CN114940973A - 微流控细胞分选装置、肿瘤干细胞的分选方法及抗癌药物的筛选方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种微流控细胞分选装置、肿瘤干细胞的分选方法及抗癌药物的筛选方法，微流控细胞分选装置包括第一分选芯片和第二分选芯片；第一分选芯片中设有用于分选细胞的大小不同的通道，第一分选芯片设有第一入口和第一出口，第一入口用于样品的注入；第二分选芯片设有第二入口和第二出口，第二入口与第一出口连通，以使自第一出口流出的样品进入第二分选芯片分选，第二分选芯片的内表面覆盖有基质胶层。本发明的微流控细胞分选装置基于细胞柔性形变以及细胞黏附性进行分选，能够准确高效地分选出同时具有高变形性和低粘附性且细胞活性良好的肿瘤干细胞群，为下游实验提供保证，对后期的药效验证对癌症的治疗和预后具有重要意义。

Description

微流控细胞分选装置、肿瘤干细胞的分选方法及抗癌药物的 筛选方法

技术领域

本发明涉及细胞生物学技术领域，特别是涉及一种微流控细胞分选装置、肿瘤干细胞的分选方法及抗癌药物的筛选方法。

背景技术

肿瘤干细胞(Cancer stem cells，CSCs)被认为是肿瘤耐药和复发的关键因素，开发有效的分离和鉴定CSCs的方法具有重要意义。现有的CSCs的分离可分为细胞表面标志物分选法和不依赖细胞表面标志物分选法。细胞表面标志物分选法是借助已知的特殊细胞表面标志物，利用免疫磁珠(Magnetic activated cell sorting，MACS)或将可与表面标记物结合的荧光“标签”(Fluorescence-activated cell sorting，FACS)对CSCs进行分离。此方法细胞纯度高，但影响细胞自身的生物学特性，不利于后续实验。此外，细胞表面标志物分选法不仅基于昂贵的设备支持和相对复杂的操作，且在许多癌症类型中，CSCs的特异性表面标志物仍不清楚，这限制了细胞表面标志物分选法的使用范围。不依赖细胞表面标志物分选法主要有侧群细胞分析(Side population，SP)法、无血清培养法和耐药性筛选法，虽然充分借助了CSCs的特性进行分离，但以其低通量和低纯度而有一定的局限性。

微流控芯片(Microfluidic chips)具有成本低、分析时间短、灵敏度高、可操作性强等优点。研究人员将细胞自身生物学特性与流体力学操作有机结合，开发出基于微流控芯片的细胞分离方法。但是，一般的微流控芯片应用于肿瘤干细胞的分选时准确性较低，分选效率不佳。

发明内容

基于此，有必要提供一种分选肿瘤干细胞的准确性较高的微流控芯片。

一种微流控细胞分选装置，包括第一分选芯片和第二分选芯片；所述第一分选芯片中设有用于分选细胞的大小不同的通道，所述第一分选芯片设有第一入口和第一出口，所述第一入口用于样品的注入；所述第二分选芯片设有第二入口和第二出口，所述第二入口与所述第一出口连通，以使自所述第一出口流出的样品进入所述第二分选芯片分选，所述第二分选芯片的内表面覆盖有基质胶层，所述第二出口用于自所述第二分选芯片分选后的样品流出。

在其中一个实施例中，所述基质胶层由1mg/mL～5mg/mL的基质胶凝固形成。

在其中一个实施例中，所述第二分选芯片中设有捕获柱，所述捕获柱的侧壁设有多个第一凸起部。

在其中一个实施例中，所述第二分选芯片中设有混流结构，所述混流结构自所述第二入口至所述第二出口方向延伸，且所述混流结构的侧壁自所述第二入口至所述第二出口方向设有多个第二凸起部。

在其中一个实施例中，所述混流结构的数量为多个，所述捕获柱的数量为多个，多个所述混流结构间隔相对排布，多个所述捕获柱分布于相邻两个所述混流结构之间。

在其中一个实施例中，所述第一分选芯片中设有多个拦截柱，每两个以上所述拦截柱排成一列形成一个拦截单元，多个所述拦截单元沿所述第一入口至所述第一出口的方向依次间隔排布；每个所述拦截单元中相邻两个拦截柱之间的间隙形成用于分选细胞的通道，且沿所述第一入口至所述第一出口的方向上，所述间隙逐渐减小。

在其中一个实施例中，所述拦截单元中相邻两个拦截柱之间的间隙为2μm～30μm。

本发明还提供了一种肿瘤干细胞的分选方法，包括以下步骤：使用设有用于分选细胞的大小不同的通道的第一分选芯片对样品进行第一次分选，然后使用内表面覆盖有基质胶层的第二分选芯片对经过所述第一次分选得到的细胞进行第二次分选，得到所述肿瘤干细胞。

在其中一个实施例中，控制所述第一分选芯片中的流速为45μL/min～75μL/min，控制所述第二分选芯片中的流速为0.1mL/h～0.7mL/h。

本发明还提供了一种抗癌药物的筛选方法，包括以下步骤：

将经过待测药物处理后的癌细胞样本依次使用第一分选芯片和第二分选芯片进行分选，所述第一分选芯片中设有用于分选细胞的大小不同的通道，用于根据细胞软硬分选细胞，所述第二分选芯片的内表面覆盖有基质胶层，用于根据细胞黏附能力分选细胞；

统计分选获得的细胞数量或细胞在所述第一分选芯片和所述第二分选芯片中的分布情况。

本发明的微流控细胞分选装置在进行细胞分选时，细胞悬液样品可从第一入口注入，利用第一分选芯片的大小不同的通道可以从通入的细胞群中分选出柔性高、易变形的细胞，不易变形的细胞则被第一分选芯片拦截而留在芯片内。通过第一分选芯片的细胞经第一出口到达第二入口，进入第二分选芯片，第二分选芯片的腔室内表面覆盖有基质胶层，可以模拟细胞-基质黏附和体内自然细胞微环境，从而可以捕获高黏附特性的细胞，最终可从第二出口得到同时具有柔性高、易变形且低黏附特性的干细胞群。在肿瘤的发生和转移中，具有高变形性和低黏附性的细胞趋向于远处转移并表现出较高的恶性程度，具有肿瘤干细胞特性。本发明的微流控细胞分选装置基于柔性形变以及细胞黏附性进行分选，能够准确高效地分选出同时具有高变形性和低粘附性且细胞活性良好的肿瘤干细胞群，为下游实验(药物筛选、肿瘤干细胞新型靶标的发现)提供保证，对后期的药效验证对癌症的治疗和预后具有重要意义。

附图说明

图1为本发明一实施例的微流控细胞分选装置的结构示意图；

图2为实施例1中MS-Chip在不同流速下的收集细胞比例(a)以及干细胞相关蛋白的表达水平(b)；

图3为实施例1中细胞在MS-Chip中的荧光显微图像；

图4为实施例1中HCA-Chip在不同流速下的收集细胞比例(a)以及干细胞相关蛋白的表达水平(b)；

图5为实施例1中细胞在HCA-Chip中的荧光显微图像；

图6为实施例1中灌注细胞数为1×10⁴时分别经过MS-Chip、HCA-Chip和MS-HCA-Chip后收集的细胞数；

图7为实施例2中CFSE/PI细胞活力实验的结果；

图8为实施例2中台盼蓝染色实验的结果，(a)为显微照片，(b)为细胞活力统计数据；

图9为实施例2中CCK-8实验的结果；

图10为实施例3中Transwell体外迁移实验的结果，(a)为显微照片，(b)为细胞迁移统计数据；

图11为实施例3中伤口愈合实验的结果；

图12为实施例3中Western Blot的结果；

图13为实施例3中对数生长期的分选前细胞和分选后细胞的显微照片；

图14为实施例4中平板克隆实验的结果，(a)为平板照片，(b)为克隆数量统计数据；

图15为实施例4中细胞计数实验的结果；

图16为实施例4中球囊形成实验的结果，(a)为显微照片，(b)为球囊数量统计数据；

图17为实施例4中流式细胞术的结果；

图18为实施例4中Western Blot的结果；

图19为实施例4中细胞耐药性实验的结果；

图20为实施例4中裸鼠成瘤实验的结果；

图21为实施例5中CCK-8实验筛选甘草活性成分的结果；

图22为实施例5中CCK-8实验检测异甘草素IC50的结果；

图23为实施例5中平板克隆实验的结果，(a)为平板照片，(b)为克隆数量统计数据；

图24为实施例5中Western Blot的结果；

图25为实施例5中球囊形成实验的结果，(a)为显微照片，(b)为球囊数量统计数据；

图26为实施例5中Transwell体外迁移实验的结果，(a)为显微照片，(b)为细胞迁移统计数据；

图27为实施例5中细胞周期检测的结果；

图28为实施例5中体内实验的结果，(a)为肿瘤照片，(b)为肿瘤重量数据，(c)为小鼠体重变化数据，(d)为肿瘤中干性蛋白水平变化数据。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。

在本发明的描述中，需要理解的是，术语“中心”、“纵向”、“横向”、“长度”、“宽度”、“厚度”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”、“顺时针”、“逆时针”、“轴向”、“径向”、“周向”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。在本发明中，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”、“固定”等术语应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或成一体；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通或两个元件的相互作用关系，除非另有明确的限定。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。在本发明中，除非另有明确的规定和限定，第一特征在第二特征“上”或“下”可以是第一和第二特征直接接触，或第一和第二特征通过中间媒介间接接触。而且，第一特征在第二特征“之上”、“上方”和“上面”可是第一特征在第二特征正上方或斜上方，或仅仅表示第一特征水平高度高于第二特征。第一特征在第二特征“之下”、“下方”和“下面”可以是第一特征在第二特征正下方或斜下方，或仅仅表示第一特征水平高度小于第二特征。需要说明的是，当元件被称为“固定于”或“设置于”另一个元件，它可以直接在另一个元件上或者也可以存在居中的元件。当一个元件被认为是“连接”另一个元件，它可以是直接连接到另一个元件或者可能同时存在居中元件。本文所使用的术语“垂直的”、“水平的”、“上”、“下”、“左”、“右”以及类似的表述只是为了说明的目的，并不表示是唯一的实施方式。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

如图1所示，本发明一实施例的微流控细胞分选装置100，包括第一分选芯片10和第二分选芯片20。

第一分选芯片10中设有用于分选细胞的大小不同的通道，用于根据细胞软硬分选样品中的细胞，不易变形(较硬)的细胞将被第一分选芯片10所拦截。第一分选芯片10设有第一入口11和第一出口12，第一入口11用于样品的注入。第二分选芯片20设有第二入口21和第二出口22，第二入口21与第一出口12连通，以使自第一出口12流出的样品进入第二分选芯片20分选，第二分选芯片20的内表面覆盖有基质胶层，第二出口22用于自第二分选芯片20分选后的样品流出。

本发明的微流控细胞分选装置100(MS-HCA-Chip，mechanical separation-high-throughput cell adhesion chip)在进行细胞分选时，细胞悬液样品可从第一入口11注入，利用第一分选芯片10大小不同的通道可以从通入的细胞群中分选出柔性高、易变形的细胞，不易变形的较硬细胞则被第一分选芯片10拦截而留在芯片内。通过第一分选芯片10的细胞经第一出口12到达第二入口21，进入第二分选芯片20，第二分选芯片20的腔室内表面覆盖有基质胶层，可以模拟细胞-基质黏附和体内自然细胞微环境，从而可以捕获高黏附特性的细胞，最终可从第二出口22得到同时具有柔性高、易变形且低黏附特性的干细胞群。在肿瘤的发生和转移中，具有高变形性和低黏附性的细胞趋向于远处转移并表现出较高的恶性程度，具有肿瘤干细胞特性。本发明的微流控细胞分选装置100基于细胞柔性形变以及细胞黏附性进行分选，能够准确高效地分选出同时具有高变形性和低粘附性且细胞活性良好的肿瘤干细胞群，为下游实验(药物筛选、肿瘤干细胞新型靶标的发现)提供保证，对后期的药效验证对癌症的治疗和预后具有重要意义。

可以理解，图1仅为示意图，为便于说明而将各结构特征的大小比例数量进行了调整和简化，不能理解为对本发明的限制。

在一个具体示例中，上述基质胶层由1mg/mL～5mg/mL的基质胶凝固形成，优选为3mg/mL的基质胶，具有更良好的生物学活性。可将解冻的基质胶通过软管注入预冷的芯片中，然后在室温下30min后凝固即可形成基质胶层。

在一个具体示例中，第二分选芯片20中设有捕获柱23，捕获柱23的侧壁设有多个第一凸起部。捕获柱23可对流体产生一定扰动，更真实模拟体内环境，从而提高分离的精确度，并提高对于高黏附细胞的捕获性能。优选地，捕获柱23的截面呈三角螺旋桨形，但不限于此。

在一个具体示例中，第二分选芯片20中设有混流结构24，混流结构24自第二入口21至第二出口22方向延伸，且混流结构24的侧壁自第二入口21至第二出口22方向设有多个第二凸起部。如此，通过混流结构24增加混流，可以增大细胞与捕获柱23的接触概率，进一步提高对于高黏附细胞的捕获性能。优选地，混流结构24的截面呈鱼骨形，混流结构24延伸的长度为0.8mm～1.2mm，宽度为30μm～50μm。

在一个具体示例中，混流结构24的数量为多个，捕获柱23的数量为多个，多个混流结构24间隔相对排布，多个捕获柱23分布于相邻两个混流结构24之间。

在一个具体示例中，第一分选芯片10中设有多个拦截柱13，每两个以上拦截柱13排成一列形成一个拦截单元，且多个拦截单元沿第一入口11至第一出口12的方向依次间隔排布；每个拦截单元中相邻两个拦截柱13之间的间隙形成用于分选细胞的通道，且沿第一入口11至第一出口12的方向上，间隙逐渐减小。如此，当细胞悬液流经第一分选芯片10时，不易变形的细胞根据细胞软硬逐渐被拦截柱13阻挡，相对较软且容易变形的细胞则到达第一出口12，卡在芯片中的细胞也可以被反冲以实现芯片的重复利用。可选地，拦截柱13的截面为圆形，但不限于此，例如还可以为矩形、椭圆形等。可以理解，各拦截单元的用于分选细胞的通道的大小可以各不相同，也可以存在多个拦截单元的用于分选细胞的通道的大小相同的情况，只要沿第一入口11至第一出口12的方向上形成通道逐渐减小的趋势即可。

可选地，两个混流结构24之间间隔200μm～300μm，例如240μm。可选地，拦截单元中相邻两个拦截柱13之间的间隙为2μm～30μm，例如5μm、7μm、10μm、12μm、15μm、20μm、25μm等。

在一个具体示例中，第一分选芯片10包括多个分选腔室，多个分选腔室分别与第一入口11连接，每个分选腔室中均设有上述拦截柱13。在一个具体示例中，第二分选芯片20包括多个分选腔室，多个分选腔室分别与第二入口21连接，每个分选腔室中均设有上述捕获柱23和混流结构24。如此，通过多个分选腔室同时进行分选，防止阻塞的同时也可以提高通量。可以理解，上述拦截柱13、捕获柱23、混流结构24、基质胶层等均设于芯片分选腔室的内表面上。

在一个具体示例中，第一分选芯片10的分选腔室长度约为4cm～6cm，宽度约为1.6mm～2.0mm，高度为15μm～25μm，每个分选腔室内遍布拦截柱13形成的阵列，每列相邻的两个拦截柱13之间的间隔为2μm～30μm，并逐渐减小。

在一个具体示例中，第二分选芯片20的分选腔室长度约为4.5cm～5.5cm，宽度约为1mm～2mm，高度为15μm～25μm，每个分选腔室内遍布着混流结构24和位于混流结构24之间的捕获柱23。可以理解，用于不同的肿瘤细胞的分选时，可以根据需要对结构尺寸进行调整以提高分选精确度。

可选地，上述微流控细胞分选装置100中的第一分选芯片10和第二分选芯片20采用以下方法制备：在洁净的硅片上旋转涂布负性光刻胶例如SU-8 3025，待其凝固后将印有设计好图案的铬板掩模，在光刻机上曝光，清洗硅片去除多余光刻胶，待其凝固后浇筑PDMS(Polydimethylsiloxane)，高温固化后将图形剥离并打孔以灌注液体，清洁表面后与玻片键合，抽真空后即可使用。

本发明一实施例的肿瘤干细胞的分选方法，包括以下步骤：使用设有用于分选细胞的大小不同的通道的第一分选芯片对细胞样品进行第一次分选，然后使用内表面覆盖有基质胶层的第二分选芯片对经过第一次分选得到的细胞进行第二次分选，得到肿瘤干细胞。

在一个具体示例中，样品在第一分选芯片中的流速为45μL/min～75μL/min，样品在第二分选芯片中的流速为0.1mL/h～0.7mL/h。优选地，当样品为肺癌细胞系如A549时，样品在第一分选芯片中的流速为58μL/min～65μL/min，最优选为60μL/min，样品在第二分选芯片中的流速为0.2mL/h～0.4mL/h，最优选为0.3mL/h，分选效果有明显提高，表明流速对细胞分选有一定影响。在一定范围内，细胞可通过自身特性通过芯片，而当流速突破某一界限时，流体对细胞产生影响。可以理解，流速可根据不同细胞的特性进行调整，以使得细胞通过自身特性而非外界流速进行分离，选取不影响分离精准度情况下的最大流速为宜。

例如，在使用前抽真空并在紫外下消毒，用含0.1％牛血清白蛋白(BSA)的PBS润湿通道防止非特异性结合。然后通过聚乙烯软管将预冷的3mg/mL的基质胶通入第二分选芯片，室温下放置30分钟后用无血清培养基轻轻冲洗。利用注射器将细胞悬液回抽至软管，后将其固定于注射泵。调节注射泵以60μL/min的速率将细胞悬液推入第一分选芯片，柔软可变的细胞通过芯片而变形性差的细胞被卡在芯片中。之后富集第一步分离的细胞，并将其以0.3mL/h的流速通入包被有基质胶的第二分选芯片，黏附性弱的细胞通过芯片。经过两次分选后的细胞即为具有肿瘤干细胞表型的细胞。

本发明一实施例的抗癌药物的筛选方法，包括以下步骤：

将经过待测药物处理后的癌细胞样本依次使用第一分选芯片和第二分选芯片进行分选，第一分选芯片中设有用于分选细胞的大小不同的通道，用于根据细胞软硬分选细胞，第二分选芯片的内表面覆盖有基质胶层，用于根据细胞黏附能力分选细胞；

统计分选获得的细胞数量或细胞在第一分选芯片和第二分选芯片中的分布情况。

如此，根据细胞数量可判断待测药物的抗癌活性高低，例如细胞数量越少则所述待测药物的抗癌能力越强。或者在第一分选芯片中，分布于下游的细胞数量及出口处积累的细胞越少，说明待测药物对细胞力学特性影响越强，对肿瘤干细胞的抑制作用更强；在第二分选芯片中，黏附于芯片中的细胞比例与药物的抑制作用成正比。

可选地，筛选方法还可以包括以下步骤：将未经过待测药物处理的癌细胞样本依次使用第一分选芯片和第二分选芯片进行分选。如此，将未经过待测药物处理的癌细胞样本作为对照组，可以更好的体现待测药物的抗癌能力。

例如，可将MS-HCA-Chip分选后的细胞分别在各候选药物的IC50(半抑制浓度，half maximal inhibitory concentration)下作用相同时间，收集细胞并以相同数量通入芯片。评估：1)通过MS-HCA-Chip后收集的细胞数。收集细胞即为肿瘤干细胞表型的细胞，与对照组(PBS处理)相比，收集比例越低反映药物对细胞的抑制作用越强。2)细胞在芯片系统中的分布。在第一分选芯片中，下游细胞数及出口处积累细胞越少，反映药物对细胞力学特性影响越强，对肿瘤干细胞的抑制作用更强。在第二分选芯片中，黏附于芯片中的细胞比例与药物的抑制作用成正比。结合两款芯片，综合细胞的生物物理学特性评估药物作用后细胞的收集比例及分布，反映成分对细胞的抑制作用，筛选用于靶向肿瘤干细胞的药物，并最终筛选到甘草的活性成分异甘草素(ISL，Isoliquiritigenin)进行后续实验。

本发明利用多学科交叉知识，构建了充分考虑细胞异质性的微流控细胞分选装置用于肿瘤干细胞的分选，并利用分选的细胞实现高通量靶向肿瘤干细胞的药物筛选，以其高灵敏度而特别适用于微量和难提取成分的药效评价，将细胞分选与药物筛选结为一体，实现整合、便捷和高效。

下面主要结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细的说明。

实施例1探究分离流速与富集细胞的比例

1.第一分选芯片(mechanical separation chip，MS-Chip)的分离流速

(1)使用前将MS-Chip液封。

(2)人源肺癌细胞A549正常消化细胞后计数，调节细胞数为1×10⁴/mL，取1mL细胞于1.5mL离心管，吹打为单细胞悬液，吸取细胞悬液于连接注射器的软管。

(3)将接有软管的注射器固定于注射泵，软管另一端以金属头连接于MS-Chip的入口用于液体导入芯片，芯片的出口处用于收集经过MS-Chip分选的细胞。

(4)将注射泵调节为“注入”模式，调节流速为45μL/min后开始灌注细胞悬液。

(5)当细胞悬液全部通过MS-Chip后，在收集口收集细胞并计数。

(6)将收集口收集的细胞与注入的细胞数作比，得到在MS-Chip中，当流速为45μL/min时，收集细胞的比例。

(7)依次调节流速为50、55、60、65、70、75μL/min重复上述实验。每个流速下结果重复三次。

(8)整理结果做图，如图2所示为在MS-Chip中收集细胞比例与流速的关系，可见在MS-Chip中的分离流速增加时收集细胞比例逐渐增加；分离流速为60μL/min时分选得到的肿瘤细胞干性最强。

选用GFP绿色荧光标记的A549单细胞悬液，以60μL/min的流速将细胞从入口灌注至MS-Chip，用荧光显微镜拍摄细胞在芯片中的图像，如图3所示。

2.第二分选芯片(high-throughput cell adhesion chip，HCA-Chip)的分离流速

(1)使用前将HCA-Chip液封，将基质胶灌注于芯片用于模拟体内微环境。

(2)人源肺癌细胞A549正常消化细胞后计数，调节细胞数为1×10⁴/mL，取1mL细胞于1.5mL离心管，吹打为单细胞悬液。吸取细胞悬液于连接注射器的软管。

(3)将接有软管的注射器固定于注射泵，软管另一端以金属头连接于HCA-Chip的入口用于液体导入芯片，芯片的出口处用于收集经过HCA-Chip分选的细胞。

(4)将注射泵调节为“注入”模式，调节流速为0.1mL/h后开始灌注细胞悬液。

(5)当细胞悬液全部通过HCA-Chip后，在收集口收集细胞并计数。

(6)将收集口收集的细胞与注入的细胞数作比，得到在HCA-Chip中，当流速为0.1mL/h时，收集细胞的比例。

(7)依次调节流速为0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7mL/h重复上述实验。每个流速下结果重复三次。

(8)整理结果做图，如图4所示为在HCA-Chip中收集细胞比例与流速的关系，可见在HCA-Chip中的分离流速增加时收集细胞比例逐渐增加；分离流速为0.3mL/h时分选得到的肿瘤细胞干性最强。

选用GFP绿色荧光标记的A549单细胞悬液，以0.3mL/h的流速将细胞从入口灌注至HCA-Chip。用荧光显微镜拍摄细胞在芯片中的图像，如图5所示，图中绿色荧光为在芯片中粘附的细胞。

统计当灌注细胞数为1×10⁴时，分别经过MS-Chip、HCA-Chip和MS-HCA-Chip后收集的细胞数，实验重复三次，结果如图6所示。

通过上述实验可知，MS-HCA-Chip可用于分离细胞，且在MS-Chip中的分离流速优选为60μL/min，在HCA-Chip中的分离流速优选为0.3mL/h。

实施例2MS-HCA-Chip对细胞活力的影响

通过CFSE/PI细胞活力实验(活细胞为绿色荧光、死细胞为红色荧光)、台盼蓝染色实验、CCK8细胞活性实验，证明了芯片的分选对细胞活力基本没有影响，细胞可用于后续实验。

1.CFSE/PI细胞活力实验

(1)A549重悬为单细胞悬液后利用软管通入MS-Chip。

(2)在流速为60μL/min下使细胞通过芯片，并在收集口收集细胞。

(3)对收集口收集的细胞和注入芯片的细胞进行活细胞染色剂CFSE(钙黄绿素绿Invitrogen C34852)和死细胞染色剂PI(碘化丙啶，sigma)的染色。

(4)在荧光显微镜下拍摄染色后的细胞，绿色荧光为活细胞，红色荧光为死细胞，反映当通过MS-Chip后，芯片对细胞活力的影响。

(5)同样，将细胞以最适流速分别通过HCA-Chip和MS-HCA-Chip，对收集细胞和注入细胞(sort in)进行染色。实验重复三次，结果如图7所示。

2.台盼蓝染色实验

(1)对收集的细胞和注入芯片的细胞利用0.4％台盼蓝染色剂进行染色(索莱宝C0040)。

(2)将染色后的细胞用10μL的移液枪注入血球计数板后在显微镜下拍照观察。

(3)根据台盼蓝染色剂的原理，死细胞被染为蓝色而活细胞不被染色。

(4)统计未被染色的细胞数和注入血球计数板的细胞数之比，作为分别经过MS-Chip、HCA-Chip、MS-HCA-Chip后细胞的活力。实验重复三次，结果如图8所示。

3.CCK-8实验

(1)将分选前和分别用MS-Chip、HCA-Chip、MS-HCA-Chip分选后的细胞重悬为4×10⁴/ml单细胞悬液，以100μL/孔的密度接种于96孔板。

(2)48小时培养后，进行CCK8(在孔中加入10μL的CCK8后避光孵育40min，在酶标仪450nm吸光度检测)细胞活性测定。实验重复三次，结果如图9所示。

实施例3分选后细胞的迁移特性检测

通过Transwell实验、划痕实验和Western blot检测迁移相关蛋白(E-cadherin、N-cadherin、Vimentin)等实验，对比经过MS-HCA-Chip分选后的细胞以及只利用MS-Chip或HCA-Chip分选的细胞的迁移特性，表明连用芯片分选后细胞迁移能力增强，说明了芯片分选的可行性及连用的有效性。

1.Transwell体外迁移实验

(1)将去除血清的分选前后的细胞以2×10⁴/孔的数量接种于Transwell小室的上层，在下层添加含10％血清的培养基。

(2)24小时后用棉签轻轻擦去上室内侧未穿过的细胞，放于4％多聚甲醛中固定15min后用结晶紫染色。

(3)在显微镜下拍摄穿过的细胞，并统计。实验重复三次，结果如图10所示，分选后的细胞迁移特性增加。

2.伤口愈合实验

(1)在六孔板中接种分选前后的细胞，至细胞长至孔板的60％后划痕。

(2)用200微升的枪头在六孔板中划线，后用PBS清洗细胞碎片，在显微镜下拍照，更换为无血清培养基继续培养24小时。

(3)在0h拍照的相同位置拍照，作为24小时之后的状态。

(4)数据处理并比较划痕宽度的大小。在初始宽度相同情况下，细胞迁移性越强，则24小时后划痕的宽度越窄，结果如图11所示，证明分选后细胞迁移特性增加。

3.Western Blot

(1)收集分选前后的细胞并进行蛋白提取与定量。

(2)实验操作。电泳：蛋白上样后在120V条件下电泳。转膜：将蛋白转移至PVDF膜，在300mA条件下转膜60min。封闭：用脱脂奶粉封闭，去除非特异性结合。一抗：分别加入E-cadherin、N-cadherin、Vimentin等表示细胞迁移特性的抗体和内参抗体。摇床4℃过夜。二抗：TBST清洗PVDF膜后二抗孵育2小时。清洗与曝光：TBST清洗未结合的二抗，ECL发光液曝光条带。结果如图12所示，证明分选后细胞迁移特性增加。

4.分选后细胞形态检测

显微镜下拍摄对数生长期的分选前细胞，和经过MS-HCA-Chip分选后的细胞，如图13所示，可见分选后的细胞更多的呈长条状。经过MS-HCA-Chip的分选，相比较分选前细胞，迁移特性增加，且对比单独的一种芯片分选，连用芯片分选后的细胞迁移特性增加。

实施例4分选后细胞的高干性检测

通过克隆形成、体外球囊形成、化疗药物耐药性等实验对分选细胞进行CSC特性鉴定。使用流式细胞术、Western blot等检测干细胞相关蛋白(CD133、CD44、SOX2)的表达变化。通过细胞计数等实验对比分选前后细胞增殖水平的变化。采用裸鼠体内成瘤实验，饲养一周后皮下接种不同梯度的分选平台前后细胞，观察极限稀释下肿瘤的生成及体积变化。当同时接种10⁴的细胞时，分选后细胞仍可以成瘤，而分选前细胞不能成瘤，体现分选后细胞的干性增强。

1.平板克隆实验

(1)将分选前后的细胞以200个/孔的密度接种于六孔板中，培养10天。

(2)用PBS清洗三次后用4％的多聚甲醛固定15分钟后，结晶紫染色15分钟。

(3)在显微镜下拍照并计数形成克隆的数量，评估细胞独立存活的能力。结果如图14所示，分选后细胞形成克隆的数量增多，干性增强。

2.细胞计数实验

(1)将分选前后的细胞以相同数量1×10⁵/孔的密度接种于六孔板培养。

(2)分别在第二天、第三天和第四天的相同时间消化分选前和分选后的细胞，并计数。

(3)统计连续四天的细胞数并分析。结果如图15所示，分选后细胞在相同时间点对比分选前，数量增多，表示增殖更快。

3.球囊形成实验

(1)将分选前后的细胞分别以3×10⁴/孔的细胞数接种于低粘附六孔板，在DMEM/F12K和添加有细胞生长因子的环境中培养，每三天换液一次。

(2)第十天拍照并计数大于50μm的球囊个数。在无血清和低粘附的培养环境下，肿瘤干细胞可以形成球囊，球囊大小及个数反映细胞干性的强弱。结果如图16所示，分选后细胞形成球囊的个数增多，干性增强。

4.流式细胞术

将分选前后的细胞用预冷的PBS重悬，按照1×10⁶个细胞加入CD133抗体3μL后避光孵育30min。利用肿瘤干细胞表面标志物CD133检测分选前后细胞干性变化。结果如图17所示，表明分选后细胞干性增强。

5.Western Blot

(1)收集分选前后的细胞并进行蛋白提取与定量。

(2)实验操作。电泳：蛋白上样后在120V条件下电泳。转膜：将蛋白转移至PVDF膜，在300mA条件下转膜60min。封闭：用脱脂奶粉封闭，去除非特异性结合。一抗：分别加入CD133、CD44、SOX2等表示细胞干性的抗体和内参抗体。摇床4℃过夜。二抗：TBST清洗PVDF膜后二抗孵育2小时。清洗与曝光：TBST清洗未结合的二抗，ECL发光液曝光条带。结果如图18所示，表明分选后细胞干性标志物CD133/CD44/SOX2等干性指标增强。

6.细胞耐药性实验

(1)将分选前和MS-HCA-Chip分选后的细胞重悬为4×10⁴/ml单细胞悬液。以100μL/孔的密度接种于96孔板。

(2)待细胞贴壁后分别加入多柔比星(DOX)使其终浓度分别为0μM、20μM、40μM、60μM。

(3)48小时培养后，进行CCK8(在孔中加入10μL的CCK8后避光孵育40min，在酶标仪450nm吸光度检测)细胞活性测定。实验重复三次，如图19所示，结果显示，相比分选前的细胞，分选后的细胞在相同浓度的多柔比星下表现出更高的耐药性，而耐药性的增高是肿瘤干细胞干性增强的特征之一。

7.裸鼠成瘤实验

(1)将分选前后的细胞分别以1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴的密度皮下接种于4周龄的裸鼠体内。

(2)四周后处死小鼠，取肿瘤组织。

结果如图20所示，分选后细胞形成的肿瘤体积大于分选前细胞形成的肿瘤体积，在细胞浓度为1×10⁴的情况下，分选前细胞已不能形成肿瘤，而分选后细胞仍可以形成，表明分选后细胞的成瘤能力更强。

实施例5甘草活性成分的药物筛选

CCK8细胞活力实验筛选靶向肿瘤细胞和肿瘤干细胞信号通路的相关药物，将对MS-HCA-Chip分选后细胞具有抑制作用的成分作为候选药物。对分选的细胞进行候选药物处理，通过平板克隆实验、球囊形成实验、Western Blot检测干性相关蛋白等经典生物学实验对比富集前后及药物作用后对肿瘤细胞干性的影响。通过体外裸鼠成瘤实验比较当接种相同细胞情况下，药物ISL处理组和PBS对照组肿瘤体积和重量。通过流式细胞术验证了药物是通过调节细胞周期而起到抑制作用。验证肿瘤干细胞样表型细胞的成功富集，以及候选药物ISL对肿瘤干细胞具有靶向性。

1.CCK-8实验

(1)选取具有肿瘤抑制作用的甘草活性成分14个(甘草次酸、甘草香豆素、异甘草素、异甘草苷元、光果甘草酮、羟基查耳酮、甘草酸、甘草西定、甘草利酮、甘草素、光甘草定、甘草查尔酮A、刺甘草查尔酮、甘草苷)进行药物筛选。

(2)将MS-HCA-Chip分选后的细胞重悬为4×10⁴/ml单细胞悬液，以100μL/孔的密度接种于96孔板。

(3)待细胞贴壁后分别加入甘草活性成分，使其浓度分别为药物的IC50，并设置对照组。

(4)48小时培养后，进行CCK8(在孔中加入10μL的CCK8后避光孵育40min，在酶标仪450nm吸光度检测)细胞活性测定。实验重复三次。

如图21所示，Control为对照组，Ingredient为实验组，结果显示异甘草素(ISL)具有良好的肿瘤干细胞抑制作用，药物起效浓度较低且重复性良好。

(5)将MS-HCA-Chip分选后的细胞重悬为4×10⁴/ml单细胞悬液。以100μL/孔的密度接种于96孔板。

(6)待细胞贴壁后分别加入异甘草素(ISL)使其中浓度分别为0μM、15μM、20μM、25μM。

(7)48小时培养后，进行CCK8(在孔中加入10μL的CCK8后避光孵育40min，在酶标仪450nm吸光度检测)细胞活性测定，实验重复三次。

如图22所示，结果显示，异甘草素对分选后的肿瘤干细胞样表型的细胞具有一定的抑制作用，且其IC50为20μM。

2.平板克隆实验

(1)将分选前后的细胞以200个/孔的密度接种于六孔板中，培养10天。分选后的细胞以相同数量接种，待其贴壁后加入ISL使其终浓度为20μM。

(2)用PBS清洗三次后用4％的多聚甲醛固定15分钟后，结晶紫染色15分钟。

(3)在显微镜下拍照并计数形成克隆的数量，评估细胞独立存活的能力。

如图23所示，分选后细胞形成克隆的数量增多，干性增强。而药物作用后的细胞形成克隆的能力减弱，表明ISL对肿瘤干细胞有一定的抑制作用。

3.Western Blot

(1)收集分选前后，以及ISL药物处理后的细胞并进行蛋白提取与定量。

(2)实验操作。电泳：蛋白上样后在120V条件下电泳。转膜：将蛋白转移至PVDF膜，在300mA条件下转膜60min。封闭：用脱脂奶粉封闭，去除非特异性结合。一抗：分别加入CD133、CD44、SOX2等表示细胞干性的抗体和内参抗体，摇床4℃过夜。二抗：TBST清洗PVDF膜后二抗孵育2小时。清洗与曝光：TBST清洗未结合的二抗，ECL发光液曝光条带。

如图24所示，结果表明，分选后细胞干性标志物CD133/CD44/SOX2等干性指标增强，ISL药物处理后分选细胞的干性减弱。

4.球囊形成实验

(1)将分选前后的细胞，以及加药后的细胞分别以3×10⁴/孔的细胞数接种于低粘附六孔板，在DMEM/F12K和添加有细胞生长因子的环境中培养。分选后的细胞以相同数量接种，后加入ISL使其终浓度为20μM。

(2)第十天拍照并计数大于50μm的球囊个数。在无血清和低粘附的培养环境下，肿瘤干细胞可以形成球囊，球囊大小及个数反映细胞干性的强弱。

如图25所示，分选后细胞形成球囊的个数增多，干性增强，而药物处理后的细胞形成球囊的能力减弱。

5.Transwell体外迁移实验

(1)将去除血清的分选前后细胞以2×10⁴/孔的数量接种于Transwell小室的上层，在下层添加含10％血清的培养基。分选后的细胞以相同数量接种，后加入ISL使其终浓度为20μM。

(2)24小时后用棉签轻轻擦去上室内侧未穿过的细胞，放于4％多聚甲醛中固定15min后用结晶紫染色。

(3)在显微镜下拍摄穿过的细胞，并统计，实验重复三次。如图26所示，分选后的细胞迁移特性增加，而药物处理后细胞迁移特性减少。

6.细胞周期检测

(1)将分选后的细胞，以及ISL药物处理后的细胞收集并用预冷的PBS洗涤，离心后去除上清。

(2)重悬细胞使其为单细胞悬液，并加入预冷的无水乙醇，于-20℃固定。

(3)用相同体积的预冷PBS洗涤后离心去上清，RNA酶消化水浴，后PI避光染色30min。

(4)流式细胞仪上机检测488nm处的红色荧光，并分析DNA含量。

如图27所示，结果表明，药物处理后的细胞G1期增强，ISL对干细胞有抑制作用。

7.体内实验

(1)将分选后的细胞以1×10⁵/100μL皮下接种于裸鼠体内。

(2)十天后将小鼠各随机分为2组，腹腔给药200μL/只。PBS或ISL(25mg/kg)，间隔给药，并测量小鼠体重。

(3)28天后处死取肿瘤并称取重量。研磨肿瘤组织并进行细胞蛋白定量和WesternBlot实验，检测肿瘤中干性蛋白水平的变化。

(4)绘制小鼠体重随天数的折线图，并统计结果。如图28所示，(a)为肿瘤照片，(b)为肿瘤重量数据，(c)为小鼠体重变化数据，(d)为肿瘤中干性蛋白水平变化数据，可见ISL对小鼠的体重几乎没有影响，对肿瘤有一定的抑制作用。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种微流控细胞分选装置，其特征在于，包括第一分选芯片和第二分选芯片；所述第一分选芯片中设有用于分选细胞的大小不同的通道，所述第一分选芯片设有第一入口和第一出口，所述第一入口用于样品的注入；所述第二分选芯片设有第二入口和第二出口，所述第二入口与所述第一出口连通，以使自所述第一出口流出的样品进入所述第二分选芯片分选，所述第二分选芯片的内表面覆盖有基质胶层，所述第二出口用于自所述第二分选芯片分选后的样品流出。

2.根据权利要求1所述的微流控细胞分选装置，其特征在于，所述基质胶层由1mg/mL～5mg/mL的基质胶凝固形成。

3.根据权利要求1所述的微流控细胞分选装置，其特征在于，所述第二分选芯片中设有捕获柱，所述捕获柱的侧壁设有多个第一凸起部。

4.根据权利要求3所述的微流控细胞分选装置，其特征在于，所述第二分选芯片中设有混流结构，所述混流结构自所述第二入口至所述第二出口方向延伸，且所述混流结构的侧壁自所述第二入口至所述第二出口方向设有多个第二凸起部。

5.根据权利要求4所述的微流控细胞分选装置，其特征在于，所述混流结构的数量为多个，所述捕获柱的数量为多个，多个所述混流结构间隔相对排布，多个所述捕获柱分布于相邻两个所述混流结构之间。

6.根据权利要求1所述的微流控细胞分选装置，其特征在于，所述第一分选芯片中设有多个拦截柱，每两个以上所述拦截柱排成一列形成一个拦截单元，多个所述拦截单元沿所述第一入口至所述第一出口的方向依次间隔排布；

每个所述拦截单元中相邻两个拦截柱之间的间隙形成用于分选细胞的通道，且沿所述第一入口至所述第一出口的方向上，所述间隙逐渐减小。

7.根据权利要求6所述的微流控细胞分选装置，其特征在于，所述拦截单元中相邻两个拦截柱之间的间隙为2μm～30μm。

8.一种肿瘤干细胞的分选方法，其特征在于，包括以下步骤：使用设有用于分选细胞的大小不同的通道的第一分选芯片对样品进行第一次分选，然后使用内表面覆盖有基质胶层的第二分选芯片对经过所述第一次分选得到的细胞进行第二次分选，得到所述肿瘤干细胞。

9.根据权利要求8所述的分选方法，其特征在于，控制所述第一分选芯片中的流速为45μL/min～75μL/min，控制所述第二分选芯片中的流速为0.1mL/h～0.7mL/h。

10.一种抗癌药物的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：

将经过待测药物处理后的癌细胞样本依次使用第一分选芯片和第二分选芯片进行分选，所述第一分选芯片中设有用于分选细胞的大小不同的通道，用于根据细胞软硬分选细胞，所述第二分选芯片的内表面覆盖有基质胶层，用于根据细胞黏附能力分选细胞；

统计分选获得的细胞数量或细胞在所述第一分选芯片和所述第二分选芯片中的分布情况。

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