CN115120859B - 一种高通量纳米电穿孔-纳米基因融合芯片及其制法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高通量纳米电穿孔/纳米基因融合芯片及其制备方法和用途，该芯片至少包括五层材料；位于所述芯片中间的一层材料是硅晶片；所述硅晶片的一面带有纳米通道和微帽结构，所述硅晶片的另一面带有微圆储层阵列；每一个微圆储层结构与其背面的纳米通道是一一对应的关系；位于所述芯片两端的材料是电极；其中的一个电极连接阳离子脂质聚合物杂化纳米粒；位于所述硅晶片与电极之间的是软体孔板；其中，朝向纳米通道和微帽阵列的软体孔板是介质储存层，朝向微圆储层阵列的是药物储存层。本发明芯片能够在单细胞水平上更集中、更精确地递送生物分子，从而使其成为基因转染的得力工具。
Description
技术领域
本发明涉及一种高通量纳米电穿孔-纳米基因融合芯片及其制备方法和用途。
背景技术
细胞疗法通过将治疗基因导入靶细胞，为癌症、血液系统恶性肿瘤、自身免疫性疾病和受损组织治疗提供了新的理念和方法，具有常规药物无法实现的疗效。
限制细胞疗法发展的一个因素是，缺乏即时和精确的功能性基因或药物递送系统和方法。目前细胞疗法主要依靠病毒载体(AAV、腺病毒、逆转录病毒等)进行基因传递，其过程具有高度随机性，会导致炎症反应或细胞死亡。此外，传递的基因数量受到病毒载体大小和丰度的限制，每个病毒递送的基因数量并不均等，对精准传递提出了挑战。此外，病毒载体生产过程复杂，极大地限制了细胞疗法的发展。
细胞疗法发展的另一个限制是，没有用于转染细胞基因表达分析的即时的、准确的检测方法。当前基于qRT-PCR、下一代测序、流式细胞术和基因表达微阵列的分子检测涉及多个步骤，包括细胞培养、外泌体收集、RNA分离、扩增、荧光标记、杂交和数据分析。在目前的技术阶段，在几个小时内完成整个过程是不可能的。外泌体包含细胞的许多成分，包括DNA、RNA、脂质、代谢物以及细胞溶质和细胞表面蛋白质。最近的研究表明外泌体中特定细胞成分的功能性、靶向性、机制驱动的积累，表明它们在调节细胞间通讯中发挥作用。
发明内容
为了克服基于传统方法的病毒转染的低效率和评估方法的不精确性，本发明的目的在于提供一种高通量纳米电穿孔-纳米基因融合芯片及其制备方法和用途，从而实现在单细胞水平实现精确剂量递送和细胞分泌外泌体中的基因准确分析。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种高通量纳米电穿孔-纳米基因融合芯片，至少包括五层材料；
位于芯片中间(中央)的一层材料是硅晶片；
所述硅晶片的一面带有纳米通道和微帽结构，每片硅晶片上有几万个纳米通道和微帽结构，每个微帽结构中有一个纳米通道，纳米通道位于微帽结构中央；在使用时，单细胞被困在“U形”微帽中，细胞贴壁部分与纳米通道接触，对纳米通道阵列施加高强度和聚焦的电场，从而在细胞膜表面打开纳米级空洞，通过电泳将生物分子(功能性基因或药物)直接递送进细胞；
所述硅晶片的另一面带有微圆储层阵列；每一个微圆储层结构与其背面的纳米通道是一一对应的关系；
位于芯片两端的材料是电极，优选ITO(氧化铟锡)和金(Au)纳米镀层电极；
其中的一个电极连接阳离子脂质聚合物杂化纳米粒；
所述的阳离子脂质聚合物杂化纳米粒包裹由两个发夹DNA(CHDC-H1和CHDC-H2)和一个修饰荧光基团和淬灭基团的DNA报告分子组成的催化电路(CHDC)；转染细胞分泌的带有负电荷的外泌体将通过静电作用和脂质融合被阳离子脂质聚合物杂化纳米粒捕获，封装在其中的CHDC识别外泌体中的靶标核酸并产生荧光信号；
所述的发夹DNA是依据外泌体中的靶标RNA设计的；当纳米粒与外泌体融合形成一个纳米级复合物后，外泌体内部的目标RNA就会引发CHDC-H1和CHDC-H2的催化反应，其产物切割DNA报告分子，使得荧光基团和淬灭基团分开，产生荧光。
位于硅晶片与电极之间的是软体孔板；其中，朝向纳米通道和微帽阵列的软体孔板是介质储存层，朝向微圆储层阵列的是药物储存层。
优选地，所述硅晶片的厚度为100-300微米。
优选地，所述纳米通道直径为100-800纳米。
优选地，所述微圆储层结构直径为30-100微米。
优选地，所述微帽的宽度为5-15微米，微帽凸起的高度为5-10微米。
优选地，所述的软体孔板为聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚苯醚(PPO)或其它工程塑料。
上述芯片的制备方法，包括以下步骤：
(1)使用光刻胶在硅晶片的一面图案化纳米通道阵列，使用深反应离子蚀刻钻出5-50μm深的纳米通道；然后使用光刻胶在硅晶片的另一面图案化微圆储层阵列，应用深反应离子蚀刻直到微圆储层结构与纳米通道连通；
(2)在纳米通道阵列上使用光刻胶制造微帽结构，微帽结构凸起的高度为5-10微米，微帽结构与纳米通道对齐，得到带有纳米通道与微帽阵列的硅晶片；
(3)将两片镀有氧化铟锡的玻璃片用UV/O3活化5分钟以上，然后转移到具有MPTMS蒸气的真空室中10分钟以上；通过电子束蒸发器将具有MPTMS层的玻璃片进一步沉积金纳米层，制备氧化铟锡和金纳米镀层电极；
(4)将步骤(3)所得氧化铟锡和金纳米镀层电极与软体孔板结合，加入包裹CHDC的纳米粒悬浮液，洗去电极表面未连接的纳米粒，得到介质储存层和电极层；
(5)使用前，将药物加入药物储存层，之后将电极层封装药物储存层；将细胞培养基加入介质储存层，最后组装，得到高通量纳米电穿孔-纳米基因融合芯片；
优选地，所述玻璃片的厚度为0.1-0.5毫米。
优选地，所述金纳米层厚度为5-50纳米。
上述芯片可以用于药物的递送以及对递送效果做出评估，具体包括以下步骤：
(1)将硅晶片浸入含有待治疗细胞的溶液中，浸渍后缓慢提起硅晶片；之后，将介质储存层和药物储存层组装在硅晶片的两侧；将药物加入药物储存层，之后将电极层封装药物储存层，将细胞培养基加入介质储存层，最后组装；
(2)将上述芯片于25-37℃、99％以上相对湿度、黑暗下孵育至少3小时，然后将芯片连接外部电场，使用荧光显微镜记录和分析；
所述的外部电场优选200V脉冲电场。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
1、与传统的细胞应激反应(如饥饿、缺氧和热处理)相比，本发明芯片的纳米通道增强了电场强度，分泌的外泌体增加了10倍以上，具有相似的囊泡大小分布。
2、与病毒转染和批量电穿孔相比，本发明芯片能够在单细胞水平上更集中、更精确地递送生物分子，从而使其成为基因转染的得力工具。
3、本发明芯片通过仅持续数秒的一次性治疗引发有利的生物反应，并在3小时内完成准确的基因分析，可在细胞疗法的质量评估中找到广泛的应用。
附图说明
图1为本发明高通量纳米电穿孔-纳米基因融合芯片的结构和组成示意图；
图2为本发明高通量纳米电穿孔-纳米基因融合芯片的硅晶片的局部放大图；
其中，1-电极层，2-药物储存层，3-硅晶片，4-纳米通道，5-微帽结构，6-微圆储层，7-介质储存层，8-电极层。
图3为实施例2使用PBS、抗miR-17和PBS处理的THLE-2外泌体(左列)、Hep3B外泌体(中列)和Hep3B外泌体(右列)中miR-17、BTG3 mRNA和TGFBR2 mRNA表达的TIRF图像。
图4为实施例2使用不同剂量处理的基因表达的3维点图。
图5为实施例3使用空ALN、ALN-DOX和空ALN处理的HBEC外泌体(左列)、A549外泌体(中列)和A549外泌体(右列)中miR-21、miR-155和EGFR mRNA表达的TIRF图像。
图6为实施例3使用不同剂量治疗的基因表达的3维点图。
图7为实施例4使用高通量纳米电穿孔-纳米基因融合芯片在受激细胞分泌的外泌体中进行基因表达分析的实时测量。
图8为实施例4使用不同治疗方式对细胞活性的差异分析。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
一种高通量纳米电穿孔-纳米基因融合芯片，其结构和组成示意图如图1和图2所示，包括五层材料；
位于芯片中间(中央)的一层材料是硅晶片3；
所述硅晶片3的一面带有纳米通道4和微帽结构5，每片硅晶片3上有几万个纳米通道4和微帽结构5，每个微帽结构5中有一个纳米通道4，纳米通道4位于微帽结构5中央；
所述硅晶片3的另一面带有微圆储层阵列6；每一个微圆储层6与其背面的纳米通道4是一一对应的关系；
位于芯片两端的材料是氧化铟锡(ITO)和金(Au)纳米镀层电极1；
其中的一个电极表面连接阳离子脂质聚合物杂化纳米粒；
所述的阳离子脂质聚合物杂化纳米粒包裹由两个发夹DNA(CHDC-H1和CHDC-H2)和一个修饰荧光基团和淬灭基团的DNA报告分子组成的催化电路(CHDC)；所述的发夹DNA是依据外泌体中的靶标RNA设计的；当纳米粒与外泌体融合形成一个纳米级复合物后，外泌体内部的目标RNA就会引发CHDC-H1和CHDC-H2的催化反应，其产物切割DNA报告分子，使得荧光基团和淬灭基团分开，产生荧光。
位于硅晶片3与电极之间的是软体孔板(2和7)；其中，朝向纳米通道4和微帽阵列5的软体孔板是介质储存层7，朝向微圆储层阵列6的是药物储存层2。
上述芯片的制备方法，包括以下步骤：
(1)使用光刻胶在硅晶片(厚度250微米)的一面图案化纳米通道(直径约500nm)阵列，使用深反应离子蚀刻钻出约10μm深的纳米通道；然后使用光刻胶在硅晶片的另一面图案化微圆储层阵列(直径约50微米)，应用深反应离子蚀刻直到微圆储层结构与纳米通道连通；
(2)在纳米通道阵列上使用光刻胶制造微帽结构(宽度10微米)，微帽结构凸起的高度为5-10微米，微帽结构与纳米通道对齐，得到带有纳米通道与微帽阵列的硅晶片；
(3)将两片镀有氧化铟锡的玻璃片用UV/O3活化5分钟，然后转移到具有MPTMS蒸气的真空室中10分钟；通过电子束蒸发器将具有MPTMS层的玻璃片进一步沉积金纳米层(厚度约30纳米)，制备氧化铟锡和金纳米镀层电极；
(4)将步骤(3)所得氧化铟锡和金纳米镀层电极与软体孔板结合，加入包裹CHDC的纳米粒悬浮液，洗去电极表面未连接的纳米粒，得到介质储存层和电极层；
(5)使用前，将药物加入药物储存层，之后将电极层封装药物储存层；将细胞培养基加入介质储存层，最后组装，得到高通量纳米电穿孔-纳米基因融合芯片。
实施例2
以抗miR-17来抑制人肝细胞癌(HCC)肿瘤中高表达的miR-17
由于BTG3和TGFBR2 mRNA是miR-17家族的潜在靶标，因此它们在HCC中的表达下调。
首先，将硅晶片浸入细胞溶液(106细胞/mL)中，每次5分钟，浸渍后，用镊子缓慢提起硅晶片。之后，将介质储存层和药物储存层组装在硅晶片的两侧。将抗miR-17(5’-cuaccugcacuguaagcacuuug-3’)溶液加入基因/药物储存层并覆盖电极层，将支气管上皮生长培养基(Lonza)或Eagle培养基(ATCC)加入介质储存层并覆盖纳米基因与电极复合层。随后，使用200V脉冲电场强度将抗miR-17输送到细胞中。在测量前将芯片在37℃和99％相对湿度下黑暗中孵育3小时。最后，使用全内反射荧光(TIRF)显微镜记录和分析样品图像。
作为治疗基因的抗miR-17寡核苷酸储存在芯片的药物储存层中，单个Hep3B肝癌细胞或THLE-2正常细胞被微帽固定，用于识别miR-17、BTG3mRNA和TGFBR2 mRNA的CHDCmiR -17、CHDCBTG3和CHDCTGFBR2分别封装在纳米基因与电极复合层的纳米粒中。
CHDCmiR-17由两个发夹DNA(CHDCmiR-17-H1和CHDCmiR-17-H2)和一个修饰荧光基团和淬灭基团的DNA报告分子(CHDCmiR-17-RF和CHDCmiR-17-RQ)组成(所述序列如表1所示)，序列中符号[A],[C],[G],[T]分别表示该碱基是A,C,G,T的锁核酸；
CHDCBTG3由两个发夹DNA(CHDCBTG3-H1和CHDCBTG3-H2)和一个修饰荧光基团和淬灭基团的DNA报告分子(CHDCBTG3-RF和CHDCBTG3-RQ)组成(所述序列如表1所示)，序列中符号[A],[C],[G],[T]分别表示该碱基是A,C,G,T的锁核酸；
CHDCTGFBR2由两个发夹DNA(CHDCTGFBR2-H1和CHDCTGFBR2-H2)和一个一个修饰荧光基团和淬灭基团的DNA报告分子(CHDCTGFBR2-RF和CHDCTGFBR2-RQ)组成(所述序列如表1所示)，序列中符号[A],[C],[G],[T]分别表示该碱基是A,C,G,T的锁核酸；
用PBS溶液治疗的Hep3B细胞和THLE-2细胞作为对照组。
图3中的TIRF图像显示，转染抗miR-17的Hep3B细胞分泌的外泌体中miR-17、BTG3mRNA和TGFBR2 mRNA表达的荧光信号介于PBS转染的Hep3B细胞和THLE-2细胞分泌的外泌体之间。结果表明抗miR-17对癌细胞有一定的治疗效果。
图4中图像数据定量分析显示，PBS电穿孔的Hep3B细胞中，miR-17高表达，BTG3mRNA和TGFBR2 mRNA低表达；PBS电穿孔的THLE-2细胞中miR-17低表达，BTG3 mRNA和TGFBR2mRNA高表达，而抗miR-17电穿孔的Hep3B组中的miR-17低表达，BTG3 mRNA和TGFBR2 mRNA高表达。经过治疗，癌细胞的基因指标趋于正常化。本发明的芯片成功实现基因递送，细胞治疗以及对细胞表达基因的监测。
本发明所涉及的发夹DNA和DNA报告分子的序列如表1所示：
表1发夹DNA和DNA报告分子的序列
实施例3
使用芯片将包裹多柔比星的阴离子脂质复合纳米粒(ALN-DOX)直接递送到细胞质。转染空ALN的A549肺癌细胞和正常人支气管上皮细胞(HBEC)作为参照。选择miR-21、miR-155和EGFR mRNA作为治疗评价指标。具体操作参照实施例2。
其中ALN-DOX是通过改进的W1/O/W2复乳超声溶剂挥发方法制备。约50微升DOX水溶液(W1)通过超声乳化在150微升含有聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)的有机溶剂(O)中。将初始乳液(W1/O)添加到600微升TPGS溶液(W2)中，然后通过超声波进行两步再乳化。此后，将双乳液(W1/O/W2)倒入1.2毫升TPGS溶液(W2)中，然后抽真空以完全去除溶剂，得到ALN-DOX悬液。
CHDCmiR-21由两个发夹DNA(CHDCmiR-21-H1和CHDCmiR-21-H2)和一个修饰荧光基团和淬灭基团的DNA报告分子(CHDCmiR-21-RF和CHDCmiR-21-RQ)组成(所述序列如表1所示)，序列中符号[A],[C],[G],[T]分别表示该碱基是A,C,G,T的锁核酸；
CHDC miR-155由两个发夹DNA(CHDC miR-155-H1和CHDC miR-155-H2)和一个修饰荧光基团和淬灭基团的DNA报告分子(CHDC miR-155-RF和CHDC miR-155-RQ)组成(所述序列如表1所示)，序列中符号[A],[C],[G],[T]分别表示该碱基是A,C,G,T的锁核酸；
CHDCEGFR由两个发夹DNA(CHDCEGFR-H1和CHDCEGFR-H2)和一个修饰荧光基团和淬灭基团的DNA报告分子(CHDCEGFR-RF和CHDCEGFR-RQ)组成(所述序列如表1所示)，序列中符号[A],[C],[G],[T]分别表示该碱基是A,C,G,T的锁核酸；
图5分别显示了由空ALN电穿孔的HBEC细胞、ALN-DOX电穿孔的A549细胞和空ALN电穿孔的A549细胞分泌的外泌体中三种指标的典型TIRF荧光图像。与来自空ALN电穿孔的A549细胞的高荧光信号对比，ALN-DOX电穿孔的A549细胞指标的荧光信号降低，表明芯片对单细胞的有效药物递送能力以及DOX对A549肺癌细胞的治疗能力。
图6中图像数据定量分析显示，在用空ALN电穿孔的HBEC细胞对照组中，结果显示三个指标的荧光强度低得多，表明miR-21、miR-155和EGFR mRNA在HBEC细胞分泌的外泌体中低表达。在另一个用空ALN电穿孔的A549细胞对照组中，结果显示三个指标的荧光强度较高，表明miR-21、miR-155和EGFR mRNA在A549细胞分泌的外泌体中过表达。当A549细胞用ALN-DOX电穿孔时，miR-21、miR-155和EGFR mRNA的表达被抑制和降低。
实施例4
使用本发明芯片实时监测基因/药物治疗下活细胞分泌的外泌体中RNA的表达变化
miR-155在许多人类癌症中上调，其表达在更具侵袭性和治疗耐药性的肿瘤中增加，过表达miR-155的肿瘤细胞也倾向于上调miR-21。在本实施例中，通过监测治疗过程中活细胞分泌的外泌体中miR-21的表达来评估抗miR-155和化疗药物对肺癌细胞的联合治疗。
实验方法如下：
首先，将纳硅晶片浸入A549肺癌细胞溶液(106细胞/mL)中，每次5分钟，浸渍后，用镊子缓慢提起硅晶片。之后，将介质储存层和基因/药物储存层组装在硅晶片的两侧。将抗miR-155(5’-aacccctatcacgattagcattaa-3’)溶液、ALN-DOX溶液、ALN-DOX和抗miR-155的组合溶液加入基因/药物储存层并覆盖电极层，将RPMI-1640培养基溶液加入介质储存层并覆盖纳米基因与电极复合层。随后，使用200V脉冲电场强度将抗miR-17输送到细胞中。在测量前将芯片在37℃和99％相对湿度下黑暗中孵育3小时。最后，使用全内反射荧光(TIRF)显微镜记录和分析样品图像。每次测量后，芯片都使用新的纳米基因与电极复合层重新集成，为芯片准备下一次的测量。
图7显示了芯片对miR-21表达的测量，在第四次测量之前分别用抗miR-155、ALN-DOX或ALN-DOX和抗miR-155的组合转染A549癌细胞(*在9-10小时时间点)。转染后，A549癌细胞的miR-21表达急剧下降。
图8显示转染ALN-DOX/anti-miR-155组合的A549癌细胞的miR-21表达率最低，细胞活性降低37％，这表明芯片可以同时将纳米颗粒和基因输送到单细胞中，并证明与单一治疗药物相比，ALN-DOX和miR-155抑制剂联合治疗对癌细胞更有效。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (2)
1.一种高通量纳米电穿孔-纳米基因融合芯片，其特征在于至少包括五层材料；
位于所述芯片中间的一层材料是硅晶片；所述硅晶片的一面带有纳米通道和微帽结构，所述硅晶片的另一面带有微圆储层阵列，微圆储层阵列由至少一个微圆储层结构组成；每一个微圆储层结构与其背面的纳米通道是一一对应的关系；
位于所述芯片两端的材料是电极；其中的一个电极连接阳离子脂质聚合物杂化纳米粒；
所述的阳离子脂质聚合物杂化纳米粒包裹由两个发夹DNA和一个修饰荧光基团和淬灭基团的DNA报告分子组成的催化电路；
所述的阳离子脂质聚合物杂化纳米粒为CHDCmiR-17、CHDCBTG3、CHDCTGFBR2、CHDCmiR-21、CHDCmiR-155、CHDCEGFR中的至少一种；
所述的CHDCmiR-17由CHDCmiR-17-H1、CHDCmiR-17-H2、CHDCmiR-17-RF和CHDCmiR-17-RQ组成；
所述的CHDCBTG3由CHDCBTG3-H1、CHDCBTG3-H2、CHDCBTG3-RF和CHDCBTG3-RQ组成；
所述的CHDCTGFBR2由CHDCTGFBR2-H1、CHDCTGFBR2-H2、CHDCTGFBR2-RF和CHDCTGFBR2-RQ组成；
所述的CHDCmiR-21由CHDCmiR-21-H1、CHDCmiR-21-H2、CHDCmiR-21-RF和CHDCmiR-21-RQ组成；
所述的CHDCmiR-155由CHDCmiR-155-H1、CHDCmiR-155-H2、CHDCmiR-155-RF和CHDCmiR-155-RQ组成；
所述的CHDCEGFR由CHDCEGFR-H1、CHDCEGFR-H2、CHDCEGFR-RF和CHDCEGFR-RQ组成；
所述的CHDCmiR-17-H1的核苷酸序列为：
TGC[A]CTG[T]AA[G]CA[C]TTTGGCACCTTCAATACAAAGTGCTTACTCCCATCTACCTCCC；
所述的CHDCmiR-17-H2的核苷酸序列为：
CTTTGTATTGAAGGTGCCAAAGTGCTTAGCACCTTCAATA；
所述的CHDCmiR-17-RQ的核苷酸序列为：
CTCCCATCTACCTCCC–BHQ；
所述的CHDCmiR-17-RF的核苷酸序列为：
FAM-G[G]GA[G]GT[A]GA[T]GG[G]AGTAAGCA；
所述的CHDCmiR-21-H1的核苷酸序列为：
CAT[C]AGT[C]TG[A]TA[A]GCTATCCCATTATCCTTAGCTTATCAGTTTCCATTTCCAGCCC；
所述的CHDCmiR-21-H2的核苷酸序列为：
AGCTAAGGATAATGGGATAGCTTATCAGTCCCATTATCCT；
所述的CHDCmiR-21-RQ的核苷酸序列为：
TTTCCATTTCCAGCCC–BHQ；
所述的CHDCmiR-21-RF的核苷酸序列为：
FAM-G[G]GC[T]GG[A]AA[T]GG[A]AACTGATA；
所述的CHDCmiR-155-H1的核苷酸序列为：
TAT[C]ACG[A]TT[A]GC[A]TTAACCCGACCCTAACTTAATGCTAATACCCTACCACTCACCC；
所述的CHDCmiR-155-H2的核苷酸序列为：
ATTAAGTTAGGGTCGGGTTAATGCTAATCCCGACCCTAAC；
所述的CHDCmiR-155-RQ的核苷酸序列为：
ACCCTACCACTCACCC–BHQ；
所述的CHDCmiR-155-RF的核苷酸序列为：
FAM-G[G]GT[G]AG[T]GG[T]AG[G]GTATTAGC；
所述的CHDCBTG3-H1的核苷酸序列为：
GCC[A]CAT[T]GG[A]AG[A]GGTGTCCAATCTCACTCACCTCTTCCATCCCACTCTCACTCAC；
所述的CHDCBTG3-H2的核苷酸序列为：
AGGTGAGTGAGATTGGACACCTCTTCCATCCAATCTCACT；
所述的CHDCBTG3-RQ的核苷酸序列为：
TCCCACTCTCACTCAC–BHQ；
所述的CHDCBTG3-RF的核苷酸序列为：
FAM-G[T]GA[G]TG[A]GA[G]TG[G]GATGGAAG；
所述的CHDCTGFBR2-H1的核苷酸序列为：
ACA[G]GAA[C]AC[A]TG[A]AGAACTCACATCACCATTCTTCATGTGAAACGCAACTAACACT；
所述的CHDCTGFBR2-H2的核苷酸序列为：
AAGAATGGTGATGTGAGTTCTTCATGTGCTCACATCACCA；
所述的CHDCTGFBR2-RQ的核苷酸序列为：
AAACGCAACTAACACT–BHQ；
所述的CHDCTGFBR2-RF的核苷酸序列为：
FAM-A[G]TG[T]TA[G]TT[G]CG[T]TTCACATG；
所述的CHDCEGFR-H1的核苷酸序列为：
ATG[C]TGT[C]CT[C]AG[T]CAAGACCAGCCCAATACTTGACTGAGGTTAATGTACCCGATCT；
所述的CHDCEGFR-H2的核苷酸序列为：
TCAAGTATTGGGCTGGTCTTGACTGAGGACCAGCCCAATA；
所述的CHDCEGFR-RQ的核苷酸序列为：
TTAATGTACCCGATCT–BHQ；
所述的CHDCEGFR-RF的核苷酸序列为：
FAM-A[G]AT[C]GG[G]TA[C]AT[T]AACCTCAG；
所述的核苷酸序列中符号[A], [C], [G], [T]分别表示该碱基是A,C,G,T的锁核酸；
位于所述硅晶片与电极之间的是软体孔板；其中，朝向纳米通道和微帽阵列的软体孔板是介质储存层，朝向微圆储层阵列的是药物储存层；每个所述微帽结构中有一个纳米通道，纳米通道位于微帽结构中央；所述的电极为氧化铟锡和金纳米镀层电极；
所述纳米通道的直径为100-800纳米；
所述微圆储层结构的直径为30-100微米；
所述微帽的宽度为5-15微米，微帽凸起的高度为5-10微米；所述硅晶片的厚度为100-300微米。
2.权利要求1所述高通量纳米电穿孔-纳米基因融合芯片的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）使用光刻胶在硅晶片的一面图案化纳米通道阵列，使用深反应离子蚀刻钻出5-50微米深的纳米通道；然后使用光刻胶在硅晶片的另一面图案化微圆储层阵列，应用深反应离子蚀刻直到微圆储层结构与纳米通道连通；
（2）在纳米通道阵列上使用光刻胶制造微帽帽结构，微帽结构凸起的高度为5-10微米，微帽结构与纳米通道对齐，得到带有纳米通道与微帽阵列的硅晶片；
（3）将两片镀有氧化铟锡的玻璃片用UV/O3活化5分钟以上，然后转移到具有MPTMS蒸汽的真空室中10分钟以上；通过电子束蒸发器将具有MPTMS层的玻璃片进一步沉积金纳米层，制备氧化铟锡和金纳米镀层电极；
（4）将步骤（3）所得氧化铟锡和金纳米镀层电极与软体孔板结合，加入包裹CHDC的纳米粒悬浮液，洗去电极表面未连接的纳米粒，得到介质储存层和电极层；
（5）使用前，将药物加入药物储存层，之后将电极层封装药物储存层；将细胞培养基加入介质储存层，最后组装，得到高通量纳米电穿孔/纳米基因融合芯片；
所述玻璃片的厚度为0.1-0.5毫米；
所述金纳米层的厚度为5-50纳米。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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