WO2016186398A1 - 항암제 내성세포 스크리닝용 미세유체 칩 및 이의 용도 - Google Patents

항암제 내성세포 스크리닝용 미세유체 칩 및 이의 용도 Download PDF

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WO2016186398A1
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박성수
이상혁
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성균관대학교산학협력단
이화여자대학교 산학협력단
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Definitions

  • the present invention relates to a microfluidic chip for screening anti-cancer drug-resistant cells and a use thereof, and more particularly, to a method for inducing or screening a microfluidic chip for screening anti-cancer drug-resistant cells having a continuous concentration gradient of an anti-cancer agent and a cell for chemo-resistant cells.
  • Cancer is an important disease that contends for the 1st or 2nd cause of death in Korean adults, and despite many studies, about half of cancer patients eventually die.
  • Cancer treatment methods known to be effective to date include surgery and radiation chemotherapy.
  • surgery and radiation therapy are topical therapies that are effective only at the site of ablation or radiation. There is a difference in that it is a therapy.
  • cancer is a disease that develops locally and metastasizes systemically, with some degree of systemic metastasis, except when initially detected.
  • local therapies such as surgery and radiation therapy
  • anticancer therapies which are systemic therapies. Therefore, in order to improve the therapeutic effect on cancer, not only the expansion of radical surgery by early diagnosis is necessary, but also anticancer drug treatment is essential for patients who cannot operate or have a high risk of recurrence after surgery.
  • anticancer drugs only a few cancers, such as leukemia, malignant lymphoma, and testicular cancer, which can be cured with only anticancer drugs, are effective in treating cancer cells with anticancer drugs. This is because tumors are reduced but resistance to chemotherapy is developed during or after treatment.
  • anticancer drug resistance is used to treat a cancer patient using an anticancer agent, it means that there is no therapeutic effect from the beginning of the treatment or initially, the cancer treatment effect is lost, but the cancer treatment effect is lost in the continuous treatment process.
  • MDR multi-drug resistance
  • PgP P-glycoprotein
  • MRP multidrug resistance-associated protein
  • the present invention has been made to solve the above problems, the present inventors have confirmed the anti-cancer drug enhancement effect of the cells cultured in the microfluidic chip of the present invention and completed the present invention based on this.
  • an object of the present invention is a plate portion 100 is provided with a plurality of cell culture chamber 110 radially; A cell introduction part 200 formed near the center of the plate part 100 to load cells; A fluid diffusion part 300 formed along a circumference of the plate part 100 to provide a space for movement of the fluid; A first injection part 400 connected to the fluid diffusion part 300 to inject a fluid including a culture solution and an anticancer agent; A second injecting part 500 connected to the fluid diffusion part 300 into which a fluid including a culture solution is injected; And a micro channel 600 providing a passage through which fluid between the fluid diffusion part 300, the cell culture chamber 110, and the cell introduction part 200 can move. And a discharge part 700 connected to the fluid diffusion part 300 to discharge the fluid to the outside, to provide an anticancer drug resistant cell screening or induction microfluidic chip.
  • another object of the present invention is to load the cancer cells isolated from the patient to the cell introduction unit 200; Injecting a fluid including a culture medium and an anticancer agent, and a fluid including the culture solution into each of the first injection unit 400 and the second injection unit 500; It provides a method for inducing anti-cancer drug resistant cells using the microfluidic chip, including forming a concentration gradient between the cell culture chambers 110 as the fluid passes through the microchannel 600.
  • another object of the present invention is to load the cancer cells isolated from the patient to the cell introduction unit 200; Injecting a fluid including a culture medium and an anticancer agent, and a fluid including the culture solution into each of the first injection unit 400 and the second injection unit 500; Forming a concentration gradient between cell culture chambers (110) as the fluid passes through the microchannels (600); And photographing and analyzing the cell culture chamber 110 in real time, to provide an anticancer drug resistant cell screening method using the microfluidic chip.
  • the present invention is a plate portion 100 is provided with a plurality of cell culture chamber 110 radially; A cell introduction part 200 formed near the center of the plate part 100 to load cells; A fluid diffusion part 300 formed along a circumference of the plate part 100 to provide a space for movement of the fluid; A first injection part 400 connected to the fluid diffusion part 300 to inject a fluid including a culture solution and an anticancer agent; A second injecting part 500 connected to the fluid diffusion part 300 into which a fluid including a culture solution is injected; A micro channel 600 providing a passage through which fluid between the fluid diffusion part 300, the cell culture chamber 110, and the cell introduction part 200 can move; And a discharge part 700 connected to the fluid diffusion part 300 to discharge the fluid to the outside, and provides a microfluidic chip for inducing or screening an anticancer drug resistant cell.
  • the fluid diffusion portion 300 is composed of a fluid diffusion portion 310 connected to the first injection portion and a fluid diffusion portion 320 connected to the second injection portion, the first injection portion
  • the fluid diffusion part 310 connected with the fluid diffusion part 320 connected with the second injection part may be isolated.
  • the microfluidic chip, the first injection unit 400 and the second injection unit 500 may be located facing each other.
  • the microfluidic chip may form a continuous concentration gradient of the fluid between the cell culture chambers 110 in the direction of the second injector.
  • the present invention comprises the steps of loading the cancer cells isolated from the patient to the cell introduction unit 200; Injecting a fluid including a culture medium and an anticancer agent, and a fluid including the culture solution into each of the first injection unit 400 and the second injection unit 500; It provides a method for inducing cancer-resistant drug cells using the microfluidic chip comprising the step of forming a concentration gradient between the cell culture chamber 110 as the fluid passes through the micro-channel (600).
  • the present invention comprises the steps of loading the cancer cells isolated from the patient to the cell introduction unit 200; Injecting a fluid including a culture medium and an anticancer agent, and a fluid including the culture solution into each of the first injection unit 400 and the second injection unit 500; Forming a concentration gradient between cell culture chambers (110) as the fluid passes through the microchannels (600); And photographing and analyzing the cell culture chamber 110 in real time, and provides an anticancer drug resistant screening method using the microfluidic chip.
  • the cancer cells may be human glioblastoma cells.
  • the anticancer agent may be doxorubicin.
  • Microfluidic chip according to the present invention by forming a continuous concentration gradient between the cell culture chamber, it is possible to induce or screen the effective anti-cancer drug resistant cells. Unlike the conventional anticancer drug resistant cell induction and reading technology that takes 6 months or more, the present invention can quickly cultivate and read anticancer drug resistance within a week, and thus may be useful for developing advanced treatment technology to overcome patient-specific resistance. It is expected to be.
  • 1 is a view showing the basic structure of the microfluidic chip for screening anti-cancer drug resistant cells.
  • FIG. 2 is an enlarged view of an edge portion of a microfluidic chip for screening anti-cancer drug-resistant cells, and illustrates a microchannel for providing a fluid diffusion part, a cell culture chamber, and a passageway between chambers.
  • Figure 3 is a result of (a) visually confirmed the distribution according to the concentration of the dye (fluorescein, 1 ⁇ M) in the microfluidic chip for screening anti-cancer drug resistant cells, and (b) fluorescence intensity difference.
  • Figure 5 is a result of comparing the cell survival rate according to doxorubicin treatment between U87 cells (WT cells) cultured in general medium and U87-DG cells (chip cells) cultured using a microfluidic chip for screening anti-cancer drug resistant cells.
  • FIG. 6 is a result of comparing redox activity between U87 cells (WT cells) cultured in a general medium and U87-DG chip cells cultured using a microfluidic chip for screening anticancer drug resistant cells.
  • FIG. 6 is a result of comparing redox activity between U87 cells (WT cells) cultured in a general medium and U87-DG chip cells cultured using a microfluidic chip for screening anticancer drug resistant cells.
  • the present inventors as a result of culturing cancer cells using a microfluidic chip for screening anti-cancer drug resistant cells forming a continuous concentration gradient between cell culture chambers, the cancer cells compared with cancer cells cultured in a general culture medium, due to anti-cancer drug resistance High cell viability and the like have been confirmed, and the present invention has been completed based on this.
  • the present invention is a plate portion 100 is provided with a plurality of cell culture chamber 110 radially; A cell introduction part 200 formed near the center of the plate part 100 to load cells; A fluid diffusion part 300 formed along a circumference of the plate part 100 to provide a space for movement of the fluid; A first injector 400 connected to the fluid diffusion unit 300 into which a fluid including a culture solution and an anticancer agent is injected; A second injection part 500 connected to the fluid diffusion part 300 and into which a fluid including a culture solution is injected; And a micro channel 600 providing a passage through which fluid between the fluid diffusion part 300, the cell culture chamber 110, and the cell introduction part 200 can move. And a discharge part 700 connected to each of the fluid diffusion part 300 to discharge the fluid to the outside, and provides a microfluidic chip for anticancer drug resistant cell induction or screening.
  • anticancer drug resistance means that cancer treatment using an anticancer agent has no therapeutic effect from the beginning of the treatment or initially had a cancer treatment effect, but the cancer treatment effect is lost in the continuous treatment process.
  • the present inventors have cultivated cancer cells having the anticancer drug resistance as described above, and intended to be widely used in clinical research such as basic research such as genetic analysis and anticancer drug screening.
  • the plate portion 100 includes a cell culture chamber 110, a cell introduction portion 200, a fluid diffusion portion 300, and the like, and the cell introduction portion 200 is formed at the center of the plate portion 100. Located in the fluid diffusion portion 300 is formed along the periphery of the plate portion.
  • the cell culture chamber 110 is a space in which cancer cells loaded into the cell introduction part 200 formed in the center of the plate part 200 are cultured, and is composed of a plurality of 100 to 300 cells.
  • the cell culture chamber 110 is connected to the cell introduction part 200, the fluid diffusion part 300 and the micro channel 600 to provide a passage through which fluids can be connected to each other.
  • the fluid containing the culture solution and the anticancer agent, and the fluid containing the culture solution are respectively injected into the first injection part 400 and the second injection part 500 connected to the fluid diffusion part 300, and the fluid is fluid diffusion.
  • the microchannel 600 is moved to the cell culture chamber 110.
  • the first injection unit 400 and the second injection unit 500 are positioned to face each other, and preferably, an end of the injection unit may include a reservoir.
  • the fluid diffusion part 300 is configured to provide a space for the movement of the fluid, and as shown in FIG. 2, a plurality of fluid diffusion parts 300 may be formed along the circumference of the plate part 100. At this time, it is preferable that the plurality of fluid diffusion parts 300 formed are separated from each other.
  • it may include a fluid diffusion part 310 connected to the first injection part and a fluid diffusion part 320 connected to the second injection part, and the first injection part 400 and the second injection part 500.
  • the fluid diffusion part 310 connected with the first injection part and the fluid diffusion part 320 connected with the second injection part have an isolated structure so that the injected fluid is not mixed.
  • the discharge part 700 is connected to the fluid diffusion part 300 and provides a passage through which the injected fluid is discharged.
  • the fluid diffusion part 300 may be formed in plural numbers, and the discharge part 700 may be formed in plural numbers corresponding to the isolated fluid diffusion parts 300, respectively.
  • the fluid diffusion part 310 connected to the first injection part and the fluid diffusion part 320 connected to the second injection part are isolated from each other, and the discharge part 700 is respectively connected to the first injection part. Unconnected fluid is discharged to each of the discharge parts 700 by being connected to the connected fluid diffusion part 310 and the fluid diffusion part 320 connected to the second injection part.
  • a continuous gradient of the anticancer agent is formed in this fluid migration process, and the concentration gradient is formed in the direction of the second injection unit 400 into which the fluid containing no anticancer agent is injected, and the concentration gradient of the anticancer agent is an anticancer drug resistant cell. Promotes incubation and induction.
  • a continuous concentration gradient between cell culture chambers was visually confirmed using a fluorescein as a dye (see Examples 1 to 2).
  • U87 cells U87-DG cells, chip cells
  • the culture in a general medium Comparing with U87 cells U87 cells, WT cells
  • U87-DG cells have excellent cell viability against cancer drugs, low redox activity, and good excretion capacity against Rh-123.
  • the microfluidic chip of the present invention can be usefully used for induction or screening of anticancer drug resistant cells (see Examples 5 to 7).
  • the present invention comprises the steps of loading the cancer cells isolated from the patient to the cell introduction unit 200; Injecting a fluid including a culture medium and an anticancer agent, and a fluid including the culture solution into each of the first injection unit 400 and the second injection unit 500; It provides a method for inducing cancer-resistant drug cells using the microfluidic chip comprising the step of forming a concentration gradient between the cell culture chamber 110 as the fluid passes through the micro-channel (600).
  • the present invention comprises the steps of loading the cancer cells isolated from the patient to the cell introduction unit 200; Injecting a fluid including a culture medium and an anticancer agent, and a fluid including the culture solution into each of the first injection unit 400 and the second injection unit 500; Forming a concentration gradient between cell culture chambers (110) as the fluid passes through the microchannels (600); And photographing and analyzing the cell culture chamber 110 in real time, and provides an anticancer drug resistant cell screening method using a microfluidic chip for anticancer drug resistant cell screening.
  • anticancer agent is a generic term for chemotherapeutic agents used for the treatment of tumors, preferably doxorubicin, but is not limited thereto.
  • the anticancer agent resistant cells to be induced or screened in the present invention is a generic term for cancer cells capable of obtaining resistance to the anticancer agent, preferably human glioblastoma cells, but is not limited thereto. .
  • a hexagonal microchamber array of PDMS was placed on a conventional cell culture dish. This was then stored for several hours in a clean bench for strong conformal contact between the surfaces. Using a needle-free syringe, 70% ethanol was injected with care to avoid the formation of bubbles into the microfluidic chip through the cell inlet consisting of the central hole of the hexagonal array. 70% ethanol was sequentially replaced with PBS and MEM medium.
  • the microfluidic chip for screening anticancer drug-resistant cells was named Death galaxy chip.
  • the central cell inlet was covered with a cover glass (10 mm ⁇ ) (The Paul Marienfeld GmbH & Co KG., Lauda-Konigshofen, Germany).
  • a pair of mutually opposite injections was filled with MEM medium (300 ⁇ l) containing a dye (fluorescein, 1 ⁇ M), or MEM medium (300 ⁇ l) containing no dye, respectively.
  • fluorescence images were obtained through a stereoscopic microscope (Olympus Corporation, Tokyo, Japan), and the fluorescence intensity of the entire culture chip was analyzed by Image J software.
  • MEM media was charged to a pair of injectors located opposite each other and then cultured in a cell culture incubator. After 24 hours of culture, the medium was removed from the inlet and one of the inlets was filled with only MEM medium (300 ⁇ l), while the other was filled with MEM medium (300 ⁇ l) containing doxorubicin (5 ⁇ M). Subsequently, the cells were cultured for at least 7 days, fresh media and drugs were injected every 12 hours in the infusion section, and the wastes accumulated in the two infusion sections were removed.
  • the result means that the anticancer drug resistant cells can be selected and cultured using the Death galaxy chip of the present invention.
  • doxorubicin an anticancer agent
  • U87 cells derived from human primary glioblastoma according to the concentration gradient, and among them, the surviving cells (U87-DG cells) adhered.
  • Hexagonal microchamber arrays were removed from the surface of the prepared cell culture dishes.
  • MEM normal growth medium
  • 3,000 cells (U87 and U87-DG cells) were plated in 96 wells in 200 ⁇ l MEM medium containing doxorubicin at various concentrations (0, 0.005, 0.01, 0.02, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 0.75, and 1 ⁇ M). Seeding was performed. After incubation for 72 hours, the number of cells survived in each well was calculated. Cell viability was calculated by dividing the number of cells surviving in wells containing doxorubicin by the number of cells surviving in wells without doxorubicin. After plotting the concentration of doxorubicin against cell viability, IC 50 was calculated by non-linear regression analysis using Graphpad Prism (GraphPad Software, Inc., La Jolla, Calif., USA). It was.
  • Mitochondrial redox capacities of U87 cells and U87-DG cells were compared using the EZ-Cytox assay kit (Daeil Lab Service, Seoul, Korea). Cells were seeded in 96 well plate in 180 ⁇ l culture medium and incubated for 6 hours. WST reagent (20 ⁇ l) was added to each well and incubated for 1 hour. The absorbance of WST-formazan produced by mitochondrial dehydrogenase was measured using a miroplate reader (Molecular Devices Inc. Sunnyvale, CA) at 450 nm.
  • U87-DG cells chip cells
  • FIG. 6 compared with U87 cells (WT cells), U87-DG cells (chip cells) exhibited low absorbance.
  • the results indicate that by culturing through the death galaxy chip, it is possible to reduce the aerobic respiration of mitochondria in U87 cells.
  • Multidrug resistance was measured by evaluating the ability to release the fluorescent dye Rh-123 (rhodamine 123) (Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo., USA) as substrates of the MDR1 and MRP1 proteins.
  • Rh-123 rhodamine 123
  • Cells were preloaded with Rh-123 for 30 minutes on ice and then incubated in a 37 ° C. water bath to induce MDR protein mediated release of the stain.
  • the cells were stained with propudium iodide (PI) (Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo., USA) and stored on ice until analysis.
  • the drained stain was analyzed by flow cytometry (BD Biosciences, San Jose, Calif., USA), and PI (positive) positive dead cells were excluded from the analysis.
  • Rh-123 was analyzed by a fluorometric plate reader (Molecular Devices Inc. Sunnyvale, CA). The cell suspension was divided into 96 well plate wells before and after staining. Fluorescence intensity was measured at an excitation wavelength of 485 nm and an emission wavelength of 530 nm.
  • U87-DG cells confirmed the excellent discharge capacity of MDR1 and MRP1 protein.
  • the results indicate that by culturing through the death galaxy chip, the efflux pumps are more activated to reduce the drug accumulation rate in U87 cells, thereby obtaining resistance to doxorubicin.
  • Microfluidic chip according to the present invention by forming a continuous concentration gradient between the cell culture chamber, it is possible to induce or screen the effective anti-cancer drug resistant cells. Unlike the conventional anticancer drug resistant cell induction and reading technology that takes 6 months or more, the present invention can quickly cultivate and read anticancer drug resistance within a week, and thus can be usefully used for developing advanced treatment technology to overcome patient-specific resistance. .

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Abstract

본 발명은 항암제 내성세포 스크리닝용 미세유체 칩 및 이를 이용한 항암제 내성 유도 또는 스크리닝 방법에 관한 것이다. 본 발명의 미세유체 칩은 세포 배양 챔버간 연속적인 농도구배 유도 및 기존 판독 기술과 달리, 일주일 내 빠르게 유도 및 판독할 수 있는바, 암의 치료에 있어서, 보다 근본적으로 접근하여 타겟 치료를 할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

항암제 내성세포 스크리닝용 미세유체 칩 및 이의 용도
본 발명은 항암제 내성세포 스크리닝용 미세유체 칩 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 항암제의 연속적인 농도 구배가 형성된 항암제 내성세포 스크리닝용 미세유체 칩 및 항암제 내성세포 유도 또는 스크리닝 방법에 관한 것이다.
암은 우리나라 성인의 사망 원인 중 1위 또는 2위를 다투는 중요한 질병으로서, 많은 연구에도 불구하고 암 환자의 약 과반수 가량이 결국에는 사망하는 실정이다. 현재까지 유효한 것으로 알려져 있는 암 치료 방법으로는 수술, 방사선 항암제 치료법이 있으며, 이 중에서 수술과 방사선 치료법은 절제 부위 또는 방사선 조사부위에만 효과가 있는 국소 요법이고, 항암제 치료 요법은 전신에 효과를 나타내는 전신 요법이라는 점에서 차이가 있다.
일반적으로, 암은 국소에서 발병하여 전신으로 전이되는 질환으로서, 초기에 발견되는 경우를 제외하고는 어느 정도의 전신 전이가 존재한다. 따라서, 아무리 효과적인 국소 치료법을 사용한다 할지라도 다시 재발할 확률이 높다는 사실은, 대부분의 암환자의 치료에 수술 및 방사선 치료와 같은 국소 치료법 뿐만 아니라, 전신 치료법인 항암제 치료법이 필요함을 말해준다. 따라서, 현재로서는 암에 대한 치료 효과를 향상시키기 위해서는 조기 진단에 의한 근치적 수술의 확대가 필요할 뿐만 아니라, 수술이 불가능한 환자 또는 수술 후 재발의 위험이 높은 환자에 대해 항암제 치료는 필수적이다.
그러나 현재까지 많은 항암제의 개발에도 불구하고, 항암제만으로 완치가 가능한 암은 백혈병, 악성 림프종, 고환암 등 소수의 암에 불과하며, 이는 항암제를 이용한 암 치료시 항암제에 암세포가 반응을 하지 않거나 초기에는 효과적으로 종양이 줄어들지만 치료 도중 또는 치료 후에 항암제 치료에 대한 내성이 생기기 때문이다. 항암제 내성이란, 항암제를 이용하여 암 환자를 치료할 때, 치료 초기부터 치료 효과가 없거나 초기에는 암 치료 효과가 있었으나, 계속적인 치료 과정에서 암 치료 효과가 상실되는 것을 의미한다. 이 경우, 치료에 사용된 항암제 뿐 아니라, 다른 종류의 항암제에 대해서도 내성을 나타내는 이른바, 다중 약제 내성 (MDR; multi-drug resistance)을 나타내기 때문에 일단 암세포가 항암제에 대한 내성을 획득하면, 이 후, 암 치료에 있어서 큰 어려움을 겪고 있는 실정이다.
따라서, 효과적인 항암제 치료를 위해서는 상기와 같은 항암제에 대한 암세포 내성을 극복해야 하며, 이를 위해서는 항암제에 대한 암세포의 내성에 관련된 유전자를 규명할 필요가 있다. 지금까지 밝혀진 몇몇 항암제 내성 유전자 중에서 잘 알려져 있는 것으로 P-당단백질 (P-glycoprotein : PgP)", 다약제 내성 관련 단백질 (Multidrug Resistance-associated Protein, MRP) 등이 있다. 이러한 암세포의 내성에 관련된 유전자 규명은 항암제 병용을 통한 새로운 치료법에 이용될 수 있을 뿐 아니라, 항암제 내성 발달을 예측하는 마커와 같은 역할을 할 수 있다.
이러한 내성 관련 유전자 분석에 있어서, 암세포의 배양 및 선별은 선결적인 부분으로서, 이에 대한 다양한 연구가 이루어지고 있으나 (한국공개특허 10-2013-0156493), 아직은 미비한 실정이다. 이에, 본 발명자들은 종래 6개월 이상 소요되는 항암제 내성세포 배양의 기간을 단축하고자, 세포 배양 챔버간 연속적인 농도구배가 형성된 항암제 내성세포 스크리닝용 미세유체 칩 및 이를 이용한 항암제 내성세포 유도 또는 스크리닝 방법을 고안하였다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명자들은 본 발명의 미세유체 칩에서 배양된 세포의 항암제 내성 증진효과를 확인하고 이에 기초하여 본 발명을 완성하게 되었다.
이에, 본 발명의 목적은 복수 개의 세포 배양 챔버 (110)가 방사상으로 구비된 플레이트부 (100); 상기 플레이트부 (100) 중앙 부근에 형성되어 세포를 로딩하기 위한 세포 도입부 (200); 상기 플레이트부 (100)의 둘레를 따라 형성되어 유체의 이동을 위한 공간을 제공하는 유체 확산부 (300); 상기 유체 확산부(300)와 연결되어 배양액 및 항암제를 포함하는 유체가 주입되는 제 1 주입부 (400); 상기 유체 확산부(300)와 연결되어 배양액을 포함하는 유체가 주입되는 제 2 주입부 (500); 및 상기 유체 확산부(300), 세포 배양 챔버 (110), 및 세포 도입부(200)간 유체가 이동할 수 있는 통로를 제공하는 마이크로 채널 (600); 및 상기 유체 확산부 (300)와 연결되어 유체를 외부로 배출하기 위한 배출부 (700)를 포함하는, 항암제 내성세포 스크리닝 또는 유도용 미세유체 칩 (Microfluidic chip)을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 세포 도입부 (200)에 환자로부터 분리한 암세포를 로딩하는 단계; 제 1 주입부 (400) 및 제 2 주입부 (500)에 배양액 및 항암제를 포함하는 유체, 및 배양액을 포함하는 유체를 각각 주입하는 단계; 상기 유체가 마이크로 채널 (600)을 통과함에 따라 세포 배양 챔버 (110)간 농도 구배를 형성하는 단계를 포함하는, 상기 미세유체 칩을 이용한 항암제 내성세포 유도방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 세포 도입부 (200)에 환자로부터 분리한 암세포를 로딩하는 단계; 제 1 주입부 (400) 및 제 2 주입부 (500)에 배양액 및 항암제를 포함하는 유체, 및 배양액을 포함하는 유체를 각각 주입하는 단계; 상기 유체가 마이크로 채널 (600)을 통과함에 따라 세포 배양 챔버 (110)간 농도 구배를 형성하는 단계; 및 실시간으로 세포 배양 챔버 (110)를 촬영 및 분석하는 단계를 포함하는, 상기 미세유체 칩을 이용한 항암제 내성세포 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 복수 개의 세포 배양 챔버 (110)가 방사상으로 구비된 플레이트부 (100); 상기 플레이트부 (100) 중앙 부근에 형성되어 세포를 로딩하기 위한 세포 도입부 (200); 상기 플레이트부 (100)의 둘레를 따라 형성되어 유체의 이동을 위한 공간을 제공하는 유체 확산부 (300); 상기 유체 확산부(300)와 연결되어 배양액 및 항암제를 포함하는 유체가 주입되는 제 1 주입부 (400); 상기 유체 확산부(300)와 연결되어 배양액을 포함하는 유체가 주입되는 제 2 주입부 (500); 상기 유체 확산부(300), 세포 배양 챔버 (110), 및 세포 도입부(200)간 유체가 이동할 수 있는 통로를 제공하는 마이크로 채널 (600); 및 상기 유체 확산부 (300)와 연결되어 유체를 외부로 배출하기 위한 배출부 (700)를 포함하는, 항암제 내성세포 유도 또는 스크리닝용 미세유체 칩 (Michrofluidic chip)을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 유체 확산부 (300)는 제 1 주입부와 연결된 유체 확산부 (310)와 제 2 주입부와 연결된 유체 확산부 (320)로 구성되며, 상기 제 1 주입부와 연결된 유체 확산부 (310) 및 제 2 주입부와 연결된 유체 확산부 (320)는 격리될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 미세유체 칩은, 상기 제 1 주입부 (400)와 제 2 주입부 (500)가 상호간에 대향하게 위치할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 미세유체 칩은, 제 2 주입부 방향으로 세포 배양 챔버 (110)간 유체의 연속적인 농도 구배를 형성할 수 있다.
본 발명은 상기 세포 도입부 (200)에 환자로부터 분리한 암세포를 로딩하는 단계; 제 1 주입부 (400) 및 제 2 주입부 (500)에 배양액 및 항암제를 포함하는 유체, 및 배양액을 포함하는 유체를 각각 주입하는 단계; 상기 유체가 마이크로 채널 (600)을 통과함에 따라 세포 배양 챔버 (110)간 농도 구배를 형성하는 단계를 포함하는, 상기 미세유체 칩을 이용한 항암제 내성세포 유도방법을 제공한다.
본 발명은 상기 세포 도입부 (200)에 환자로부터 분리한 암세포를 로딩하는 단계; 제 1 주입부 (400) 및 제 2 주입부 (500)에 배양액 및 항암제를 포함하는 유체, 및 배양액을 포함하는 유체를 각각 주입하는 단계; 상기 유체가 마이크로 채널 (600)을 통과함에 따라 세포 배양 챔버 (110)간 농도 구배를 형성하는 단계; 및 실시간으로 세포 배양 챔버 (110)를 촬영 및 분석하는 단계를 포함하는, 상기 미세유체 칩 (Michrofluidic chip)을 이용한 항암제 내성세포 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 암세포는 인간 교아 세포종 (glioblastoma) 세포일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 항암제는 독소루비신 (doxorubicin)일 수 있다.
본 발명에 따른 미세유체 칩은 세포 배양 챔버간 연속적인 농도구배를 형성함으로써, 효과적인 항암제 내성세포의 유도 또는 스크리닝이 가능하다. 본 발명은 종래 6개월 이상 소요되는 일반적인 항암제 내성세포 유도 및 판독 기술과 달리, 항암제 내성을 일주일 내 빠르게 배양 및 판독할 수 있는바, 환자 맞춤형 내성 극복을 위한 첨단 치료기술 개발에 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 항암제 내성세포 스크리닝용 미세유체 칩의 기본적인 구조를 나타낸 도이다.
도 2는 항암제 내성세포 스크리닝용 미세유체 칩의 가장자리 부분을 확대한 것으로서, 유체 확산부와 세포 배양 챔버, 및 챔버간 이동 통로를 제공하는 마이크로 채널을 나타낸 도이다.
도 3은 항암제 내성세포 스크리닝용 미세유체 칩 내 염색제(fluorescein, 1μM)의 농도에 따른 분포를 (a) 시각적으로 확인한 결과, 및 (b) 형광 세기 차이로 확인한 결과이다.
도 4는 시간의 경과 (1일, 3일, 5일, 7일, 9일, 12일)에 따른 항암제 내성세포 스크리닝용 미세유체 칩 내 생존한 U87 세포의 분포를 시각적으로 확인한 결과이다.
도 5는 일반 배지에서 배양된 U87 세포 (WT cell)와 항암제 내성세포 스크리닝용 미세유체 칩을 이용하여 배양된 U87-DG 세포(chip cell)간 doxorubicin 처리에 따른 세포 생존률을 비교한 결과이다.
도 6은 일반 배지에서 배양된 U87 세포 (WT cell)와 항암제 내성세포 스크리닝용 미세유체 칩을 이용하여 배양된 U87-DG 세포(chip cell)간 산화-환원 활성(redox activity)을 비교한 결과이다.
도 7은 일반 배지에서 배양된 U87 세포 (WT cell)와 항암제 내성세포 스크리닝용 미세유체 칩을 이용하여 배양된 U87-DG 세포(chip cell)간 Rh-123 배출능을 비교한 결과이다.
본 발명자들은, 세포 배양 챔버간 연속적인 농도 구배를 형성하는 항암제 내성세포 스크리닝용 미세유체 칩을 이용하여 암세포를 배양시킨 결과, 상기 암세포는 일반 배양 배지에서 배양시킨 암세포와 비교하여, 항암제 내성으로 인한 높은 세포 생존률 등을 확인하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 복수 개의 세포 배양 챔버 (110)가 방사상으로 구비된 플레이트부 (100); 상기 플레이트부 (100) 중앙 부근에 형성되어 세포를 로딩하기 위한 세포 도입부 (200); 상기 플레이트부 (100)의 둘레를 따라 형성되어 유체의 이동을 위한 공간을 제공하는 유체 확산부 (300); 상기 유체 확산부 (300)와 연결되어 배양액 및 항암제를 포함하는 유체가 주입되는 제 1 주입부 (400); 상기 유체 확산부 (300)와 연결되어 배양액을 포함하는 유체가 주입되는 제 2 주입부 (500); 및 상기 유체 확산부 (300), 세포 배양 챔버 (110), 및 세포 도입부 (200)간 유체가 이동할 수 있는 통로를 제공하는 마이크로 채널 (600); 및 상기 유체 확산부 (300)와 각각 연결되어 유체를 외부로 배출하기 위한 배출부 (700)를 포함하는, 항암제 내성세포 유도 또는 스크리닝용 미세유체 칩 (Microfluidic chip)을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "항암제 내성"이란, 항암제를 이용한 암 치료에서, 치료 초기부터 치료 효과가 없거나 초기에는 암치료 효과가 있었으나, 계속적인 치료 과정에서 암 치료 효과가 상실되는 것을 의미하며, 본 발명자들은 상기와 같은 항암제 내성을 갖는 암세포를 배양하여, 유전자 분석 등의 기초연구 및 항암제 내성 스크리닝 등의 임상분야에서 폭 넓게 활용하고자 하였다.
플레이트부 (100)는 도 1에 나타낸 바와 같이, 세포 배양 챔버 (110), 세포 도입부 (200), 유체 확산부 (300) 등으로 구성되며, 세포 도입부 (200)는 플레이트부 (100) 의 중앙에 위치하며, 유체 확산부 (300)는 플레이트부의 둘레를 따라 형성되어 있다.
세포 배양 챔버 (110)는 도 2에 나타낸 바와 같이, 플레이트부 (200)의 중앙에 형성된 세포 도입부 (200)로 로딩된 암세포가 배양되는 공간으로서, 100개 내지 300개의 복수 개로 구성된다. 또한, 세포 배양 챔버 (110)는 세포 도입부(200), 유체 확산부 (300)와 마이크로 채널 (600)로 연결되어 있어 유체가 상호간 연결할 수 있는 통로를 제공한다.
배양액 및 항암제를 포함하는 유체, 및 배양액을 포함하는 유체는 유체 확산부 (300)와 연결되어 있는 제 1 주입부 (400) 및 제 2 주입부 (500)로 각각 주입되며, 상기 유체는 유체 확산부 (300)로 이동 한 후, 마이크로 채널 (600)을 통하여 세포 배양 챔버 (110)로 이동하게 된다. 제 1 주입부 (400)와 제 2 주입부 (500)는 상호간 대향하게 위치하고 있으며, 바람직하게는 주입부 말단에는 보관부(reservoir)를 포함할 수 있다.
유체 확산부 (300)는, 유체의 이동을 위한 공간을 제공하는 구성으로서, 도 2에 나타낸 바와 같이, 상기 플레이트부 (100) 둘레를 따라 복수 개로 형성될 수 있다. 이 때, 복수 개로 형성된 유체 확산부 (300)는 각각 격리되어 있는 것이 바람직하다. 예컨대, 제 1 주입부와 연결된 유체 확산부 (310) 및 제 2 주입부와 연결된 유체 확산부 (320)로 구성될 수 있으며, 상기 제 1 주입부 (400) 및 제 2 주입부 (500)로 주입된 유체가 혼합되지 않도록 제 1 주입부와 연결된 유체 확산부 (310)와 제 2주입부와 연결된 유체 확산부 (320)는 격리된 구조를 갖는다.
배출부 (700)는 도 1에 나타낸 바와 같이, 상기 유체 확산부 (300)와 연결되어 있으며, 주입된 유체가 배출되는 통로를 제공한다. 또한, 상기 설명한 바와 같이, 상기 유체 확산부 (300)는 복수 개로 형성될 수 있는바, 상기 배출부 (700)는 각각 격리된 유체 확산부 (300)와 대응하여 복수개로 형성되는 것이 바람직하다. 예컨대, 제 1 주입부와 연결된 유체 확산부 (310)와 제 2 주입부와 연결된 유체 확산부 (320)는 각각 격리되어 있으며, 이 때, 상기 배출부 (700)는 각각 상기 제 1 주입부와 연결된 유체 확산부 (310) 및 제 2 주입부와 연결된 유체 확산부 (320)와 연결되어, 각각의 배출부 (700)로는 혼합되지 않은 유체가 배출된다.
이러한 유체 이동 과정에서 항암제의 연속구배가 농도 구배가 형성되며, 상기 농도 구배는 항암제를 포함하지 않은 유체가 주입된 제 2 주입부 (400) 방향으로 형성하며, 이러한 항암제의 농도 구배는 항암제 내성 세포의 배양 및 유도를 촉진한다.
본 발명의 일 실시예에서는 본 발명의 미세유체 칩 (Death galaxy chip)을 준비한 후, 염색제인 fluorescein을 이용하여 세포 배양 챔버간 연속적인 농도구배를 시각적으로 확인하였다 (실시예 1 내지 2 참고). 또한, 상기 Death galaxy chip을 이용하여 인간 1차 교아 세포종 (human primary glioblastoma)으로부터 유래한 U87 세포 (U87-DG 세포, chip cell)를 배양한 후 (실시예 3 내지 4 참고), 일반 배지에서 배양된 U87 세포 (U87 세포, WT cell)와 비교한 결과, U87-DG 세포는 항암제에 대한 우수한 세포 생존률, 낮은 산화-환원 활성 (redox activity), 및 Rh-123에 대한 우수한 배출능을 가지고 있음을 입증하였는바, 본 발명의 미세유체 칩을 이용하여 항암제 내성세포 유도 또는 스크리닝에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다 (실시예 5 내지 7 참고).
이에, 본 발명은 상기 세포 도입부 (200)에 환자로부터 분리한 암세포를 로딩하는 단계; 제 1 주입부 (400) 및 제 2 주입부 (500)에 배양액 및 항암제를 포함하는 유체, 및 배양액을 포함하는 유체를 각각 주입하는 단계; 상기 유체가 마이크로 채널 (600)을 통과함에 따라 세포 배양 챔버 (110)간 농도 구배를 형성하는 단계를 포함하는, 상기 미세유체 칩을 이용한 항암제 내성세포 유도방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 세포 도입부 (200)에 환자로부터 분리한 암세포를 로딩하는 단계; 제 1 주입부 (400) 및 제 2 주입부 (500)에 배양액 및 항암제를 포함하는 유체, 및 배양액을 포함하는 유체를 각각 주입하는 단계; 상기 유체가 마이크로 채널 (600)을 통과함에 따라 세포 배양 챔버 (110)간 농도 구배를 형성하는 단계; 및 실시간으로 세포 배양 챔버 (110)를 촬영 및 분석하는 단계를 포함하는, 항암제 내성세포 스크리닝용 미세유체 칩을 이용한 항암제 내성세포 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 유도 또는 스크리닝 방법에서 사용되는 용어, "항암제"란 종양의 치료를 위하여 사용되는 화학 요법제를 총칭하는 것으로서, 바람직하게는 doxorubicin일 수 있으나, 이로써 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에서 유도 또는 스크리닝의 대상이 되는 항암제 내성세포는 항암제에 대한 내성을 획득할 수 있는 암세포를 총칭하는 것으로서, 바람직하게는 인간 교아 세포종 (glioblastoma) 세포일 수 있으나, 이로써 제한되는 것은 아니다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 항암제 내성세포 스크리닝용 미세유체 칩의 준비
PDMS로 이루어진 육각형의 마이크로챔버 어레이 (microchamber array)를 종래의 세포 배양접시 위에 놓았다. 이 후, 표면간 강한 정합성 접촉 (conformal contact)을 위하여, 클린 밴치 (clean bench) 안에 수 시간 동안 보관하였다. Needle-free 실린지를 이용하여 육각형의 어레이의 중앙의 홀 (hole)로 구성된 세포 도입부를 통해 70% 에탄올을 미세유체 칩 안으로 기포의 형성이 없도록 주의를 기울이며 주입하였다. 70% 에탄올은 순차적으로 PBS과 MEM 배지로 교체되었다. 이하의 실시예에서는 항암제 내성세포 스크리닝용 미세유체 칩을 Death galaxy chip으로 명명하였다.
실시예 2. Death galaxy chip 내에서의 화학적 농도구배 시각화
Death galaxy chip을 준비한 후, 중앙의 세포 도입부를 커버 글래스(10mm Φ)(The Paul Marienfeld GmbH & Co KG., Lauda-Konigshofen, Germany)로 덮었다. 상호간 대향하게 위치한 한 쌍의 주입부에 염색제 (fluorescein, 1μM)가 포함된 MEM 배지 (300μl), 또는 염색제가 포함되지 않은 MEM 배지 (300μl)를 각각 채웠다. 6시간 후, 입체현미경 (Olympus Corporation, Tokyo, Japan)을 통해 형광 이미지를 얻었으며, 전체 배양칩의 형광강도는 Image J 소프트웨어를 통해 분석하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 염색제가 포함된 MEM 배지 (300μl)를 주입한 주입부 부근의 세포 배양 챔버에서는 높은 형광강도를, 반대편 주입부 부근에서는 낮은 형광강도를 나타냈으며, 마이크로 채널에 의해 염색제가 이동하면서 염색제가 포함되지 않은 MEM 배지 (300μl)를 주입한 주입부 방향으로 농도구배가 형성되는 것을 확인하였다.
실시예 3. Death galaxy chip 에서의 세포 배양
MEM 배지 내 약 5000개의 세포들을 피펫을 이용하여, 육각형의 어레이의 중앙의 세포 도입부를 통하여 Death galaxy chip에 로딩하였으며, 이 후, 커버 글래스로 덮었다.
상호간 대향하게 위치한 한 쌍의 주입부에 MEM 배지를 채웠으며, 이 후, 세포 배양 인큐베이터 안에서 배양시켰다. 배양 24시간 후, 주입부로부터 배지를 제거하였고, 주입부 중 하나에는 MEM 배지 (300μl)만을 채운 반면, 다른 하나에는 doxorubicin (5μM)이 포함된 MEM 배지 (300μl)를 채웠다. 이 후, 상기 세포들은 7일 이상 배양하였고, 주입부에 12시간 마다 신선한 배지와 약물을 주입하였으며, 두 주입부 내에 축적된 잔여물(wastes)들을 제거하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, doxorubicin의 농도 구배에 따라 doxorubicin (5μM)이 포함된 MEM 배지의 주입부 부근에서는 세포수가 감소함을 확인하였으며, MEM 배지 (300μl)의 주입부 부근으로 이동할수록 생존한 세포수가 증가함을 확인하였다. 이에, 상기 결과는 본 발명의 Death galaxy chip을 이용하여 항암제 내성세포를 선별, 배양할 수 있음을 의미한다.
실시예 4. 항암제 내성세포 (U87-DG 세포)의 수득
7일 동안 Death galaxy chip을 통해, 인간 1차 교아 세포종 (human primary glioblastoma)으로부터 유래한 U87 세포에 항암제인 doxorubicin을 농도 구배에 따라 노출시킨 후, 이들 중 생존한 세포 (U87-DG 세포)가 부착된 세포배양 접시의 표면으로부터 육각형의 마이크로챔버 어레이를 제거하였다. 본 발명자들은 U87-DG 세포 표현형의 특징을 분석하고자 트립신화시키고, 세포들을 수득한 후, 새로운 배양 접시로 옮겨 정상적인 성장 배지(MEM)에서 일주일간 배양시켰다.
실시예 5. 항암제 내성의 평가
3,000개의 세포 (U87 및 U87-DG 세포)를 다양한 농도 (0, 0.005, 0.01, 0.02, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 0.75, and 1 μM)의 doxorubicin이 포함된 200μl의 MEM 배지에 96 well 플레이트 씨딩을 하였다. 72 시간 동안 배양한 후, 각 well에서 생존한 세포수를 계산하였다. 세포 생존률은 doxorubicin이 포함된 well에서 생존한 세포수를 doxorubicin의 공급 없는 well에서 생존한 세포수로 나누어 계산하였다. 세포 생존률에 대한 doxorubicin의 농도를 플롯팅 (plotting)한 후, Graphpad Prism (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA)를 이용한 비선형 회귀분석(non-linear regression analysis)을 통해 IC50을 산출하였다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, U87 세포 (WT cell)와 비교하여, Death galaxy chip을 통해 배양된 U87-DG 세포(chip cell)의 세포 생존률(Cell viability)이 현저히 높았으며, U87 세포의 IC50은 0.05μM, U87-DG 세포는 1.47μM임을 확인하였다. 상기 결과는 doxorubicin의 농도 구배가 형성된 배양 조건을 제공함으로써, doxorubicin 내성을 갖는 U87세포를 효율적으로 수득할 수 있음을 의미한다.
실시예 6. 미토콘드리아의 산화-환원 활성( redox activity)의 확인
U87 세포 및 U87-DG 세포의 미토콘드리아 산화-환원력 (redox capacities)은 EZ-Cytox assay kit (Daeil Lab Service, Seoul, Korea)을 이용하여 비교하였다. 세포들을 180 μl 배양 배지에 96 well 플레이트 씨딩을 한 후, 6시간 동안 배양하였다. WST 시약 (20 μl)이 각 well에 추가되었으며, 1시간 동안 배양하였다. 미토콘드리아 탈수소효소 (mitochondrial dehydrogenase)에 의해 생산된 WST-formazan의 흡광도는 450nm에서 miroplate reader (Molecular Devices Inc. Sunnyvale, CA)를 이용하여 측정하였다.
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, U87 세포 (WT cell)와 비교하여, U87-DG 세포 (chip cell)는 낮은 흡광도 (absorbance)를 나타냈다. 상기 결과는 Death galaxy chip을 통해 배양함으로써, U87 세포 내 미토콘드리아의 유기호흡 (aerobic respiration)을 감소시킬 수 있음을 의미한다.
실시예 7. MDR efflux assay
다중약물 내성은 MDR1 및 MRP1 단백질의 기질로, 형광염색제인 Rh-123 (rhodamine 123) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 배출하는 능력을 평가하여 측정하였다. 세포는 아이스 위에서 30분 동안 Rh-123로 프리로딩 (preloading) 되었으며, 이후 37℃ 워터 배스 (water bath)에서 배양하여 염색제의 MDR 단백질 매개 배출을 유도하였다. 상기 세포들을 PI (propudium iodide) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)로 염색하였으며, 분석을 실시할 때까지 아이스 위에서 보관하였다. 배출된 염색제는 flow cytometry (BD Biosciences, San Jose, CA, USA)로 분석하였으며, PI (positive)양성 dead cell은 분석에 제외하였다. 한편, Rh-123의 배출은 fluorometric plate reader (Molecular Devices Inc. Sunnyvale, CA)을 통해 분석하였다. 세포 정지액은 염색제 배출 전 및 후에 96 well 플레이트 well안에 나누어 분배하였다. 형광 강도는 485 nm의 여기파장 (excitation wavelength) 및 530 nm의 방사파장 (emission wavelength)에서 측정하였다.
그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, U87 세포 (WT cell)와 비교하여, U87-DG 세포 (chip cell)는 MDR1 및 MRP1 단백질의 우수한 배출능을 확인하였다. 상기 결과는 Death galaxy chip을 통해 배양함으로써, 배출 펌프 (efflux pumps)를 보다 활성화시켜 U87 세포 내 약제축적률을 감소시키고, 이에 따라 doxorubicin에 대한 내성을 획득하게 됨을 의미한다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
본 발명에 따른 미세유체 칩은 세포 배양 챔버간 연속적인 농도구배를 형성함으로써, 효과적인 항암제 내성세포의 유도 또는 스크리닝이 가능하다. 본 발명은 종래 6개월 이상 소요되는 일반적인 항암제 내성세포 유도 및 판독 기술과 달리, 항암제 내성을 일주일 내 빠르게 배양 및 판독할 수 있는바, 환자 맞춤형 내성 극복을 위한 첨단 치료기술 개발에 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (10)

  1. 복수 개의 세포 배양 챔버 (110)가 방사상으로 구비된 플레이트부 (100);
    상기 플레이트부 (100) 중앙 부근에 형성되어 세포를 로딩하기 위한 세포 도입부 (200);
    상기 플레이트부 (100)의 둘레를 따라 형성되어 유체의 이동을 위한 공간을 제공하는 유체 확산부 (300);
    상기 유체 확산부 (300)와 연결되어 배양액 및 항암제를 포함하는 유체가 주입되는 제 1 주입부 (400);
    상기 유체 확산부 (300)와 연결되어 배양액을 포함하는 유체가 주입되는 제 2 주입부 (500);
    상기 유체 확산부 (300), 세포 배양 챔버 (110), 및 세포 도입부 (200)간 유체가 이동할 수 있는 통로를 제공하는 마이크로 채널 (600); 및
    상기 유체 확산부 (300)와 연결되어 유체를 외부로 배출하기 위한 배출부 (700)를 포함하는, 항암제 내성세포 유도 또는 스크리닝용 미세유체 칩 (Microfluidic chip).
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 유체 확산부 (300)는 제 1 주입부와 연결된 유체 확산부(310) 및 제 2 주입부와 연결된 유체 확산부 (320)로 구성되며, 상기 제 1 주입부와 연결된 유체 확산부 (310) 및 제 2 주입부와 연결된 유체 확산부 (320)는 격리되어 있는 것을 특징으로 하는, 미세유체 칩.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 미세유체 칩은, 상기 제 1 주입부 (400)와 제 2 주입부 (500)가 상호간에 대향하게 위치하는 것을 특징으로 하는, 미세유체 칩.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 미세유체 칩은, 제 2 주입부 방향으로 세포 배양 챔버 (110)간 유체의 연속적인 농도 구배를 형성하는 것을 특징으로 하는, 미세유체 칩.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 따른 미세유체 칩을 이용한 항암제 내성세포 유도방법으로서,
    상기 세포 도입부 (200)에 환자로부터 분리한 암세포를 로딩하는 단계;
    제 1 주입부 (400) 및 제 2 주입부 (500)에 배양액 및 항암제를 포함하는 유체, 및 배양액을 포함하는 유체를 각각 주입하는 단계; 및
    상기 유체가 마이크로 채널 (600)을 통과함에 따라 세포 배양 챔버 (110)간 농도 구배를 형성하는 단계를 포함하는, 유도 방법.
  6. 제 5항에 있어서,
    상기 암세포는 인간 교아 세포종 (glioblastoma) 세포인 것을 특징으로 하는, 유도방법.
  7. 제 5항에 있어서,
    상기 항암제는 독소루비신 (doxorubicin)인 것을 특징으로 하는, 유도방법.
  8. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 따른 미세유체 칩을 이용한 항암제 내성세포 스크리닝 방법으로서,
    상기 세포 도입부 (200)에 환자로부터 분리한 암세포를 로딩하는 단계;
    제 1 주입부 (400) 및 제 2 주입부 (500)에 배양액 및 항암제를 포함하는 유체, 및 배양액을 포함하는 유체를 각각 주입하는 단계;
    상기 유체가 마이크로 채널 (600)을 통과함에 따라 세포 배양 챔버 (110)간 농도 구배를 형성하는 단계; 및
    실시간으로 세포 배양 챔버 (110)를 촬영 및 분석하는 단계를 포함하는, 스크리닝 방법.
  9. 제 8항에 있어서,
    상기 암세포는 인간 교아 세포종 (glioblastoma) 세포인 것을 특징으로 하는, 스크리닝 방법.
  10. 제 8항에 있어서,
    상기 항암제는 독소루비신 (doxorubicin)인 것을 특징으로 하는, 스크리닝 방법.
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108148752A (zh) * 2016-12-06 2018-06-12 中国科学院大连化学物理研究所 一种基于微流控芯片的集成化药物筛选与染色方法
CN109234163A (zh) * 2018-09-06 2019-01-18 大连理工大学 一种高通量肿瘤靶向药物浓度筛选微流控器件

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SE540775C2 (en) * 2016-03-21 2018-11-06 Microfluidic device for culturing cells
KR102049556B1 (ko) * 2018-01-30 2019-11-27 서강대학교 산학협력단 미세채널 내에서 전단응력과 전이를 연구하기 위한 미세유체장치 및 그 미세유체장치를 이용한 세포의 분석방법
CN114073996B (zh) * 2021-11-24 2023-04-14 中山大学 一种嵌套式微井阵列芯片及其制备方法
KR20230110153A (ko) 2022-01-14 2023-07-21 주식회사 휴먼에이스 역-미세둑 구조가 포함된 인간 생체조직칩 및 이의 용도
CN114632564B (zh) * 2022-04-20 2024-03-08 香港城市大学深圳研究院 一种集成微流控芯片及原代循环肿瘤细胞体外处理方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20050115540A (ko) * 2004-06-04 2005-12-08 주식회사 엘지화학 마이크로 플루이딕 칩 및 그 용도
KR101038484B1 (ko) * 2009-08-18 2011-06-02 한양대학교 산학협력단 미세유체 세포칩, 이를 이용한 세포사멸 정량 분석법 및 세포영상분석장치
KR101446526B1 (ko) * 2013-05-02 2014-10-08 주식회사 퀀타매트릭스 마이크로플루이딕 멀티-웰 기반의 세포배양검사 장치
KR20140128547A (ko) * 2013-04-26 2014-11-06 나노바이오시스 주식회사 미세유체 세포칩, 이를 이용한 세포 배양 방법 및 세포 영상 분석 장치

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20050115540A (ko) * 2004-06-04 2005-12-08 주식회사 엘지화학 마이크로 플루이딕 칩 및 그 용도
KR101038484B1 (ko) * 2009-08-18 2011-06-02 한양대학교 산학협력단 미세유체 세포칩, 이를 이용한 세포사멸 정량 분석법 및 세포영상분석장치
KR20140128547A (ko) * 2013-04-26 2014-11-06 나노바이오시스 주식회사 미세유체 세포칩, 이를 이용한 세포 배양 방법 및 세포 영상 분석 장치
KR101446526B1 (ko) * 2013-05-02 2014-10-08 주식회사 퀀타매트릭스 마이크로플루이딕 멀티-웰 기반의 세포배양검사 장치

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108148752A (zh) * 2016-12-06 2018-06-12 中国科学院大连化学物理研究所 一种基于微流控芯片的集成化药物筛选与染色方法
CN108148752B (zh) * 2016-12-06 2023-09-26 中国科学院大连化学物理研究所 一种基于微流控芯片的集成化药物筛选与染色方法
CN109234163A (zh) * 2018-09-06 2019-01-18 大连理工大学 一种高通量肿瘤靶向药物浓度筛选微流控器件
CN109234163B (zh) * 2018-09-06 2021-10-15 大连理工大学 一种高通量肿瘤靶向药物浓度筛选微流控器件

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