KR102049556B1 - 미세채널 내에서 전단응력과 전이를 연구하기 위한 미세유체장치 및 그 미세유체장치를 이용한 세포의 분석방법 - Google Patents

미세채널 내에서 전단응력과 전이를 연구하기 위한 미세유체장치 및 그 미세유체장치를 이용한 세포의 분석방법 Download PDF

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Abstract

미세채널 내에서 전단응력과 전이를 연구하기 위한 미세유체장치는 미세 챔버, 유체를 위한 입구 및 출구를 포함하며 미세 챔버의 주변에 형성되어 미세 챔버 주변으로 유체를 통과시키는 미세채널, 및 미세채널 중 복수의 위치에서 미세채널과 미세 챔버를 연결하는 복수 그룹의 브릿지 채널을 포함하며, 브릿지 채널의 단면적은 미세채널의 단면적보다 작은 것을 특징으로 한다.

Description

미세채널 내에서 전단응력과 전이를 연구하기 위한 미세유체장치 및 그 미세유체장치를 이용한 세포의 분석방법 {MICROFLUIDIC DEVICE FOR STUDYING SHEAR STRESS AND TUMOR MIGRATION IN MICROCHANNEL AND METHOD OF ANALYZING CELLS USING THE MICROFLUIDIC DEVICE}
본 발명은 미세유체장치에 관한 것으로서, 보다 자세하게는, 미세채널 내의 세포와 관련하여 전단응력 및 전이가 미치는 연구를 위한 미세유체장치 및 그 미세유체장치를 이용한 세포의 분석방법에 관한 것이다.
혈관은 일종의 미세채널로서 수많은 세포 및 종양 등이 통과하는 통로가 될 수 있다. 하지만, 종래까지는 미세채널 내에서 전단응력이나 종양의 전이와 관련하여 전단응력, 유속 등이 세포에 미치는 영향을 연구하는 것이 미흡했으며 이들을 정밀하게 모사할 수 있는 방법이 많지 않았다.
한국등록특허 제10-1370931호를 보면, 전단응력과 전기장을 독립적으로 제어하면서 외부 자극에 대한 세포의 반응을 실시간으로 분석할 수 있는 세포배양장치가 개시되어 있다. 하지만, 이 등록특허 역시 전단응력에 따른 세포의 변화를 한번에 비교할 수 없다는 점에서 단점이 지적될 수 있다.
본 발명은 전단응력과 전이에 관한 연구를 위한 미세유체장치를 제공하되, 채널을 적절하게 디자인하여 복수의 구역에 따라 전단응력의 구배를 다르게 나타내어 다양한 현상을 연구할 수 있는 미세유체장치를 제공한다.
본 발명은 미세유체장치 내에서 각 구역별로 전단응력에 따른 세포의 종횡비를 조사할 수 있으며, 전단응력 조건을 최적화 하기에 적합한 미세유체장치를 제공한다.
본 발명은 다양한 세포에 대한 조건을 빠르게 최적화 할 수 있으며, 하나의 미세유체장치 또는 미세유체칩을 이용하여 하이드로젤 기반으로 전단응력과 종양의 전이를 연구할 수 있어 혈관에서 일어나는 현상들을 더 정밀하게 모사할 수 있는 미세유체장치를 제공한다.
상술한 본 발명의 목적들을 달성하기 위한 본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 미세채널 내에서 전단응력과 전이를 연구하기 위한 미세유체장치는 미세 챔버, 유체를 위한 입구 및 출구를 포함하며 미세 챔버의 주변에 형성되어 미세 챔버 주변으로 유체를 통과시키는 미세채널, 및 미세채널 중 복수의 위치에서 미세채널과 미세 챔버를 연결하는 복수 그룹의 브릿지 채널을 포함하며, 브릿지 채널의 단면적은 미세채널의 단면적보다 작은 것을 특징으로 한다.
미세 챔버는 중앙부에 위치하며, 미세채널은 미세 챔버를 중심에 두고 그 주변을 선회하면서 형성될 수 있으며, 바람직하게는 미세채널은 원형으로 형성되고 미세 챔버는 그 중심에 위치할 수 있다.
각 그룹의 브릿지 채널은 동일 개수 및 동일 치수로 제공되며, 각 그룹의 브릿지 채널 간의 유체 이동 거리(D)는 각 그룹의 브릿지 채널의 치수(W)보다 길게 형성될 수 있다.
미세 챔버는 중앙의 입구를 중심으로 복수개로 제공되며, 일단이 상기 중앙의 입구에 연결되고, 타단에는 출구가 형성되며, 복수개의 미세 챔버에서 브릿지 채널과 연결된 부분은 미세채널로부터 동일 거리만큼 이격될 수 있다. 또한, 복수의 미세 챔버는 L-자형으로 형성되고, 그 일단이 중앙의 입구에 연결되고, 타단의 변에 해당하는 부분이 미세채널에 평행하게 배치되어 동일 거리만큼 이격되도록 할 수 있고, 이렇게 되면 미세채널이 원형으로 형성되는 것이 유리할 수 있다.
미세 챔버 및 브릿지 채널에 생체적합성이 높은 젤라틴 메타 아크릴레이트(GelMA)를 제공할 수 있으며, GelMA를 이용하여 세포가 역으로 이동하는 방지할 수 있고, GelMa에 특정 인자를 함유하여 미세채널에 포함된 세포의 이동을 유도할 수도 있다.
상술한 본 발명의 목적들을 달성하기 위한 본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 중앙에 위치하는 미세 챔버, 미세 챔버의 주변에 형성되는 원형 미세채널, 및 원형 미세채널 중 복수의 위치에서 원형 미세채널과 미세 챔버를 연결하는 복수 그룹의 브릿지 채널을 포함하는 미세유체장치를 이용하여 전단응력에 따른 세포의 변화를 분석하기 위한 방법은, 원형 미세채널로 세포가 포함된 유체를 소정의 유속으로 공급하는 단계, 및 원형 미세채널과 연결된 브릿지 채널의 입구에서 세포를 분석하는 단계를 구비할 수 있으며, 브릿지 채널의 단면적은 원형 미세채널의 단면적보다 작게 형성될 수 있다.
미세 챔버는 중앙의 입구를 중심으로 복수개로 제공되며, 일단이 상기 중앙의 입구에 연결되고, 타단에는 출구가 형성되며, 복수개의 미세 챔버에서 브릿지 채널과 연결된 부분은 미세채널로부터 동일 거리만큼 이격되도록 형성할 수 있다.
미세 챔버 및 브릿지 채널에 생체적합성이 높은 젤라틴 메타 아크릴레이트(GelMA)를 제공하여 세포가 세포 챔버로 이동하는 방지할 수 있으며, 원형 미세채널 내에서 세포를 배양하는 단계를 더 포함할 수도 있다.
상술한 본 발명의 목적들을 달성하기 위한 본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 중앙에 위치하는 미세 챔버, 미세 챔버의 주변에 형성되는 원형 미세채널, 및 원형 미세채널 중 복수의 위치에서 원형 미세채널과 미세 챔버를 연결하는 복수 그룹의 브릿지 채널을 포함하는 미세유체장치를 이용하여 전단응력에 따른 암세포의 이동을 분석하기 위한 방법은, 원형 미세채널로 암세포가 포함된 유체를 소정의 유속으로 공급하는 단계, 원형 미세채널 내에서 암세포를 배양하는 단계, 및 원형 미세채널과 연결된 브릿지 채널로 암세포가 이동하는 것을 분석하는 단계를 구비하며, 브릿지 채널의 단면적은 원형 미세채널의 단면적보다 작게 형성할 수 있다.
미세 챔버는 중앙의 입구를 중심으로 복수개로 제공되며, 일단이 중앙의 입구에 연결되고, 타단에는 출구가 형성되며, 복수개의 미세 챔버에서 브릿지 채널과 연결된 부분은 미세채널로부터 동일 거리만큼 이격되도록 형성할 수 있으며, 미세 챔버 및 브릿지 채널에 생체적합성이 높은 젤라틴 메타 아크릴레이트(GelMA)를 제공하고, 젤라틴 메타 아크릴레이트에 혈관 내피 성장 인자를 함유하여 브릿지 채널 내에서의 암세포의 이동을 유도할 수 있다.
본 발명을 통해서 전단 응력 및 암세포 이동을 연구하기 위해 3차원(3D) 하이드로젤 기반 미세유체장치를 개발하고 최적화할 수 있음을 확인할 수 있다. 미세유체장치에서 인간 제대혈 정맥 내피 세포 (HUVECs)와 유방암 세포주(MDA-MB-231)를 배양하고, 원형 모양의 미세유체 채널에서 HUVEC에 전단 응력의 영향을 조사할 수 있다. 결과적으로 원형 모양의 미세유체 채널에서 2일 동안 전단 응력에 노출 된 HUVEC이 길게 늘어나고 유체 방향에 준하여 정렬되는 경향을 확인하였으며, 유방암 세포주가 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)를 함유한 젤라틴 메타 아크릴레이트(Gelatin Methacrylate, GelMA) 하이드로젤쪽으로 이동한다는 것을 분석할 수 있다. 그러므로 이 하이드로젤 기반 미세유체장치는 전단응력 및 종양 이동 응용을 연구하는 유용한 도구로 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 미세채널 내에서 전단응력과 전이를 연구하기 위한 미세유체장치를 설명하기 위한 도면이다.
도 2는 도 1의 미세유체장치에서 구역을 설명하기 위한 도면이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 미세채널 내에서 전단응력과 전이를 연구하기 위한 미세유체장치를 대상으로 한 형광 사진을 설명하기 위한 도면이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 미세채널 내에서 전단응력과 전이를 연구하기 위한 미세유체장치에서 원형 미세채널의 높이를 변경하여 시뮬레이션을 한 결과를 설명하기 위한 도면이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 미세채널 내에서 전단응력과 전이를 연구하기 위한 미세유체장치에서 원형 미세채널로 주입되는 유체의 속도를 변경하여 시뮬레이션을 한 결과를 설명하기 위한 도면이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 미세유체장치에서 2일간 배양된 HUVEC 세포의 공초점 형광 현미경 사진을 설명하기 위한 도면이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 미세유체장치에서 2일간 유체 흐름에 노출된 HUVEC 세포의 생존율 그래프를 설명하기 위한 도면이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 미세유체장치에서 2일간 유체 흐름에 노출된 HUVEC 세포의 종횡비 그래프를 설명하기 위한 도면이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 미세유체장치에서 2일간 유체 흐름에 노출된 HUVEC 세포의 빈도 그래프를 설명하기 위한 도면이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 미세유체장치에서 전이성 유방암 세포의 이동을 평가하기 위해 브릿지 채널에서 공초점 형광 현미경 사진을 설명하기 위한 도면이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 미세유체장치에서 전이성 유방암 세포의 이동을 평가하기 위해 혈관 내피 성장 인자(VEGF)가 함유된 GelMA로 이동한 전이성 유방암 세포의 이동을 분석하기 위한 그래프를 설명하기 위한 도면이다.
이하 첨부된 도면들을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시예를 상세하게 설명하지만, 본 발명이 실시예에 의해 제한되거나 한정되는 것은 아니다. 참고로, 본 설명에서 동일한 번호는 실질적으로 동일한 요소를 지칭하며, 이러한 규칙 하에서 다른 도면에 기재된 내용을 인용하여 설명할 수 있고, 당업자에게 자명하다고 판단되거나 반복되는 내용은 생략될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 미세채널 내에서 전단응력과 전이를 연구하기 위한 미세유체장치를 설명하기 위한 도면이고, 도 2는 도 1의 미세유체장치에서 구역을 설명하기 위한 도면이며, 도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 미세채널 내에서 전단응력과 전이를 연구하기 위한 미세유체장치를 대상으로 한 형광 사진을 설명하기 위한 도면이다.
도 1 및 도 2를 참조하면, 본 실시예에 따른 미세유체장치(100)는 멀티층 소프트 리소그래피(Multi-layer soft lithograph) 기술을 이용하여 형성할 수 있다. 미세유체장치(100)는 중앙부에 위치한 미세 챔버(120), 미세 챔버(120)를 중심으로 그 주변에 형성된 원형 미세채널(130) 및 미세 챔버(120)와 원형 미세채널(130)을 연결하는 브릿지 채널(140)을 포함할 수 있다.
여기서, 브릿지 채널(140)은 SU-8을 이용한 네가티브 포토레지스트(negative photoresist(PR))를 이용하여 형성될 수 있으며, 구체적으로 스핀 코팅한 뒤에 자외선(UV)에 약 60초 동안 노출하여 실리콘 웨이퍼(110)를 형성하고, 실리콘 웨이퍼 상에 약 40㎛ 두께로 브릿지 채널(140)을 위한 패턴을 형성할 수 있다.
브릿지 채널(140)을 위한 실리콘 웨이퍼에서, 같은 방법으로 SU-8을 이용한 네가티브 포토레지스트를 이용하여 약 100㎛ 두께로 원형 미세채널(130)을 형성할 수 있다.
브릿지 채널(140)과 원형 미세채널(130)이 패턴된 실리콘 웨이퍼에 같은 방법으로 약 250㎛ 두께로 미세 챔버(120)를 만들어 미세유체장치(100)를 준비할 수 있다. 그리고, PDMS(poly(dimethyl siloxane))로 마이크로 몰드를 제조하고, PDMS 몰드(115)를 플라즈마 처리한 뒤에 실리콘 웨이퍼(110)에 붙여 사용할 수 있다.
원형 미세채널(130)로 유입된 유체는 시계방향으로 이동하여 출구로 배출될 수 있으며, 입구에서부터 A1, A2, A3 및 A4 구역으로 설정할 수 있다. 본 실시예에서 원형 미세채널(130)은 4개의 구역으로 구분될 수 있지만, 원형이 아닌 곡선이나 직선 형상으로 미세채널이 형성될 수 있고, 구역의 개수도 4개가 아닌 다른 복수로 선택될 수가 있다.
본 실시예에서 브릿지 채널(140)은 4개의 구역에서 4개의 그룹을 형성하며, 각 그룹의 브릿지 채널(140)에는 5개씩 제공될 수 있다. 각 그룹의 브릿지 채널(140)은 동일 개수 및 동일 치수로 제공되는 것이 바람직하며, 각 그룹의 브릿지 채널(140) 간의 유체 이동 거리(D)는 각 그룹의 브릿지 채널의 폭 또는 치수(W)보다 길게 형성될 수 있다.
또한, 중앙의 미세 챔버(120)에서는 중앙에서부터 유체가 유입되고, 각 브릿지 채널(140)에 대응하는 미세 챔버(120)로 공급된 후, L-자로 절곡된 챔버의 단부에서 외부로 다시 배출될 수 있다.
도 3을 참조하면, 원형 미세채널(130)의 입구로 로다민B(Rhodamine B)가 혼합된 액체를 제공하고, 미세 챔버(120)에는 형광색소 FITC가 혼합된 용액을 공급하는 경우를 확인할 수 있다.
전단응력 구배를 위한 모델링
미세유체장치(100)를 이용하여, 유한요소해석 방법을 통해 전단 응력 구배를 모델링할 수 있다. 시뮬레이션 상에서 작동 유체는 물로 설정할 수 있으며, 미세채널 내에서의 유동이기 때문에, 모든 유동은 층류 및 비압축성 유동으로 간주될 수 있다.
상기 시뮬레이션에서는, 아래와 같이, 뉴턴 유체의 흐름을 분석하는 나비어스톡스 방정식과 연속 방정식을 유동 해석을 위한 지배 방정식으로 사용하였다(수학식 1 및 2 참조).
[수학식 1]
Figure 112018010380500-pat00001
[수학식 2]
Figure 112018010380500-pat00002
여기서 u는 속도 벡터, P는 압력, g는 중력상수이며, ρ와 μ는 각각 유체의 밀도와 점도를 의미할 수 있다. 일반적인 물의 물성치에 따르면 ρ는 1,000kg/m3이고, μ는 1mPas 일 수 있다.
시뮬레이션을 위한 모델의 모든 벽은 논슬립(non-slip) 경계로 지정되어 속도가 0으로 가정하며, 유체는 지정된 출구로만 빠져나가며 벽면을 통과하지 못하도록 설정할 수 있다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 미세채널 내에서 전단응력과 전이를 연구하기 위한 미세유체장치에서 원형 미세채널의 높이를 변경하여 시뮬레이션을 한 결과를 설명하기 위한 도면이며, 도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 미세채널 내에서 전단응력과 전이를 연구하기 위한 미세유체장치에서 원형 미세채널로 주입되는 유체의 속도를 변경하여 시뮬레이션을 한 결과를 설명하기 위한 도면이다.
참고로, 도 4에서는 다른 치수들은 고정시킨 상태로 원형 미세채널(130)의 높이를 50, 100, 150 및 200㎛로 변경하여 시뮬레이션을 수행한 결과가 도시되어 있으며, 도 5에서는 원형 미세채널(130)의 높이를 100㎛로 고정한 상태에서 입구에 주입되는 유체의 선속도를 40, 80, 120 및 160mm/s로 변경하여 시뮬레이션을 수행한 결과가 도시되어 있다. 이때 모든 시뮬레이션에서 출구 압력은 0으로 설정되었다.
먼저 브릿지 채널이 없다고 가정하면, 속도와 전단응력에 대한 시뮬레이션 분석 결과로 유체가 흘러가는 θ 방향으로는 속도와 전단응력 모두 변화가 거의 없음을 확인할 수 있다. 여기서, 속도의 변화를 일으키는 가장 간단한 방법은 원형 미세채널의 단면적 혹은 흐르는 유체의 양에 변화를 주는 것이다.
도 4 및 도 5를 참조하면, 원형 미세채널(130)과 미세 챔버(120)를 연결하는 브릿지 채널(140)을 추가한 후, 원형 미세채널(130)에서 미세 챔버(120)로 유체가 이동하도록 하였다. 이러한 흐름은 원형 미세채널(130)을 따라 흐르는 유체의 유속을 θ 방향에 따라 감소시킬 수가 있으며, 미세유체장치(100)에서 전단응력 구배를 발생시킬 수 있다.
브릿지 채널이 없는 장치와 비교하였을 때, 브릿지 채널(140)을 포함하는 미세유체장치(100)에서는 전단응력 구배가 생성되고 있음을 시뮬레이션 결과를 통해 확인할 수 있다.
본 실시예에서는 전단응력의 크기가 세포에 얼마나 많은 영향을 주는지 분석하기 위해 브릿지 채널을 연속적으로 만들지 않고, 브릿지 채널(140)을 국부적으로 만들어 브릿지 채널(140)이 삽입되지 않은 구간에서는 동일한 전단응력을 세포에 전달할 수 있게 하였다.
각 영역(A1~A4)의 도입부에만 브릿지 채널(140)을 내장하였기에 미세유체장치(100)에서의 유량은 식 [수학식 4]와 같이 나타낼 수 있다. 그리고 [수학식 4]를 통해서 속도와 전단응력에 관한 [수학식 5] 및 [수학식 6]을 각각 유도할 수 있다.
[수학식 4]
Figure 112018010380500-pat00003
[수학식 5]
Figure 112018010380500-pat00004
[수학식 6]
Figure 112018010380500-pat00005
여기서 n은 각 영역의 브릿지 채널의 개수, i는 영역의 번호(0,1,2,3,4)이고, Qθ,i은 θ방향에 따른 i영역에서 원형 미세채널 내에서의 유량, Qr은 브릿지 채널로 누출되는 유량을 의미하며 n은 브릿지 채널의 개수이다.
[수학식 4]는 유량보존에 의해 유도되었으며, [수학식 4]에서 양변을 Aθ와 Ar로 나누어 [수학식 5]를 얻을 수 있다. 여기서 Aθ와 Ar은 각각 원형 미세채널과 브릿지 채널의 단면적을 의미한다. 또한 [수학식 5]의 양변을 r로 미분하여 전단응력 τ에 대해 정리한 [수학식 6]를 유도할 수 있다.
위와 같은 분석적 해법에 따르면 전단응력 구배의 영향을 주는 인자는 속도, 단면적 비율 및 브릿지 채널의 개수로 나타낼 수 있다. 그 중에서 속도와 단면적 비율이 전단응력에 주는 영향을 시뮬레이션을 통해 분석할 수 있다. 브릿지 채널의 개수(n)는 유체의 유출량을 제어한다는 측면에서 단면적 비율과 유사한 의미를 가지기 때문에 고려하지 않을 수 있다.
원형 미세채널(130)의 높이에 따른 시뮬레이션 결과, 도 4의 (b)에 도시된 바와 같이, 낮은 높이로 인해 원형 미세채널(130)에 대한 브릿지 채널(140)의 단면적 비율이 커지며, 인접한 영역의 속도 차이가 크게 발생하기 때문에 원형 미세채널(130)의 높이가 낮을수록 더 큰 전단 응력 구배가 형성될 수 있다.
전단응력 구배만 고려하면 높이가 가장 작은 50㎛가 변화에 따른 비교에 적합해 보이나, 원형 미세채널(130)의 높이가 브릿지 채널(140)과 너무 차이가 작으면 원형 미세채널(130)의 세포가 브릿지 채널(140)로 매우 쉽게 이동할 수 있다는 문제가 발생할 수 있고, 이와 같은 이동은 예상치 못한 변수를 발생시킬 수 있으므로 도 5와 관련된 시뮬레이션에서는 원형 미세채널(130)의 높이를 100㎛로 설정했다.
도 5를 참조하면, 입구에서의 유체 주입 속도에 따른 전단응력 구배를 분석할 수 있다. 도 5의 (b)를 보면, 선속도의 변화는 전단응력의 절대 크기만 변화시킬 뿐, 이전 영역에 비교해서 같은 비율로 전단응력이 감소하는 것을 볼 수 있다. 하지만, 너무 빠른 속도로 유체를 주입할 경우, 원형 미세채널(130)의 세포가 정착하지 못하고 유체와 함께 흘러갈 수 있기 때문에 최적의 속도로 120mm/s를 선정할 수 있다.
또한, 원형 미세채널(130)이 θ방향으로 채널의 넓이가 변하는 경우에도 전단응력 구배가 훨씬 더 두드러진다는 사실을 발견할 수 있다. 위의 시뮬레이션 모델은 이전 영역에 비해 현재 영역의 너비가 두 배가 되도록 구현되었는데, 실제 전단응력 수준의 차이는 2배 이상으로 차이가 난 것을 알 수 있다. 이러한 차이는 유체가 브릿지 채널로 빠져나가는 (∂υr /∂r)의 효과로 인해 더 큰 차이가 발생한 것으로 설명할 수 있다.
더욱이 [수학식 6]에 따르면, (∂υr /∂r)을 제어하는 것도 전단응력 구배 형성의 한 요인이 될 수 있는데, 본 시뮬레이션에서 사용된 미세유체장치에서는 브릿지 채널에 GelMA(150)를 사용하여 세포가 제약 없이 세포 챔버로 이동하는 것을 막을 수 있다. 그 결과로 (∂υr /∂r)이 감소하며 실제 전단응력의 감소는 시뮬레이션보다 더 작다는 것을 예상할 수 있다.
GelMA로서 타입A Porcine skin gelatin과 Methacrylate Anhydride로 합성한 생체적합성이 우수한 하이드로젤을 이용할 수 있다. 광개시제(photo initiator)를 넣어서 섞어준 GelMA를 미세유체장치(100) 가운데 입구로 주입하여 미세 챔버(120)와 브릿지 채널(140)에 채워진 것을 확인한 후, 자외선을 조사하면 광 가교 결합을 할 수 있다.
미세유체장치를 이용한 세포 변형의 분석
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 미세유체장치에서 2일간 배양된 HUVEC 세포의 공초점 형광 현미경 사진을 설명하기 위한 도면이고, 도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 미세유체장치에서 2일간 유체 흐름에 노출된 HUVEC 세포의 생존율 그래프를 설명하기 위한 도면이고, 도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 미세유체장치에서 2일간 유체 흐름에 노출된 HUVEC 세포의 종횡비 그래프를 설명하기 위한 도면이고, 도 9은 본 발명의 일 실시예에 따른 미세유체장치에서 2일간 유체 흐름에 노출된 HUVEC 세포의 빈도 그래프를 설명하기 위한 도면이다.
도 6 내지 도 9를 참조하면, GelMA가 채워진 미세유체장치(100)에서 원형 미세채널(130)의 입구로 세포를 주입할 수 있다. 전단응력에 따른 세포의 변화를 알아보기 위해 원형 미세채널(130)에 인간 제대혈 내피세포(HUVEC)를 주입하였다.
24시간 뒤 HUVEC 세포가 접착된 것을 확인한 후, 시린지 펌프를 이용하여 약 120mm/s로 세포 배양액을 이틀간 30분간 주입하여 주었다. 브릿지 채널(140)이 연결된 위치 부근을 기준으로 분석하였고, 전단응력이 가장 강한 범위부터 A1, A2, A3, A4 영역을 분석하였다. 브릿지 채널(140)이 연결된 네 곳의 서로 다른 전단응력에서 이틀간 세포 생존율을 확인할 수 있다.
도 7을 보면, A1 영역에서 생존율이 하루 뒤 약 4.3%, 이틀 뒤 약 4.6%로 하루 뒤부터 생존율이 크게 줄어든 것을 확인할 수 있다. 반면, A4 영역에서 생존율이 하루 뒤 약 96.8%, 이틀 뒤 약 100.1%로 생존율이 다시 유체의 흐름을 주기 전처럼 증가하는 것을 확인할 수 있다.
미세유체장치(100)의 분석 범위에서 흐름의 방향에 따른 세포의 형태 변화를 확인할 수 있다. 도 9를 보면, A1 영역에서 31°~60°로 26.3%의 HUVEC 세포가 정렬되었고, 61°~90°로 31.6%의 HUVEC 세포가 정렬된 것을 확인하였다. A4 영역에서 0°~(-29)°로 52.5%의 HUVEC 세포가 정렬되었고, (-30)°~(-59)°로 42.5%의 HUVEC 세포가 정렬된 것을 확인하였다. 흐름에 따른 전단 응력에 노출된 HUVEC 세포가 길게 늘어나고 유체 방향에 준하여 정렬되는 경향을 확인할 수 있다.
미세유체장치를 이용한 암세포 이동의 분석
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 미세유체장치에서 전이성 유방암 세포의 이동을 평가하기 위해 브릿지 채널에서 공초점 형광 현미경 사진을 설명하기 위한 도면이고, 도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 미세유체장치에서 전이성 유방암 세포의 이동을 평가하기 위해 혈관 내피 성장 인자(VEGF)가 함유된 GelMA로 이동한 전이성 유방암 세포의 이동을 분석하기 위한 그래프를 설명하기 위한 도면이다.
도 10 및 도 11을 참조하면, 미세유체장치(100)에서 세포 거동을 알아보기 위해 원형 미세채널(130)에 전이성 유방암 세포(MDA-MB-231)를 주입하였다. 24시간 뒤 MDA-MB-231 세포가 접착된 것을 확인한 후, 4일 동안 GelMA에 혈관 내피 성장 인자(VEGF)를 함유시켰다. 원형 미세채널(130)의 MDA-MB-231이 브릿지 채널(140)을 통해 VEGF를 함유한 GelMA가 있는 미세 챔버(120)로 이동하는 것을 확인할 수 있다. 4일 후 MDA-MB-231 세포의 총 이동 평균 거리가 약 950㎛임을 확인할 수 있다.
본 발명을 통해서 전단 응력 및 암세포 이동을 연구하기 위해 3차원(3D) 하이드로젤 기반 미세유체장치를 개발하고 최적화할 수 있음을 확인할 수 있다. 미세유체장치에서 인간 제대혈 정맥 내피 세포 (HUVECs)와 유방암 세포주(MDA-MB-231)를 배양하고, 원형 모양의 미세유체 채널에서 HUVEC에 전단 응력의 영향을 조사할 수 있다. 결과적으로 원형 모양의 미세유체 채널에서 2일 동안 전단 응력에 노출 된 HUVEC이 길게 늘어나고 유체 방향에 준하여 정렬되는 경향을 확인하였으며, 유방암 세포주가 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)를 함유한 젤라틴 메타 아크릴레이트(Gelatin Methacrylate, GelMA) 하이드로젤쪽으로 이동한다는 것을 분석할 수 있다. 그러므로 이 하이드로젤 기반 미세유체장치는 전단응력 및 종양 이동 응용을 연구하는 유용한 도구로 사용될 수 있다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만 해당 기술분야의 숙련된 당업자라면 하기의 청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.
100 : 미세유체장치 120 : 미세 챔버
130 : 원형 미세채널 140 : 브릿지 채널

Claims (14)

  1. 내부에 장애물이 없는 미세 챔버;
    유체를 위한 단일 입구 및 단일 출구를 포함하며, 상기 미세 챔버의 주변에 형성되어 상기 미세 챔버 주변으로 상기 유체를 통과시키는 하나의 미세채널; 및
    상기 미세채널 중 복수의 위치에서 상기 미세채널과 상기 미세 챔버를 연결하는 복수 그룹의 브릿지 채널;을 포함하며,
    상기 브릿지 채널의 단면적은 상기 미세채널의 단면적보다 작으며, 상기 브릿지 채널의 높이는 상기 미세채널 및 상기 미세 챔버의 높이보다 작으며,
    상기 미세채널로 상기 유체를 공급하여 상기 브릿지 채널의 각 그룹에서 전단응력에 따른 세포의 반응을 관찰할 수 있으며, 상기 유체의 공급을 중단한 상태에서는 상기 브릿지 채널 주변에서의 세포 전이를 관찰할 수 있는 것을 특징으로 하는 미세채널 내에서 전단응력과 전이를 연구하기 위한 미세유체장치.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 미세 챔버는 중앙부에 위치하며, 상기 미세채널은 상기 미세 챔버를 중심에 두고 그 주변을 선회하면서 형성된 것을 특징으로 하는 미세채널 내에서 전단응력과 전이를 연구하기 위한 미세유체장치.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 미세채널은 원형으로 형성된 것을 특징으로 하는 미세채널 내에서 전단응력과 전이를 연구하기 위한 미세유체장치.
  4. 제2항에 있어서,
    각 그룹의 상기 브릿지 채널은 동일 개수 및 동일 치수로 제공되며, 상기 각 그룹의 상기 브릿지 채널 간의 유체 이동 거리(D)는 상기 각 그룹의 상기 브릿지 채널의 치수(W)보다 길게 형성되는 것을 특징으로 하는 미세채널 내에서 전단응력과 전이를 연구하기 위한 미세유체장치.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 미세 챔버는 중앙의 입구를 중심으로 복수개로 제공되며, 일단이 상기 중앙의 입구에 연결되고, 타단에는 출구가 형성되며, 복수개의 상기 미세 챔버에서 상기 브릿지 채널과 연결된 부분은 상기 미세채널로부터 동일 거리만큼 이격된 것을 특징으로 하는 미세채널 내에서 전단응력과 전이를 연구하기 위한 미세유체장치.
  6. 제5항에 있어서,
    복수의 상기 미세 챔버는 L-자형으로 형성된 것을 특징으로 하는 미세채널 내에서 전단응력과 전이를 연구하기 위한 미세유체장치.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 미세 챔버 및 상기 브릿지 채널에 생체적합성이 높은 젤라틴 메타 아크릴레이트(GelMA)가 제공되는 것을 특징으로 하는 미세채널 내에서 전단응력과 전이를 연구하기 위한 미세유체장치.
  8. 중앙에 위치하며 내부에 장애물이 없는 미세 챔버, 상기 미세 챔버의 주변에 형성되며 단일 입구 및 단일 출구를 포함하는 하나의 원형 미세채널, 및 상기 원형 미세채널 중 복수의 위치에서 상기 원형 미세채널과 상기 미세 챔버를 연결하는 복수 그룹의 브릿지 채널을 포함하는 미세유체장치를 이용하여, 하나의 미세유체장치에서 전단응력에 따른 세포의 변화 및 세포의 전이를 분석하기 위한 방법에 있어서,
    상기 원형 미세채널로 세포가 포함된 유체를 소정의 유속으로 공급하는 단계;
    상기 원형 미세채널과 연결된 상기 브릿지 채널의 입구에서 상기 세포를 분석하는 단계;
    상기 유체의 공급을 차단하는 단계; 및
    생존율이 상이한 상기 브릿지 채널의 각 그룹에서 상기 브릿지 채널을 따라 전이하는 상기 세포를 관찰하는 단계;를 구비하며,
    상기 브릿지 채널의 단면적은 상기 원형 미세채널의 단면적보다 작으며, 상기 브릿지 채널의 높이는 상기 미세채널 및 상기 미세 챔버의 높이보다 작으며,
    상기 미세채널로 상기 유체를 공급하여 상기 브릿지 채널의 각 그룹에서 전단응력에 따른 세포의 반응을 관찰할 수 있으며, 상기 유체의 공급을 중단한 상태에서는 상기 브릿지 채널 주변에서의 세포 전이를 관찰할 수 있는 것을 특징으로 하는 미세유체장치를 이용한 세포의 분석방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 미세 챔버는 중앙의 입구를 중심으로 복수개로 제공되며, 일단이 상기 중앙의 입구에 연결되고, 타단에는 출구가 형성되며, 복수개의 상기 미세 챔버에서 상기 브릿지 채널과 연결된 부분은 상기 미세채널로부터 동일 거리만큼 이격되도록 하는 것을 특징으로 하는 미세유체장치를 이용한 세포의 분석방법.
  10. 제8항에 있어서,
    상기 미세 챔버 및 상기 브릿지 채널에 생체적합성이 높은 젤라틴 메타 아크릴레이트(GelMA)를 제공하여 상기 세포가 세포 챔버로 이동하는 방지하는 것을 특징으로 하는 미세유체장치를 이용한 세포의 분석방법.
  11. 제8항에 있어서,
    상기 원형 미세채널 내에서 상기 세포를 배양하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 미세유체장치를 이용한 세포의 분석방법.
  12. 중앙에 위치하며 내부에 장애물이 없는 미세 챔버, 상기 미세 챔버의 주변에 형성되며 단일 입구 및 단일 출구를 포함하는 하나의 원형 미세채널, 및 상기 원형 미세채널 중 복수의 위치에서 상기 원형 미세채널과 상기 미세 챔버를 연결하는 복수 그룹의 브릿지 채널을 포함하는 미세유체장치를 이용하여, 하나의 미세유체장치에서 전단응력에 따른 암세포의 변화 및 암세포의 전이를 분석하기 위한 방법에 있어서,
    상기 원형 미세채널로 암세포가 포함된 유체를 소정의 유속으로 공급하는 단계;
    상기 유체의 공급을 차단하는 단계;
    상기 원형 미세채널 내에서 상기 암세포를 배양하는 단계;
    상기 미세 챔버에 약물을 공급하는 단계; 및
    상기 원형 미세채널과 연결된 상기 브릿지 채널로 상기 암세포가 전이하는 것을 분석하는 단계;를 구비하며,
    상기 브릿지 채널의 단면적은 상기 원형 미세채널의 단면적보다 작으며, 상기 브릿지 채널의 높이는 상기 미세채널 및 상기 미세 챔버의 높이보다 작으며,
    상기 미세채널로 상기 유체를 공급하여 상기 브릿지 채널의 각 그룹에서 전단응력에 따른 암세포의 반응을 관찰할 수 있으며, 상기 유체의 공급을 중단한 상태에서는 약물에 따른 상기 브릿지 채널 주변에서의 암세포 전이를 관찰할 수 있는 것을 특징으로 하는 미세유체장치를 이용한 세포의 분석방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 미세 챔버는 중앙의 입구를 중심으로 복수개로 제공되며, 일단이 상기 중앙의 입구에 연결되고, 타단에는 출구가 형성되며, 복수개의 상기 미세 챔버에서 상기 브릿지 채널과 연결된 부분은 상기 미세채널로부터 동일 거리만큼 이격되도록 하는 것을 특징으로 하는 미세유체장치를 이용한 세포의 분석방법.
  14. 제12항에 있어서,
    상기 미세 챔버 및 상기 브릿지 채널에 생체적합성이 높은 젤라틴 메타 아크릴레이트(GelMA)를 제공하고, 상기 젤라틴 메타 아크릴레이트에 혈관 내피 성장 인자를 함유하여 상기 브릿지 채널 내에서의 상기 암세포의 이동을 분석하는 것을 특징으로 하는 미세유체장치를 이용한 세포의 분석방법.
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