percutany, i.e. introducing medicines into the body by diffusion through the skin
    • A61M2037/0007—Other apparatus for introducing media into the body; Percutany, i.e. introducing medicines into the body by diffusion through the skin having means for enhancing the permeation of substances through the epidermis, e.g. using suction or depression, electric or magnetic fields, sound waves or chemical agents

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Anesthesiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

一种向细胞递送目标分子的生物芯片及其制备方法和应用，所述生物芯片包括分子递送区域和NFC模块，所述分子递送区域和所述NFC模块设置在柔性基底上，其中所述分子递送区域包括在所述柔性基底上形成的微电极阵列，在所述微电极阵列上形成的微通道阵列以及所述微通道阵列上覆盖的纳米多孔膜，所述NFC模块包括NFC电路和天线，所述天线与所述NFC电路相连，所述NFC电路的一端与所述微电极阵列相连，另一端与所述柔性基底上的针电极相连。

Description

一种向细胞递送目标分子的生物芯片及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物芯片技术领域，具体为一种可直接贴皮并直接将目标分子递送到细胞内的生物医学纳米芯片及其制备方法和应用。
背景技术
基因治疗目前是治疗皮肤癌症的有效方法之一。该方法通过直接在皮肤细胞内导入外源性基因分子，改变胞内目标基因的表达，最终实现癌细胞死亡的目的；同时，基因分子对正常皮肤细胞不产生影响。在正常细胞环境中，这些外源性分子无法直接跨越细胞膜，进入细胞并产生作用。因此，基因治疗过程中最核心的问题是，如何实现快速、高效、安全地将基因分子直接在体导入到目标皮肤细胞中。
常见的在体基因转染技术，包括病毒载体、化学载体以及物理方法。病毒载体具有非常高(＞90％)的基因转染效率，但其自身基因片段亦会进入到目标细胞的细胞核内，并具有较高的表达可能性。因此，采用病毒载体进行基因转染，在临床实验中经常被报道引起癌变或副作用等问题。长久以来，该技术的安全性是阻碍其临床推广的根本原因。化学载体主要基于人工合成微纳米粒子，携带外源基因，通过人体长循环输送到目标器官，并通过细胞膜的内吞作用将基因分子控释到细胞内。化学方法对小分子量的分子有较高的转染效率，但对于大分子，例如DNA质粒，转染效率非常有限。此外，病毒载体和化学载体都容易导致基因在其他器官细胞内脱靶结合，引起细胞癌变等问题。
物理方法通过在细胞膜上施加物理场，如电、光、超声、机械力等，从而使细胞膜发生短暂、可逆地变形或破裂。富集于细胞外的基因分子通过浓度梯度，跨越细胞膜，进入到细胞内。相比病毒载体和化学载体，物理方法有两个明显优势。第一，操作更加简单直接，不需要修饰或改造基因分子，容易通过优化物理场提高转染效率。第二，可以直接将基因分子导入细胞内，无需像病毒或化学方法进入细胞后才能释放，从而有效促进了基因治疗的速度。特别是随着微纳米技术、微机电系统(MEMS)等学科与生物医学工程的交叉，进一步促进了相关技术的发展，使其在临床应用和市场化等方面具有更大的可能性。
目前，基于物理场的基因转染技术，绝大多数仅可用于离体细胞转染，在体基因转染仅见于电穿孔技术。然而，商业电穿孔仪器由于电极尺寸较大(毫米或厘米)，电场分布相对于单细胞而言完全随机，因此很难将电场精确汇聚到目标细胞上，对于大分子基因质粒，转染效率较低。此外，过高的电场强度容易产生热效应和离子失衡等问题，导致细胞死亡。近来，发明人设计了高通量、单细胞精度进行基因转染的3D纳米电穿孔芯片技术(3D NEP)，在离体细胞应用中，实现同时对百万级细胞的操纵和基因转染，在常规电穿孔技术很难转染的T细胞、心肌细胞中达到了90％以上的转染效率，明显优于商业电转染仪。3D NEP芯片还可以有效将大分子质粒直接递送到第一层皮肤的组织，观察到可以将表皮细胞重编程成诱导神经细胞。同时观察到，多次转染可刺激表皮细胞分泌带有外源基因的细胞外泌体，实现深层皮肤细胞的转染。该技术实现了在体原位的皮肤细胞基因转染和重编程，为在体基因治疗和再生医学提供了一种简单有效的方法。但是，该3D NEP硅基芯片用于在体基因转染实验存在诸多技术问题：(1)构建纳米级通道的硅芯片不可弯折，与皮肤的曲度兼容性较差；(2)易碎，重复使用效率较差；(3)无法封装基因溶液，需要消耗大量生物试剂；(4)采用投影光刻和DRIE技术制备的硅纳米芯片成本很高，不易开展大规模在体应用。
发明内容
为解决现有技术中存在的问题，本发明设计和制备了一种柔性的可以贴附于皮肤上的芯片系统，通过3D纳米电穿孔设计，并通过近场通讯(NFC)技术以无线的方式为电穿孔提供电场信号，可以更加直接、有效地在体进行大分子递送。
为了达到上述目的，一方面，本发明提供一种向细胞递送目标分子的生物芯片，包括分子递送区域和NFC模块，所述分子递送区域和所述NFC模块设置在柔性基底上，其中所述分子递送区域包括在所述柔性基底上形成的微电极阵列，在所述微电极阵列上形成的微通道阵列以及所述微通道阵列上覆盖的纳米多孔膜，所述NFC模块包括NFC电路和天线，所述天线与所述NFC电路相连，所述NFC电路的一端与所述微电极阵列相连，另一端与所述柔性基底上的针电极相连。
在一些实施例中，所述微通道阵列包括一个或多个分区，每个分区内的微通道相互连通。
在一些实施例中，各分区的一端与进液口相连，另一端与出液口相连。
在一些实施例中，所述微电极阵列中的微电极的尺寸为20μm×20μm-80μm×80μm。
在一些实施例中，所述柔性基底由聚酰亚胺(PI)、聚对苯二甲酸乙二酯(PET)、聚碳酸酯(PC)、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)或聚苯二甲酸乙二醇酯(PEN)等中的一种或多种组合制成。
在一些实施例中，所述纳米多孔膜的孔径为200-800nm，优选为400-600nm。
在一些实施例中，所述纳米多孔膜的孔密度为0.5×106-5×106个/cm2。
在一些实施例中，所述纳米多孔膜的厚度为1-20μm，例如5μm、10μm、15μm。
在一些实施例中，所述纳米多孔膜由聚酰亚胺(PI)、聚对苯二甲酸乙二酯(PET)、聚碳酸酯(PC)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)或聚苯二甲酸乙二醇酯(PEN)等中的一种或多种组合制成。
在一些实施例中，所述生物芯片还包括阻抗传感器，所述阻抗传感器与所述NFC电路相连。
另一方面，本发明还提出了一种所述生物芯片的制备方法，包括：
(1)通过光刻在柔性基底上形成微电极阵列、NFC电路和天线的图形；
(2)在所述柔性基底上形成金属层，除去光刻胶以形成微电极阵列、NFC电路和天线；
(3)在所述微电极阵列上涂布光刻胶并图案化以形成微通道阵列；
(4)在所述微通道阵列上覆盖纳米多孔膜。
在一些实施例中，所述纳米多孔膜的孔通过径迹刻蚀形成。
在一些实施例中，所述方法还包括在所述柔性基底上形成阻抗传感器的步骤。
又一方面，本发明还提供一种向细胞递送目标分子的装置，包括所述生物芯片和无线控制装置，所述无线控制装置用于产生控制信号并传输至所述生物芯片的NFC电路。
在一些实施例中，所述无线控制装置为移动通信终端或电信号发生器。
手机或者移动终端可以通过NFC技术，通过螺旋天线产生电压信号，并通过运算放大器，产生可以用于细胞电穿孔的电场。
又一方面，本发明还提供一种利用所述装置向细胞递送目标分子的方法，包括：
(1)使所述生物芯片纳米多孔膜与细胞互相接触；
(2)在所述生物芯片的进液口添加包含目标分子的溶液；
(3)利用所述无线控制装置发出控制信号以在所述针电极和所述微电极阵列之间产生电场，所述目标分子在电场作用下进入所述细胞。
在一些实施例中，所述目标分子包括药物、基因分子(例如DNA、质粒、siRNA、microRNA等)、蛋白、分子探针(例如分子信标等)、荧光量子点等中的一种或多种。
在一些实施例中，所述细胞为离体细胞或者在体细胞。
在一些实施例中，所述细胞包括皮肤细胞，例如表皮细胞、真皮细胞或粘膜。
在一些实施例中，所述电场的电压为1-50V，优选为10-30V。
又一方面，本发明还提供一种所述装置在基因调节、基因检测、蛋白表达检测、细胞器检测、分子检测中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明的生物芯片可以在单细胞精度上实现细胞膜穿孔和物质递送，递送到细胞的物质剂量可控，并且具有高递送效率(平均可达90％以上)、高细胞安全性(细胞安全性90％以上)和高通量(每一枚1cm2芯片可转染4万到10万细胞)的优点。
附图说明
图1为本发明实施例中向细胞递送目标分子的生物芯片：(a)芯片的三个功能模块；(b)芯片的两个功能模块具体设计图形(不包含阻抗传感器)；(c)加工流程中，微电极阵列、螺旋天线、NFC、以及阻抗传感器电极先通过光刻和溅射工艺制备，微通道阵列制备在微电极阵列上。
图2为本发明实施例中的生物芯片紧贴于皮肤上。
图3为本发明实施例中微通道阵列的进液口：(a)进液口和通道内的结构；(b)进液口处的微通道；(c)进液口。
图4为本发明实施例中的NFC模块：(a)采用手机或移动终端传输信号；(b)NFC电路连接和螺旋天线设计；(c)NFC工作原理图。
图5为本发明实施例中向皮肤细胞递送目标分子的流程：(a)芯片上纳米多孔膜上的纳米通道区域直接紧贴皮肤细胞，(b)在电场作用下，分子直接通过电穿孔和电泳作用递送到细胞内。
图6为本发明实施例中生物芯片的制备流程。
图7为本发明实施例中加工出的生物芯片：(a)覆盖纳米膜前的批量化加工的芯片图形；(b)微电极局部图；(c)覆盖纳米膜后的芯片图形；(d)微通道阵列。
图8为本发明实施例中切割后的独立芯片，其中下图左为微电极-微通道-纳米通道的结构(纳米通道为微通道方形区域中的点)；下图右为用作底电极的硅微针。
图9为本发明实施例中利用生物芯片递送达卡巴嗪的结果。
图10为本发明实施例中利用生物芯片进行细胞基因转染的结果。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。
本发明提出的向细胞递送目标分子的生物芯片，基于一种特殊的“微电极阵列-微流通道-纳米通道”3D微纳米结构，通过纳米通道，可以精确地将电场聚焦于细胞膜上，并进行安全有效地电穿孔，同时在接触细胞的纳米通道内产生电泳，将目标分子递送到细胞中(如图1所示)。
本发明所述的目标分子可以为大分子，例如基因(DNA、RNA)和蛋白质等。本发明所述的细胞可以为皮肤细胞等任何细胞，例如表皮细胞、真皮细胞以及粘膜等。所述的细胞可以为离体细胞或者在体细胞。
本发明所述的生物芯片制备在柔性材料上，具有良好的柔性和可穿戴性。
本发明所述的电场，通过生物芯片上的近场通讯(NFC)模块提供，实现无线电场控制。
实施例1生物芯片
如图1所示，在该实施例中，生物芯片包含(1)分子递送区域；(2)NFC模块；以及可选的(3)阻抗传感器。分子递送区域、NFC模块和阻抗传感器可以直接构建在柔性基底上，因而可以弯折并直接贴附在皮肤上(去除角质和死皮后)(图2)。
柔性基底的材料可以选自柔性聚合物材料，例如聚酰亚胺(PI)、聚对苯二甲酸乙二酯(PET)、聚碳酸酯(PC)或聚二甲基硅氧烷(PDMS)等，其中聚酰亚胺可以为热塑性聚酰亚胺或包含聚酰亚胺的材料，例如：APICALTM；apoly-氧二亚苯基-均苯四甲酰亚胺，或KAPTONTM；联苯四羧酸二酐(BPDA)聚合物，或VTECPITM；NORTONTHTM；KAPTREXTM等。
(1)分子递送区域
分子递送区域包括微电极阵列、微通道阵列和纳米多孔膜，其中微电极阵列直接形成在柔性基底上，可以由Cr/Au纳米镀层形成(可以使用的金属还包括：Pt，Ni，Ti，Ag等)。每个微电极的尺寸可以为20μm×20μm-80μm×80μm，例如50μm×50μm，各微电极之间相互连接。
微通道阵列形成在微电极阵列上方，并与微电极阵列上下对齐。根据需要，微通道阵列可以分为一个或多个分区，用于向靶细胞递送一种或多种目标分子，每个分区内的微通道相互连通。如图1和3所示，每个分区包括一个进液口和一个出液口(图1b中所示分子递送区域的圆孔)，进液口用于添加包含待递送目标分子的溶液(通常为亲水性溶液)，出液口位于微通道阵列的另一端，用于排出所述溶液，形状可以与进液口相同。包含待递送目标分子的溶液可以通过虹吸作用经进液口填充满所有微通道。
例如，在本发明的一些实施例中，生物芯片包含一个分区，一种或多种待递送目标分子可以一次性递送到靶细胞中，或者通过多次操作，将多种待递送目标分子分别递送到靶细胞中。在本发明的另一些实施例中，生物芯片包含多个分区，包含不同待递送目标分子的溶液分别添加到不同的进液口并递送到靶细胞中。
纳米多孔膜覆盖在微通道阵列上，例如可以直接通过热压键合粘贴在微通道上方。纳米多孔膜用于提供纳米通道，孔径为200-800nm，优选为400-600nm，孔密度可以为0.5×106-5×106个/cm2，厚度可以为1-20微米，例如5μm、10μm、15μm。
(2)NFC模块
如图1所示，NFC模块包括NFC电路和天线，天线可以为螺旋天线，用于接收无线信号。天线与NFC电路相连，NFC电路的一端与微电极阵列相连，另一端与柔性基底上作为底电极的针电极相连。
针电极直接固定或附着在柔性基底上，可以为金针或纳米尖刺电极，任选地具有金属针(指所有可以微创到皮下的微针)，其直径约为0.5mm至1mm，一端连接NFC电路，另一端直接置于皮肤细胞下方。如图7所示，在一些实施例中，针电极为采用硅基加工工艺制作的硅微针阵列。
NFC模块的工作流程如下：
手机或其他移动终端产生信号并产生电磁场(图4a)；该电磁场被NFC电路连接的螺旋天线接收并在NFC电路上感应出电流(图4b)，通过整流放大以及模数转换模块，产生可用于电穿孔的电场信号(图4c)，例如方波电压，产生的电场信号直接输出到底电极和微电极阵列，为细胞电穿孔提供电场调节和输出。
NFC模块中的所有信号处理放大器、混频器、移相器、低通滤波器、模数转换器等模块使用市售商品，采用标准130nm互补金属氧化物半导体(CMOS)工艺。
在一些实施例中，NFC模块的工作频率是13.56MHz，LC谐振电路在13.56MHz谐振，基于二极管的整流器和电容器可降低直流电压下的纹波输出。模数转换器CMOS芯片为1.5mm×1.5mm，芯片使用3mm×3mm四方扁平无引线(QFN)封装。
在一些实施例中，在使用该生物芯片递送目标分子时，纳米多孔膜直接贴附于皮肤上，针电极尖端埋在皮肤或者粘膜下，作为电场的底电极，微电极阵列作为顶电极，从顶电极到底电极的电场由NFC电路提供。
纳米通道具有较大的等效电阻，可以将电场线聚焦于细胞上很小的区域，使得在细胞膜上安全并且有效地产生电穿孔效应；同时，纳米通道两端的高电场产生强电泳作用，使待递送目标分子(例如表面带电荷的核酸或蛋白等)迅速进入到细胞内，如图5所示。
(3)阻抗传感器
在一些实施例中，生物芯片还包括形成在柔性基底上的阻抗传感器，阻抗传感器与NFC电路连接，可以将检测到的皮肤阻抗值传送至手机或其他移动终端，以便于实时检测皮肤和芯片的贴附情况。阻抗传感器可以采用常见的电极，直接紧贴皮肤后，检测皮肤阻抗值，工作频率可以为100KHz。
实施例2制备生物芯片的流程方案
如图6所示，在本发明的一些实施例中，生物芯片的制备流程包括以下步骤：
(a)在衬底1(例如硅晶圆)上涂覆用于粘合柔性基底的粘合剂层2，例如包含聚合有机硅化合物的胶体聚二甲基硅氧烷(PDMS)或等同物；
(b)将柔性基底3(例如聚酰亚胺薄膜)粘合到粘合剂层2上，然后进行热处理。例如，在真空低于～1kPa，温度约为60℃至80℃之间，粘合时间约1小时至3小时；
(c)在柔性基底3上通过匀胶仪涂覆光刻胶4(例如EPI 680TM(Everlight化学，中国台湾))，光刻胶的厚度约2μm至4μm，图案化形成微电极、NFC电路、超薄磁螺旋天线、阻抗传感器图形；
(d)在柔性基底3上形成金属层5，例如溅射铬和金(Cr/Au溅射层)，Cr层介于约20nm至50nm，Au层介于约200nm至500nm。金属层还可以通过气相沉积(例如电子束蒸镀、热蒸镀)等方法形成；
(e)在丙酮或等同物中溶解光刻胶约10分钟至30分钟，以除去光刻胶，形成微电极阵列、NFC电路、超薄磁螺旋天线、阻抗传感器。微电极阵列、超薄磁螺旋天线和阻抗传感器分别连接到NFC电路。每一个微电极尺寸为50μm×50μm(图7a，7b)；
(f)在微电极阵列上甩涂50μm厚度的光刻胶4(例如AZ P4620)并图案化微通道阵列。每一个微通道区域为50μm×50μm，通道内微型圆柱直径为5μm(图7c，7d)，微通道阵列有一个出口和一个入口。目标分子溶液可以通过虹吸作用经入口填充满所有通道；
(g)在微通道上通过热压键合方式粘贴径迹刻蚀的纳米多孔膜6。纳米多孔膜可以为10μm厚度的聚酰亚胺膜，或者是PC膜，或者是PET膜。刻蚀的纳米通道直径约为600nm；
(h)从衬底1上直接用手剥离柔性基底3。
在本发明的另一些实施例中，步骤(g)和(h)的顺序可以互换，即从衬底1上剥离柔性基底3后，再通过热压键合方式粘贴径迹刻蚀的纳米多孔膜6。
在本发明的另一些实施例中，可以在一柔性基底上批量形成多个生物芯片，然后再切割得到独立的多个生物芯片(如图7和8所示)。
实施例3利用生物芯片向细胞递送达卡巴嗪(dacarbazine)
在递送达卡巴嗪实验中，恶性黑色素瘤细胞(例如A375细胞)通过培养，安置在芯片的纳米孔膜上。为防止细胞漏液，纳米孔膜周围采用PDMS构建一个空腔，细胞液和细胞静置其中。经过一夜的培养后，细胞紧贴于纳米孔上。
进行电穿孔实验时，将5μM浓度的达卡巴嗪溶液通过芯片进样口，填充整个微通道阵列内。由于本次实验为离体细胞实验，采用一枚铂金电极静置于细胞溶液内作为底电极，铂金电极和微电极阵列分别连接商用电信号发生器(例如，BioRad Gene Pulser的PowerStation等)。电穿孔使用的方波电压信号为0-25V，20ms。结果如图9a所示，采用本发明的生物芯片可以达到90％以上的癌细胞抑制效率，明显高于采用商业化的脂质体(Lipofectamine 2000)和通过药物自由扩散进行给药的方法。比较发现，直接采用本发明的生物芯片递送达卡巴嗪，和采用本发明的生物芯片递送达卡巴嗪后，再温育一夜，最终的细胞抑制效率无明显差异。这说明通过本发明的生物芯片进行递送是药物进入细胞的主要方式，后续通过药物扩散进入细胞的作用可忽略(图9b)。特别地，通过调控方波电压，可以控制导入细胞的药物剂量，从而调控细胞的抑制效率(图9c)。
实施例4利用生物芯片进行细胞基因转染
CRISPR-Cas9系统目前已成为基因编辑的主要平台，编码CRISPR-Cas9的质粒序列超过9k。现有的非病毒递送手段在递送CRISPR-Cas9时效率较低。本发明递送了商业化的CRISPR-Cas9质粒进入A375细胞。细胞操作和实施例3一致。100nM浓度的CRISPR-Cas9质粒填充到芯片的微通道内。电穿孔使用的方波电压信号为25V，20ms。如图10所示，通过荧光蛋白表达量比较，本发明的生物芯片的转染效率远高于商业化电转染技术(＞90％vs.～20％)。
在本发明的另一些实施例中，将本发明的生物芯片贴附于皮肤上，然后利用手机或者移动终端通过NFC技术由螺旋天线产生电压信号，并通过运算放大器，产生可以用于细胞电穿孔的电场，从而可以进行目标分子的在体递送(如图2所示)，获得了与上述离体递送相同的效果。
本发明的生物芯片可用于递送蛋白、基因和药物等，以实现细胞内基因的调节；还可以用于递送分子探针、荧光量子点等，以检测细胞内基因、信使RNA、蛋白的表达情况，或者检测细胞内其他目标细胞器、分子等。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明。应注意的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明。凡在本发明的主旨和原则的基础上，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (26)

1.一种向细胞递送目标分子的生物芯片，包括分子递送区域和NFC模块，所述分子递送区域和所述NFC模块设置在柔性基底上，其中所述分子递送区域包括所述柔性基底上形成的微电极阵列，所述微电极阵列上形成的微通道阵列以及所述微通道阵列上覆盖的纳米多孔膜，所述NFC模块包括NFC电路和天线，所述天线与所述NFC电路相连，所述NFC电路的一端与所述微电极阵列相连，另一端与所述柔性基底上的针电极相连，所述针电极的尖端埋在皮肤或者粘膜下，作为电场的底电极，所述微电极阵列作为顶电极，在两电极间形成电场，利用所述纳米孔膜将电场聚焦于细胞膜上导致细胞膜在电场作用下穿孔，同时，所述目标分子在电场作用下穿过所述纳米多孔膜进入所述细胞。
2.根据权利要求1所述的生物芯片，其中，所述微通道阵列包括一个或多个分区，每个分区内的微通道相互连通。
3.根据权利要求2所述的生物芯片，其中，各分区的一端与进液口相连，另一端与出液口相连。
4.根据权利要求1所述的生物芯片，其中，所述微电极阵列中的微电极的尺寸为20μm×20μm-80μm×80μm。
5.根据权利要求1所述的生物芯片，其中，所述柔性基底由聚酰亚胺(PI)、聚对苯二甲酸乙二酯(PET)、聚碳酸酯(PC)、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)或聚苯二甲酸乙二醇酯(PEN)中的一种或多种组合制成。
6.根据权利要求1所述的生物芯片，其中，所述纳米多孔膜的孔径为200-800nm。
7.根据权利要求1所述的生物芯片，其中，所述纳米多孔膜的孔径为400-600nm。
8.根据权利要求1所述的生物芯片，其中，所述纳米多孔膜的孔密度为0.5×106-5×106个/cm2。
9.根据权利要求1所述的生物芯片，其中，所述纳米多孔膜的厚度为1-20μm。
10.根据权利要求1所述的生物芯片，其中，所述纳米多孔膜的厚度为5μm、10μm或15μm。
11.根据权利要求1所述的生物芯片，其中，所述纳米多孔膜由聚酰亚胺(PI)、聚对苯二甲酸乙二酯(PET)、聚碳酸酯(PC)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)或聚苯二甲酸乙二醇酯(PEN)中的一种或多种组合制成。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的生物芯片，其中，所述生物芯片还包括阻抗传感器，所述阻抗传感器与所述NFC电路相连。
13.一种权利要求1-12任一项所述生物芯片的制备方法，包括：
(1)通过光刻在柔性基底上形成微电极阵列、NFC电路和天线的图形；
(2)在所述柔性基底上形成金属层，除去光刻胶以形成微电极阵列、NFC电路和天线；
(3)在所述微电极阵列上涂布光刻胶并图案化以形成微通道阵列；
(4)在所述微通道阵列上覆盖纳米多孔膜。
14.根据权利要求13所述的制备方法，其中，所述纳米多孔膜的孔通过径迹刻蚀形成。
15.根据权利要求13所述的制备方法，其中，所述方法还包括在所述柔性基底上形成阻抗传感器的步骤。
16.一种向细胞递送目标分子的装置，包括权利要求1-12任一项所述生物芯片和无线控制装置，所述无线控制装置用于产生控制信号并传输至所述生物芯片的NFC电路。
17.根据权利要求16所述的装置，其中，所述无线控制装置为移动通信终端或电信号发生器。
18.一种利用权利要求16或17所述装置向细胞递送目标分子的方法，所述方法用于非治疗目的，包括：
(1)使所述生物芯片的纳米多孔膜与细胞互相接触；
(2)在所述生物芯片的进液口添加包含目标分子的溶液；
(3)利用所述无线控制装置发出控制信号以在所述针电极和所述微电极阵列之间产生电场，所述目标分子在电场作用下进入所述细胞。
19.根据权利要求18所述的方法，其中，所述目标分子包括药物、核酸、蛋白、分子探针和荧光量子点中的一种或多种。
20.根据权利要求19所述的方法，其中，所述核酸包括DNA、质粒、siRNA或microRNA，所述分子探针包括分子信标。
21.根据权利要求18或19所述的方法，其中，所述细胞为离体细胞或者在体细胞。
22.根据权利要求18或19所述的方法，其中，所述细胞包括皮肤细胞。
23.根据权利要求18或19所述的方法，其中，所述细胞包括表皮细胞、真皮细胞或粘膜细胞。
24.根据权利要求18所述的方法，其中，所述电场的电压为1-50V。
25.根据权利要求18所述的方法，其中，所述电场的电压为10-30V。
26.一种权利要求16或17所述装置在基因调节、基因检测、蛋白表达检测、细胞器检测、分子检测中的应用，所述应用用于非治疗目的。
CN201910623229.3A 2019-07-10 2019-07-10 一种向细胞递送目标分子的生物芯片及其制备方法和应用 Active CN110452807B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910623229.3A CN110452807B (zh) 2019-07-10 2019-07-10 一种向细胞递送目标分子的生物芯片及其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910623229.3A CN110452807B (zh) 2019-07-10 2019-07-10 一种向细胞递送目标分子的生物芯片及其制备方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110452807A CN110452807A (zh) 2019-11-15
CN110452807B true CN110452807B (zh) 2020-09-25

Family

ID=68482563

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910623229.3A Active CN110452807B (zh) 2019-07-10 2019-07-10 一种向细胞递送目标分子的生物芯片及其制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110452807B (zh)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111068179B (zh) * 2020-01-06 2021-10-22 浙江大学 一种柔性无源无线电刺激贴片及方法
CN112226365A (zh) * 2020-10-13 2021-01-15 北京航空航天大学 基于单细胞阵列的纳米电穿孔装置及其应用
CN113832192A (zh) * 2021-09-08 2021-12-24 上海盟德生物科技有限公司 一种将外源性物质导入细胞的装置和方法
CN114544721A (zh) * 2022-02-24 2022-05-27 中山大学 柔性微纳电极传感器及其制备方法
CN114636744A (zh) * 2022-03-09 2022-06-17 中山大学 基于纳米多孔膜的微电极阵列芯片及高通量细胞内电信号连续监测系统
CN115120859B (zh) * 2022-05-18 2024-04-26 华南师范大学 一种高通量纳米电穿孔-纳米基因融合芯片及其制法和用途

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102296028A (zh) * 2011-09-08 2011-12-28 岭南大学校产学协力团 基于微孔微电极阵列的高通量细胞电融合微流控芯片装置
CN102321536A (zh) * 2011-09-30 2012-01-18 岭南大学校产学协力团 基于微孔阵列薄膜的高通量细胞电融合装置

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8828736B2 (en) * 2010-07-02 2014-09-09 Sandia Corporation Microelectroporation device for genomic screening

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102296028A (zh) * 2011-09-08 2011-12-28 岭南大学校产学协力团 基于微孔微电极阵列的高通量细胞电融合微流控芯片装置
CN102321536A (zh) * 2011-09-30 2012-01-18 岭南大学校产学协力团 基于微孔阵列薄膜的高通量细胞电融合装置

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Single Cell Electroporation-Current Trends, Applications and Future prospects;Srabani Kar et al;《J. Micromech. Microeng》;20181231;第1-58页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN110452807A (zh) 2019-11-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110452807B (zh) 一种向细胞递送目标分子的生物芯片及其制备方法和应用
Chang et al. 3D nanochannel electroporation for high-throughput cell transfection with high uniformity and dosage control
Kim et al. Electroporation for nanomedicine: a review
Wang et al. Micro-/nanofluidics based cell electroporation
Chang et al. Micro-/nanoscale electroporation
Huang et al. On-demand intracellular delivery of single particles in single cells by 3D hollow nanoelectrodes
Xie et al. Nanostraw–electroporation system for highly efficient intracellular delivery and transfection
Yang et al. Micro-/nano-electroporation for active gene delivery
Liu et al. High-throughput and self-powered electroporation system for drug delivery assisted by microfoam electrode
Sun et al. Recent advances in micro/nanoscale intracellular delivery
Dong et al. On-chip multiplexed single-cell patterning and controllable intracellular delivery
Santra et al. Nano-localized single-cell nano-electroporation
Lee et al. Review of micro/nano technologies and theories for electroporation of biological cells
Xuan et al. Fabrication and use of silicon hollow-needle arrays to achieve tissue nanotransfection in mouse tissue in vivo
CN108531396A (zh) 一种用于细胞转染的微流控芯片
WO2007053802A2 (en) Drug and gene delivery by polymer nanonozzle and nanotip cell patch
Huang et al. Continuous vector-free gene transfer with a novel microfluidic chip and nanoneedle array
Zhao et al. Photothermal intracellular delivery using gold nanodisk arrays
Dong et al. Recent electroporation-based systems for intracellular molecule delivery
US20160017370A1 (en) Device for intracellular delivery and a method thereof
Chakrabarty et al. Combinatorial physical methods for cellular therapy: towards the future of cellular analysis?
WO2002058847A9 (en) Cell transformation using a single chip silicon microfabricated array incorporating integrated micro-piercing injectors
Huang et al. Transdermal delivery of nucleic acid mediated by punching and electroporation
EP3880295B1 (en) Device for tissue electrotransfer using a microelectrode
Dey et al. Microfluidic electroporation and applications

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20220106

Address after: 518110 b214, building 1, Yinxing Zhijie phase II, No. 1301-76, sightseeing Road, Xinlan community, Guanlan street, Longhua District, Shenzhen, Guangdong

Patentee after: Shenzhen Zaiyu Life Science Technology Co.,Ltd.

Address before: 100083 No. 37, Haidian District, Beijing, Xueyuan Road

Patentee before: BEIHANG University

TR01 Transfer of patent right
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20220225

Address after: 101300 room 217, floor 2, building 7, courtyard 14, Shunyi Avenue, Shunyi District, Beijing

Patentee after: Beijing Zaiyu Biotechnology Co.,Ltd.

Address before: 518110 b214, building 1, Yinxing Zhijie phase II, No. 1301-76, sightseeing Road, Xinlan community, Guanlan street, Longhua District, Shenzhen, Guangdong

Patentee before: Shenzhen Zaiyu Life Science Technology Co.,Ltd.

TR01 Transfer of patent right