CN108531396A - 一种用于细胞转染的微流控芯片 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于细胞转染的微流控芯片,包括激光发生器和芯片主体,其中芯片主体包括有用于细胞转染的微流通道,微流通道包括微流入口与微流出口,微流通道底部设置有微米结构阵列,激光发生器的激光发射端正对微米结构阵列设置;微米结构阵列为具有微米级凸起结构的阵列。细胞溶液从微流通道的微流入口流入芯片,待转染细胞被微米结构阵列捕获,在激光作用下微米结构阵列尖端处形成光聚焦,由光热效应在细胞膜表面形成一个开口,从而转染大分子能够进入细胞内部。本发明根据不同的细胞形态大小,可以优化微流通道的尺寸和光热阵列的大小结构,进一步实现高通量大分子转染。
Description
技术领域
本发明涉及细胞转染领域,具体涉及一种用于细胞转染的微流控芯片。
背景技术
转染,是将外源性基因导入细胞内的技术。随着基因与蛋白功能研究的深入、基因编辑技术的发展,细胞转染目前已成为生物科学领域必不可少的部分。与此同时,细胞转染也可实现药物的递送、肿瘤抑制等临床效果。
理想细胞转染方法,应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。转染大致可分为物理介导、化学介导和生物介导三类途径。
生物介导方法是最早出现的,常被认为是细胞转染最有效的方法,主要利用病毒或其他生物作为微载体其转染效率可达90%。但是生物介导转染方法的准备程序复杂,常常对待转染的细胞类型有很强的选择性,且转染的仅限于千碱基大小的核酸。另外,病毒或病毒载体(逆转录病毒,慢病毒,腺病毒和腺伴随病毒(AAV))通常会整合到人类基因组中,其可能存在许多免疫应答的副作用。
化学介导方法常使用脂质、阳离子聚合物、不溶性沉淀物(如磷酸钙共沉淀)等化学方法进行转染。在一般生理条件下,细胞膜通常呈现负电荷,因为磷脂双层结构由胞质面上带负电荷的磷脂酰丝氨酸和磷脂酰肌醇组成。为了在递送过程中克服膜屏障,化学方法采用负载有标记物(具有siRNA,miRNA,分子信标)的中性或带正电荷的核苷-复合物载体以与细胞膜结合并通过胞吞作用转运。化学介导转染一般可实现高效输运,但借助胞吞作用,具有一定的网格蛋白依赖性,另外化学载体也可能具有额外的毒性。
物理介导方法是利用外界力(机械、电、磁、光等)将细胞膜穿透,不借助细胞的内吞作用,不需要额外的化学修饰,一定程度上减少免疫反应。目前常用的有显微注射技术、电穿孔技术、光学方法、声学方法、微通道挤压技术等。显微注射通过较细的微管刺穿细胞膜,输运效率可达100%,最早应用于核移植,但通常不可用于大规模转染;电穿孔通过电场的改变影响跨膜蛋白的状态,从而形成疏水性或亲水性孔道或改变跨膜电位,使外界分子转染进细胞内。但高电压所需能量较高,且容易导致细胞膜破裂,进而造成细胞死亡。总之,大多数物理方法的递送包括两个步骤:(i)破坏质膜以产生瞬时孔隙和(ii)在它们重新密封之前通过瞬时孔隙递送货物。为了产生瞬时毛孔,电穿孔使用静电力来破坏细胞膜; 声波产生声压以触发具有强流体流动的空化气泡以诱导膜渗透性; 光学方法使用由短激光脉冲触发的非线性光吸收来分解细胞膜; 微流体通道使用窄结构挤压细胞膜。
但这些机制仅限于小分子运输,缓慢扩散的大分子在细胞膜恢复之前没有机会穿过孔道,而涂有大分子的尖锐尖端可能失去穿透细胞膜的能力。另外这些方法都是低通量的且可能遭受细胞堵塞、创伤性细胞裂解等并发症。
发明内容
本发明的目的提供一种用于细胞转染的微流控芯片,芯片中封装有微米结构阵列,可在激光作用下产生光热效应,进而诱导细胞短暂致孔,待转染分子(DNA,RNA,质粒等)在微流体推动下通过孔洞进入细胞内完成转染过程。
一种用于细胞转染的微流控芯片,包括激光发生器和芯片主体,其中芯片主体包括有用于细胞转染的微流通道,微流通道包括微流入口与微流出口,微流通道底部设置有微米结构阵列,激光发生器的激光发射端正对微米结构阵列设置;微米结构阵列为具有微米级凸起结构的阵列。
进一步,所述的用于细胞转染的微流控芯片,微流通道的微流入口处设置带有阀门的入口导管。
进一步,所述的用于细胞转染的微流控芯片,所述微流通道的微流出口处设置带有阀门的出口导管。
进一步,所述的用于细胞转染的微流控芯片,所述微流通道包括两侧的通道区域和中间的反应区域,所述微米结构阵列设置于反应区域。
进一步,所述的用于细胞转染的微流控芯片,所述微米结构阵列表面镀有金属膜或金属氧化膜。
进一步,所述的用于细胞转染的微流控芯片,所述微米结构阵列的排布方式包括圆形阵列、六角形阵列或方形阵列,所述微米结构阵列的微米级凸起上表面具有开口。。
进一步,所述的用于细胞转染的微流控芯片,所述微米级凸起结构包括以下结构形式:金字塔结构、圆锥结构、圆台结构或柱形结构。
进一步,所述的用于细胞转染的微流控芯片,所述激光发生器发射的激光包括连续型激光、纳秒激光或飞秒激光。
更进一步,所述的用于细胞转染的微流控芯片,所述金属膜为金、钛或铝制成的金属膜,所述金属氧化膜为氧化钛制备而成的金属氧化膜。
进一步,所述的用于细胞转染的微流控芯片进行细胞转染的方法,通过微流入口向微流通道注入待转染细胞溶液,同时开启激光发生器发射激光照射微米结构阵列,让待转染细胞溶液流经微米结构阵列时,激光照射微米结构阵列产生光热效应,使转染分子进入细胞,转染完毕后将转染后的细胞溶液从微流出口抽出,完成转染。
本发明提供的用于细胞转染的微流控芯片中,微米结构阵列可以利用多种物理化学方法制备得到,如双光子打印、电子束光刻、湿法刻蚀、干法刻蚀、模板剥离法等。利用双光子打印技术将设计好的阵列(金字塔结构、圆锥结构、圆台、柱形结构等)打印出来,然后利用电子束蒸镀在结构表面镀上一定厚度的薄膜(厚度可为50-200nm,材质可为金、钛、铝等),形成光热效应阵列,表面镀膜还可由化学气相沉积、物理气相沉积、电镀、溅射镀膜等实现。
本发明提供的用于细胞转染的微流控芯片中,可以利用带有阀门的入口导管或出口导管进行待转染细胞溶液的输入和输出,不同过程利用阀门进行控制。
为了更加适应实验条件,本发明提供的细胞转染的微流控芯片中,微流控芯片整体材质可以采用PDMS材质,形成PDMS材质的微流通道,更加适应细胞的转染操作条件。
本发明提供的用于细胞转染的微流控芯片在转染过程中,细胞溶液从微流通道的微流入口流入芯片,待转染细胞被微米结构阵列捕获,在激光作用下微米结构阵列尖端处形成光聚焦,由光热效应在细胞膜表面形成一个开口,从而转染大分子能够进入细胞内部。
本发明与现有技术相比,有益效果如下:
1) 芯片制作简单,与一般的光学器件相比,该芯片的制备不需要反复曝光和刻蚀技术,只需要一步双光子打印和电子束蒸镀即可得到光热效应阵列,极大地减少了制备时间。
2) 整个芯片封装简单,只需要将微结构阵列、阀门、导管、恒流泵、注射器等简单组装即可完成,不需要加工模板,大大降低了芯片的成本。
3) 高通量转染:反应池中含有大量微米结构阵列,通过激光照射激发光热效应,一次反应即可实现细胞的高通量转染,也可将芯片串联或并联,实现细胞的多次转染和更高通量转染。
附图说明
图1为本发明实施例1中所述的用于细胞转染的微流控芯片示意图;
图2为本发明实施例2中所述的用于细胞转染的微流控芯片微流通道俯视图;
以上图1和图2中,1为激光发生器,2为芯片主体,3为微流通道,31为入口导管,32为出口导管,33为通道区域,34为反应区域,4为微米结构阵列,5为微米级凸起结构,6为转染细胞。
具体实施方式
以下结合附图对本发明提供的用于细胞转染的微流控芯片进行进一步说明。
实施例1
图1为本实施例提供的用于细胞转染的微流控芯片示意图,包括激光发生器1和芯片主体2,其中芯片主体2包括有用于细胞转染的微流通道3,微流通道3包括微流入口与微流出口,微流通道3底部设置有微米结构阵列4,激光发生器1的激光发射端正对微米结构阵列4设置;微米结构阵列4为具有微米级凸起结构5的阵列;微流通道3的微流入口处设置带有阀门的入口导管31,微流通道3的微流出口处设置带有阀门的出口导管32。
所述微米结构阵列4表面镀有金属膜或金属氧化膜,具体膜的材质可以为金、钛、铝、氮化钛等。
所述微米级凸起结构5可以包括以下结构形式:金字塔结构、圆锥结构、圆台结构或柱形结构等。
所述激光发生器1发射的激光包括连续型激光、纳秒激光或飞秒激光。
实施例2
本实施例是在实施例1的基础上的一种改进形式。如图2所示,微流通道3包括两侧的通道区域33和中间的反应区域34,所述微米结构阵列4设置于反应区域34中;微米结构阵列4的排布方式可以包括圆形阵列、六角形阵列或方形阵列等,更进一步地,所述微米结构阵列4的微米级凸起上表面具有开口,能够更好的实现光热效应与细胞转染。
以上用于细胞转染的微流控芯片进行细胞转染的方法,首先通过微流入口向微流通道注入待转染细胞溶液,同时开启激光发生器发射激光照射微米结构阵列,让待转染细胞溶液流经微米结构阵列时,激光照射微米结构阵列产生光热效应,使转染分子进入细胞(如图1中的标号6所示),转染完毕后将转染后的细胞溶液从微流出口抽出,完成转染。
实施例3
以下为利用本发明提供的用于细胞转染的微流控芯片的具体实例:
(1)用细胞转染的微流控芯片向海拉细胞中转染DOX:
a、在12mm*12mm的石英片上利用双光子打印技术打印下边长4μm,上边长2μm,高4μm的金字塔形微米结构阵列,利用电子束蒸镀在金字塔形结构表面镀一层100nm的钛膜。
b、设计如以上权利要求所述的微流控芯片,将石英片组装到芯片中间,组装阀门,将芯片的两端分别连上导管,其中一条导管与注射器相连,注射器使用恒流泵控制流速。关闭微流出口阀门,通过恒流泵输入一定浓度的海拉细胞,使海拉细胞在石英片上贴附延伸。
c、缓慢通入一定浓度的DOX溶液,使溶液与海拉细胞充分接触。打开芯片上部的激光发生器,使用50mW532nm激发10s,关闭激光发生器。
d、反应完毕,打开微流出口阀门,使用恒流泵将反应后的细胞溶液冲出,经过洗涤后,放回培养皿中继续培养。
e、利用显微镜检测细胞转染和成活情况。
(2)用细胞转染芯片向小鼠胚胎成纤维细胞中转染OSKM质粒:
a、在12mm*12mm的石英片上利用双光子打印技术打印下直径4μm,上直径2μm,高4μm的圆台形微米结构阵列,利用电子束蒸镀在圆台形结构表面镀一层100nm的钛膜。
b、设计以上实施例所述的微流控芯片,将石英片组装到芯片中间,组装阀门,将芯片的两端分别连上导管,其中一条导管与注射器相连,注射器使用恒流泵控制流速。关闭微流出口端阀门,通过恒流泵输入一定浓度的小鼠胚胎成纤维细胞,使细胞在石英片上贴附延伸。
c、缓慢通入一定浓度的OSKM溶液,使溶液与细胞充分接触。打开芯片上部的激光发生器,使用45mW532nm激发10s,关闭激光发生器。
d、反应完毕,打开微流出口端阀门,使用恒流泵将反应后的细胞溶液冲出,经过洗涤后,放回培养皿中继续培养24h。
e、利用显微镜检测细胞转染和成活情况。
(3)用细胞转染芯片向143BTK-ρ0细胞中转染mtDNA:
a、在12mm*12mm的石英片上利用双光子打印技术打印下边长4μm,上边长2μm,高4μm的金字塔形微米结构阵列,利用电子束蒸镀在金字塔形结构表面镀一层100nm的钛膜。
b、设计以上实施例所述的微流控芯片,将石英片组装到芯片中间,组装阀门,将芯片的两端分别连上导管,其中一条导管与注射器相连,注射器使用恒流泵控制流速。关闭微流出口端阀门,通过恒流泵输入一定浓度的143BTK-ρ0细胞,使细胞在石英片上贴附延伸。
c、缓慢通入一定浓度的mtDNA溶液,使溶液与细胞充分接触。打开芯片上部的激光发生器,使用50mW532nm激发10s,关闭激光发生器。
d、反应完毕,打开微流出口端阀门,使用恒流泵将反应后的细胞溶液冲出,经过洗涤后,放回培养皿中继续培养24h。
e、利用显微镜检测细胞转染和成活情况。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明技术原理的前提下,还可以做出若干改进和变型,这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种用于细胞转染的微流控芯片,其特征在于,包括激光发生器(1)和芯片主体(2),其中芯片主体(2)包括有用于细胞转染的微流通道(3),微流通道(3)包括微流入口与微流出口,微流通道(3)底部设置有微米结构阵列(4),激光发生器(1)的激光发射端正对微米结构阵列(4)设置;微米结构阵列(4)为具有微米级凸起结构(5)的阵列。
2.根据权利要求1所述的用于细胞转染的微流控芯片,其特征在于,微流通道(3)的微流入口处设置带有阀门的入口导管(31)。
3.根据权利要求1所述的用于细胞转染的微流控芯片,其特征在于,所述微流通道(3)的微流出口处设置带有阀门的出口导管(32)。
4.根据权利要求1所述的用于细胞转染的微流控芯片,其特征在于,所述微流通道(3)包括两侧的通道区域(33)和中间的反应区域(34),所述微米结构阵列(4)设置于反应区域(34)中。
5.根据权利要求1所述的用于细胞转染的微流控芯片,其特征在于,所述微米结构阵列(4)表面镀有金属膜或金属氧化膜。
6.根据权利要求1所述的用于细胞转染的微流控芯片,其特征在于,所述微米结构阵列(4)的排布方式包括圆形阵列、六角形阵列或方形阵列,所述微米结构阵列(4)的微米级凸起上表面具有开口。
7.根据权利要求1所述的用于细胞转染的微流控芯片,其特征在于,所述微米级凸起结构(5)包括以下结构形式:金字塔结构、圆锥结构、圆台结构或柱形结构。
8.根据权利要求1所述的用于细胞转染的微流控芯片,其特征在于,所述激光发生器(1)发射的激光包括连续型激光、纳秒激光或飞秒激光。
9.根据权利要求5所述的用于细胞转染的微流控芯片,其特征在于,所述金属膜为金、钛或铝制成的金属膜,所述金属氧化膜为氧化钛制备而成的金属氧化膜。
10.权利要求1所述的用于细胞转染的微流控芯片进行细胞转染的方法,其特征在于,通过微流入口向微流通道注入待转染细胞溶液,同时开启激光发生器发射激光照射微米结构阵列,让待转染细胞溶液流经微米结构阵列时,激光照射微米结构阵列产生光热效应,使转染分子进入细胞,转染完毕后将转染后的细胞溶液从微流出口抽出,完成转染。
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Legal Events
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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