CN102666834B - 用于细胞培养的微尺度多流体流生物反应器 - Google Patents

Abstract

微流体生物反应器装置可以具有特征在于通过膜分开的两个聚合物层中限定的相互交通的微通道。与一个层中的微通道相关的几何参数沿这些通道长度可以变化。

Description

用于细胞培养的微尺度多流体流生物反应器

相关申请的交叉参考

本申请要求2009年10月5日提交的共同待审申请，美国专利申请号12/573,561的优先权及其利益，将该文全文作为参考引入本文。

发明领域

本发明大体上涉及培养细胞的系统和方法。更具体地，涉及具有多内部连通通道的多层微流体细胞培养装置的多种实施方案，并涉及使用该种装置为肾脏及其它细胞的可控培养的方法。

发明背景

肾脏疾病在美国是严重的健康问题。大约九名成年美国人中的一名受慢性肾脏疾病(CKD)的折磨，约450000病人患有晚期肾脏疾病(ESRD)。目前标准的护理治疗，诸如血液透析及血液滤过，为受损伤的器官提供帮助，但典型地不直接促进疾病组织再生或复原。另一方面，现代肾脏组织工程以及再生策略试图使用活肾脏特异性细胞和细胞生物材料结构取代或修复肾脏组织。培养肾脏特定细胞、祖细胞或干细胞大体上要求化学、生物、生理上的严格控制，以确保适宜的细胞增长和表型功能。

通常，肾脏关联细胞被培养于盘、碟和烧瓶中，并且细胞介质以及其它液体被人工递送到细胞内，并置于静态状态。更多近期的细胞培养方法使用具有多室、管状结构或空心纤维的生物反应器，来建立流体流，其促进暴露细胞于可控水平切应力或于多种化学环境下。然而，这些方法大体上不能，或仅仅在非常有限的程度内，允许同步暴露细胞于多用户制定的化学、生物和生物物理刺激下。进而，典型地，它们不能模拟肾脏细胞在活体中经历的条件和流体结构，诸如极端接近几个细胞表型以及微尺度血管状结构。因为细胞经历的条件影响其功能，所以这些方法可能不能向该细胞类型引入所需功能，或引入不需要的功能。进而，典型地，这些方法未考虑在生物反应器结构内不同位置的多细胞类型的培养。为改善用于医学应用的肾脏关联细胞培养，需要提供用于在可控培养条件下增长多细胞类型的系统和方法。

发明概述

本发明在多种实施方案中，提供用于在控制多种化学、生物、生物物理参数的环境中培养细胞的微流体多通道生物反应器装置，从而促进例如活体条件的更好的模拟。这种生物反应器全系统例如可以包括被可渗透或半渗透膜分开的两个聚合物层。每一层限定一种或多种微通道，其在操作中被填满诸如缓冲溶液、细胞培养基、血液或尿的液体。通过例如在通道入口及出口之间施加压力差，流体流被引入通道中。

在一层中的通道可以通过膜与另一层的一个或多个通道“连通”。连通，正如此处所使用的术语，代表通道之间任何类型的相互作用，无论本质上是化学的、物理的(例如热学的、机械的、或流体力学的)或是生物的。例如，连通可包括流体连通，即，流体或其成分在通道之间的传输，或机械相互作用，诸如在一个通道给予另一通道的压力。在相同层内的通道也可以彼此相连通，这可通过膜以及在另一层的与二者均几何重叠的通道完成。此处通道几何重叠是指通道向平行于膜(或在某些层与膜不平坦的情形中，局部平行于膜的)的平面的投影重叠，尽管通道不占有相同的物理空间。

在一层中的通道之间的连通程度相比于其它因素，主要取决于通道之间的距离和其交错部分的高度及宽度。因此，通过沿着通道长度(例如，沿着最长的尺寸或轴)改变所有这些参数或者参数的一个子集，连通的水平可以被控制为一个有关沿着通道位置的函数。反过来，通道之间连通的这种控制，通过流体注射和流速、进出口压力控制，协助控制沿通道的流体力学和化学参数。例如，如果不同组成的两种流体在入口处被注射入相邻的通道，由于通道之间的化学连通，即质量传递，两种流体可混合，并导致出口端的第三种混合组成。相似地，可在两个通道的端口(入口和/或出口)施加不同的压力，并且导致沿通道长度的流体力学参数曲线，该曲线由个别通道的几何以及它们之间机械连通水平决定(至少部分)。

如上所述的微流体装置可有助于细胞培养。通道中可接种一种或被置于通道内不同位置上的多种类型的细胞。通道的相对位置和形状、通道内的细胞位置以及操作参数诸如流体组成以及施加于端口的压力共同给出对所培养细胞的微环境以及对细胞的化学的、生物的、机械的和生物物理信号施放的控制的空前水平。以对这些参数的控制，生物反应器可被用于影响细胞功能并协助生物反应器结构内的不同位置多细胞类型培养。用户可同时或按照特定计划定时地实施任意参数组合，以按照所需的方式和/或为特殊目的改变细胞功能。可从而被定制的细胞功能包括但不仅限于增殖促进或抑制，干细胞多能性维持或细胞向特定表型的分化。细胞可以直接被设计。

本发明的实施方案为培养和发育用于多种应用的细胞群提供平台。例如，可以为特定治疗应用定制细胞培养，例如，新再生疗法或先前基于细胞疗法的改进。在一些实施方案中，生物反应器被设计用于模拟自然器官，并且被用于研究细胞发育及器官功能。生物反应器装置也可以是生物工程人造器官，或部分的先体。大体上，不同应用可以利用本发明的不同方面和特征。

一方面，本发明提供微流体生物反应器装置，其包括至少一个限定至少三个其中的微通道的聚合物层。膜将第一和第二通道，与第三通道(以及，可选地，第四通道)，在几何重叠部分分开，同时准许在微通道的重叠部分之间的连通(例如，流体连通或机械连通)。第一和第二通道可通过第三通道互相连通。在特定实施方案中，装置包括由膜分开的两个聚合物层，一层限定第一和第二通道，而另一层限定第三通道。至少一个微通道的至少一个几何参数在重叠部分中沿通道长度变化。沿微通道长度变化的几何参数包括第一和第二通道之间的距离，和/或任意通道的宽度和/或深度。

在某些实施方案中，聚合物层包括或本质上由生物聚合物组成。膜，或其成分可以是半透性的，并且可以由多孔或半透性基体材料构成。在特定的实施方案中，膜包括或本质上由绒头织物、微模制的聚二甲基硅氧烷(PDMS)或其他硅氧烷聚合物、聚醚砜、电纺材料或径迹蚀刻膜组成。

如此处所用，无论在使用中或非，术语“生物反应器装置”指示上述微流体结构。在为细胞培养配置的实施方案中，生物反应器装置进一步包括至少在一些微通道中的细胞。例如，细胞可以是肾脏细胞，并且微通道可以进一步配置以一同模拟肾脏组织。细胞可以附着在膜或通道壁，和/或可悬浮于在通道中所含的流体中。细胞可以包含多种类型，在某些实施方案中，其沿通道长度变化。

装置在微通道中可进一步包括流体，诸如细胞培养基、缓冲溶液、血液成分、全血、尿、透析液、水或滤液。在特定实施方案中，流体是或包括仿制体液的溶液。在通道内的流体可能具有与之相关的流体力学参数(例如，压力、流速、剪切率、粘度等)。流体力学参数值在任意两个微通道之间可本质地不同(例如，通过某一因素高于1.1、高于1.5、高于2或高于10)。例如，它们可在第一或第二通道(可在第一层形成)与第三通道(可在第二层形成)之间不同，和/或在第一与第二通道之间和/或第三与第四通道之间不同。另外，流体内成分的浓度或浓度梯度可在膜同侧或异侧上的任意两通道之间不同。微通道的几何参数可以沿通道长度逐渐变化。在某些实施方案中，一个或多个参数是基于在第一聚合物层中的，至少一个微通道的预先确定的流体力学曲线变化。流体力学曲线可以是例如聚合或分散传输曲线，或切应力曲线。在某些实施方案中，几何参数的变化促进沿微通道长度的至少一个化学或机械刺激的变异。

另一方面，本发明的多种实施方案涉及通过提供如上所述生物反应器，引入细胞到至少一个微通道并培养细胞的培养细胞的方法。方法还包括引入流体到至少一个微通道。在某些实施方案中，该方法还涉及暴露细胞至机械的、化学的、和/或生物学刺激，可选地测量细胞对刺激的反应(例如，细胞功能的变化)。细胞可以被种植于微通道中选定位置，并且在不同位置的细胞可被暴露于不同的刺激。此外，可以向微通道引入不同细胞类型。在某些实施方案中，不同类型细胞被引入不同微通道，并且在某些实施方案中，不同类型细胞被种植于同一微通道的不同位置。

另一方面，本发明提供模拟肾脏的方法。该方法包括提供具有上述特征的生物反应器，其中参数依照模拟肾脏结构的方式变换。该方法进一步涉及引入肾脏细胞到至少一个微通道并且培养该细胞。在例如体外肾脏治疗中，接下来可使用生物反应器。在某些实施方案中，可将生物反应器植入患者。

通过以下描述、附图和权利要求，此处披露的本发明的实施方案的这些和其它对象，以及优势和特征将逐渐明了。更进一步，应当理解此处描述的多种实施方案的特征并不互相排斥并且可存在于多种组合和排列中。

附图简述

在图示中，在所有不同附图下相同引用字符大体上指示相同部分。另外，附图并不一定成比例，通常重点被置于图示本发明的主要原理。在以下描述中，将参照以下附图描述本发明的多种实施方案，其中：

图1A-1C是依照本发明的一个实施方案的微流体装置的图解透视图；

图2是在图1A-1C中示出的装置的横截面的扫描电子显微镜图片(SEM)；

图3A-3C是依照本发明的多种实施方案的通道的顶视图，其间距、宽度以及深度分别沿通道长度变化；以及

图4A-4D是依照本发明的一个实施方案的装置的侧视图，其具有在一层连通于在另一层的三个通道的通道，该图示出连通水平分别在通道距离、宽度和深度上变化的效果。

发明详述

在各种实施方案中，本发明涉及特征为两个包含通道的、被膜分开的层，经由所述膜，一层中的微通道可与另一层的微通道连通。包含通道的层典型地由聚合物构成，但是本发明不仅限于这一方式。在某些实施方案中，层可由以下组成或包含陶瓷、金属、玻璃或其他非聚合物材料。适当的不可降解聚合物材料包括聚苯乙烯、PDMS、聚碳酸酯和聚氨酯。关于某些应用，生物可降解或生物可相容材料，诸如聚甘油癸二酸酸、聚酯酰胺、聚辛二醇柠檬酸酯，聚二醇柠檬酸酯、丝纤蛋白或聚己酸内酯的使用是有利的。此外，在某些实施方案中，可使用生物聚合物，诸如蛋白质或凝胶。

包含通道的层可具有从小于100微米到几毫米的厚度。另一方面，膜仅有约1微米到约100微米厚。为允许通过膜的质量传递，膜或至少其部分是可渗透的或可半渗透的(也就是说，依照分子和膜的物理或化学特性，选择性可渗透一些但不是其它离子和分子)。可渗透性可以通过使用半多孔或多孔材料(诸如聚醚砜)获得，其中通过孔发生质量传递，或可渗透性基体材料(bulk-permeable-material)(诸如PDMS或绒头织物状材料)获得。在某些实施方案中，膜是通过将聚合物旋转电镀到一个包含通道的层上创建的，该过程将产出柔性的、多孔聚合物网。

简单示例性微流体装置在图1A-1C中示出。图1A是装置100的组装图，图1B是装置100的部件分解图，其单独示出两个聚合物层102、104和膜106。在该示例中，底层104限定沿层104延伸的单通道108，并且在两端通过端口110可进出。顶层102包括五个通道112，每一个具有比底层104中的通道108更小的直径。这些通道112被邻近放置，并且沿通道长度的较大部分与更宽的通道108侧向重叠，但在通道112的末端分叉，以增加通过它们各自的端口114进出它们的便利。

图1C连同放大的视图(在插图中)提供已组装装置100的横截面的透视图，其示出膜106和稍分离放置的聚合物层102、104。如从插图中可见的，在聚合物层102、104的每一个中限定的通道108、112，每个都具有面对膜106的开放侧面。因此，在上层102中的通道112和在底层104中的宽通道108可以通过膜106相互作用。如图1C所示，在许多实施方案中，通道108、112具有矩形的横截面。然而通常，通道界面可以是任意多边形或圆形状。例如，通道横截面可以是半圆的，具有由膜106构成的直边界。

具有在图1A-1C中示出的基本结构的装置100的横截面的SEM图片在图2中示出。多孔层106具有约6μm的厚度。五个在顶层102中的微通道112每一个约50μm宽，约50μm深。通常，典型实施方案具有从几个微米到几百个微米的通道深度，并且宽度从几个微米到几个毫米。

在一个实施方案中，例如在图1A-1C和2中示出的那个一样，在装置100的运行过程中，可包括细胞的流体被通过端口110、114传送到微通道108、112。因为每一通道都具有不同的入口端和出口端，可以为每一通道单独控制流体类型和流动状态。从而，在一个通道的流体力学参数可不同于另一通道的流体力学参数，无论另一通道是否在相同或不同层。流体力学参数包括，例如，压力、流速、剪切率、切应力、层流性和粘性。其他可在通道108与112之间不同的参数包括温度、导热系数、导电性、密度和流体的化学组成。更进一步，可使用在多通道108、112的平行流、对流、流过多孔层106的流的任意组合和静态状态。可为具体应用选择参数。例如，为模拟亨勒袢，即肾脏中水和盐被从废物流中重吸收并且形成浓缩尿的部分，将建立在两个一端流体相连的邻近通道之间的对流。为模拟肾小球，其中发生血液过滤，血液可以在一个通道中流过，而透析液可以在相邻通道流过。像例如使用此处描述的装置进行血液过滤的过程的模拟，利用通道108、112的能力来通过质量交换、压力平衡或其它相互连通。

在膜106两侧的通道之间，以及经由膜106的另一侧的通道的在相同层上的通道之间的连通程度，取决于多种几何参数，包括通道的接近度以及它们横截面的尺寸，以及膜106的特性(例如材料、厚度、孔大小等)。更进一步，连通可能被多种流体成分的浓度和浓度梯度影响。

尽管在图1A-1C和图2中示出的通道108、112的几何形状不随通道108、112的长度变化，这并非一定如此。相反，微流体生物反应器的多种实施方案可以(根据沿通道长度位置)使用这些参数的一个或多个变种来控制通道之间的连通，并从而控制在通道之内的状态。图3A-3C图示，在俯瞰视角的，具有五个微通道301的装置层300，其几何属性在点302沿通道301按阶梯状方式改变。在图3A中，两个最靠外侧的通道301到里面通道301的距离突变。在图3B中，两个最靠外侧的通道301变得更宽并且相邻两个内侧通道301变得更窄，而中心通道301不改变其横截面。最终，在图3C中，通道301的深度在点302处改变。

该几何形状可在不止一处位置变化。更进一步，它可以逐步改变。例如，两个直通道之间的距离可以沿通道长度线性增加。因此，在这种情形下，通道不再平行，相关几何参数的变化(在该例子中，距离)可以依照长度或任何一个通道的轴、通道之间的对称轴或通常任意两个通道都将具有投影成分(也就是说，不是垂直于任意通道的)的几何轴来限定。短语“沿通道的长度”的意思是环绕所有这些可能的坐标轴。为确保分叉的通道之间通过在膜的另一侧上的层中的另一通道的、最短可能路径的连通，其他通道将典型地相应改变宽度(例如，如果在其它层内部连通通道线性分叉，将在层中有梯形投影)。可选地，提供连通方式的更宽的通道可具有等于至少在装置相关部分中较窄通道之间最大距离的宽度。(注意到在图1A-1C中五个微通道112在邻近端口114的分歧，不同于如上所述的几何参数的变化，在其中越过其中五个通道112平行的区域，它们不与在底层104的更宽的通道108重叠。)

在图4A-4D中示出了通道几何形状在通道之间的相互作用中的影响，尤其是在跨膜的、经过另一层的侧向重叠的通道连通的相同层的通道之间的相互作用中的影响。初始配置400包括三个大约等距的、具有大约相同的横截面的窄通道402以及与在底层的两个外侧通道402齐平的上层的更宽的通道404，在图4A中示出。由于微流体装置的特征，特别是在通道中的层流优势，所以在通道内的流体流间的溶液混合绝大多数通过扩散来控制。因为扩散取决于路径长度，改变通道几何形状以改变在通道之间以及通道之内扩散的路径长度，提供控制可溶解成分沿通道长度递送到多个区域的方式。另外，扩散取决于横截面面积，所以改变通道宽度或长度可以影响穿过膜的扩散的总量。

在图4A-4D的横截面中，经过膜405的扩散总量是通过垂直箭头宽度来表示的，并且穿过在上层的通道404的宽度的扩散路径长度是由水平箭头指示的。降低在底层通道之间的距离减少了到顶通道的扩散路径长度，导致底层两通道扩散的增加。因此，在图4B示出的配置410中，两个邻近放置的通道412、414之间的扩散传输大于两个更远放置的通道414、416之间的扩散传输。在图4C示出的配置420中，由于与膜405增大的接触面积，为在底层的更宽通道422增大了穿过膜405的扩散。因此，在更宽的通道422与较窄的通道424、426之间的扩散相似地增大。在图4D中示出的配置430中，中心通道432的变更的通道深度影响通道432内的扩散路径长度，其通过对给定扩散量增大总通道容量来改变连通程度。

在其中几何参数沿通道长度变化的实施方案中，流体成分(血液成分、营养、或药物制剂)的基于扩散的递送可以通过通道几何形状为通道的不同区域作调整。这对于肾脏细胞的培养尤其有用，因为细胞沿例如肾小管经受依赖于其在小管通路内位置的变化的化学物质影响。因此，通道的几何形状的改变提供在微流体装置内培育肾脏细胞，以使它们经受相同于那些在活体中经受的环境的独特方法。

根据本发明实施方案的微流体装置可以使用多种本领域熟知的技术生产，包括复制造型、传统加工、喷射造型或固体自由形态制造。为了通过复制造型方法产出个体聚合物层，关于每一层制造具有所需结构的反向浮雕特征的主模具。制造主模具的广泛使用的方法包括软平板印刷、湿蚀刻、等离子蚀刻及电镀。

通过例如软平板印刷生产主模具涉及限定主模具对应于最后一层的缺口的褶皱的光掩模为透明区域，而其它为不透明片。掩模的版面设计可以在电脑绘图中被设计并随后被例如诸如Tanner L-Edit的软件包转换成计算机辅助设计(Computer-Aided Design)(CAD)版面设计图，其适合于随后由电子束平印术或相似技术在掩模上的物理书写。

作为另一准备步骤，基质晶片，例如硅制的，可被使用合适的诸如SU-8的光刻胶的粘性溶液旋转涂敷。典型地，晶片被快速地涂覆，以每分钟1200到4800转，以从几十秒到分钟范围的时间长度，以产生同一厚度的光刻胶层，其厚度为几十或甚至几百微米。随后，光掩模可被置于晶片上，而在掩模透明区域的光刻胶可以通过UV光线暴露被化学方式稳定。在非曝光区域的光刻胶可随后被通过暴露于化学显影剂中而除去，而剩余的光刻胶可以在高温下变硬以形成耐用反向浮雕。在蚀刻步骤中，可以使用化学制剂去除未被光刻胶保护的区域的基质最上层，在晶片中产生反向浮雕的通道样式，其现在构成主模具。不再需要的光刻胶可以随后被从基质中除去。接着，液体聚合物可被浇铸于主模具中，固化并剥去，产生装置的包含通道的层的复制模具(例如，层102或104)。

从一层的通道分离另一层的通道的膜可以通过涂覆适宜的材料到晶片上、固化，如果适用，并剥去来制造。另一种制造方法涉及用带有所需多孔性、厚度和其他所需属性的膜静电纺丝。可选地，可使用市场上可买到的膜(例如，购自Sterlitech，Kent，Washington的痕迹蚀刻聚碳酸酯膜)或在原地制造的膜。聚合物层和膜可以随后被组装、对齐、等离子粘合或其它暂时或永久地彼此附着。

上述技术提供更广泛的用途以产生所需宽度、深度、流程及配置的通道。例如，通道可被设计为沿曲线路径行进，分叉为多个通道，或形成复杂网络。因此，装置可以被调整以模拟生物器官和组织，诸如微脉管系统或肾单位部分的重要特征。在某些实施方案中，通道是被基于所需流体力学曲线设计的，这些曲线诸如由依照在通道内的位置的对流性或扩散性传输特性或其它流体力学参数而限定。可选地或可附加地，通道设计可以基于在将被注射入装置的流体中特定成分的所需浓度曲线来设计。计算模块可以被使用作从所给流体力学或浓度曲线计算可产生这种曲线的通道的几何形状和配置。可选曲线以模拟特别的生物器官，或以之优化生物相关参数。例如，通过使通道适宜地浅，可以使清理通道小分子的程序被优化。可选择地，通道或隔室内的机械的、化学的或生物的微环境可以被优化以引入适于增加细胞生存力的条件。

可以在依照本发明的微流体生物反应器装置中施加多种修改和更多的特征。在某些实施方案中，层都包括多通道。例如，一层可以包括两个较宽的通道，其中任意一个都侧向地重合并且在另一层上的四个较窄通道中的两个之间建立连通。在另一个示例型配置中，每一层可包含侧向重叠于另一层的多通道的通道。在特定实施方案中，在一层内的通道不仅通过膜另一侧的通道连通，还直接通过有孔侧壁或多孔或在那一层分离通道的渗透性材料连通。进一步，装置可包括多于两个层，其被流体地连接多层端口的头元件所整合。所以，可产生三维网络。通道本身可以具有特征如光滑的壁、光滑的分支点、扩大的壁和/或近乎完美的圆或半圆横截面。

在某些实施方案中，另一方面，可以从单聚合物层或块中产出结构和功能类似于上述那些的生物反应器。通道可以多种高度被引进于块中，例如以使两个通道的中心轴位于一个平面中，并且第三通道的中心轴位于另一个平行的平面。在特定部分，在两个平面中的通道之间的材料可以被部分蚀刻除去或移走，以使膜状结构在通道之间形成。可选地，具有等于两个所需通道深度的垂直尺寸的一个或多个通道可形成于块中，并且可插入膜以分离通道成为垂直堆叠式的通道。

为了准备细胞培养的装置，通道壁的化学特性可能会被适宜的溶液冲洗以做可选择的改变，所述溶液诸如牛血清白蛋白(BSA)或者一种表面功能化溶液。取决于其应用，通常发现于细胞外基质(ECM)的蛋白质，例如胶原蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白或弹性蛋白，通过表面功能化的方法可附着到通道壁。

微装置之后可能会通过调节管口以拟合进口和出口，注入含有细胞的流体，和/或连接装置到其他的仪器而被纳入一个实验性的设置中。细胞可以漂流在包含于通道或者流经通道的流体中。另外或附加地，细胞可粘着在通道壁和/或膜上。在那些拥有足够孔径的膜中，细胞可以独自占据孔，从而形成多孔细胞培养层。因此，细胞可能会被暴露在来自于膜两侧的流体刺激。

在多种实施方案中，多种类型的细胞在生物反应器中被培养。不同类型的细胞可在同一位置被共同培养，注入不同的通道，或者植入同一通道的不同的位置。通常，细胞与壁和膜的粘着力取决于表面化学，具体来说就是取决于一些特定的，发现其对于某些类型的细胞但并不是所有细胞是特异的结合位点。因而，靶定具有不同类型细胞的通道中的不同位置可以通过沿着通道长度改变表面化学性质，例如，通过微修饰表面粘着分子，或者在通道壁创建一个纳米地形结构来实现。其他的影响特定类型细胞在那里被培养的因素包括细胞类型被引入通道的顺序和在植入细胞时装置的方位(可通过利用重力来在某些特定位置放入细胞)。

细胞的培养可被暴露在多用户定制的化学、物理、生物和/或生物物理的刺激下。例如，通道的构造配置可同时允许法向压力和切应力的刺激。剪切力可通过控制沿通道的流速来调节，而通道内部的压力可通过外部提供的压力设定。可以控制多孔层两侧任一侧的多通道压力。由于可能会被在膜的任一侧使用多通道，因此，跨膜压力(在某些实施方案中为跨多孔细胞层)的压力可以被在多个位置独立控制。跨细胞层的压力控制在模拟活体内细胞，例如肾脏中发现的多种细胞执行传输功能条件中具有极其重要的作用。

可控的生物参数包括包围特定细胞培养的细胞的类型和密度。在多孔层中的细胞可与在一侧与一组细胞种类交互作用，而在另一侧与另外一组细胞种类交互作用。在一些实施方案中，微规模的通道宽度限制着某一区域的细胞数量，因此限制了细胞与细胞的交互作用。更进一步，微规模的通道深度可影响处在多孔层上的细胞与处在与该层相对的通道壁的细胞的连通水平。统而言之，这些效果为用户通过通道局部几何特性控制细胞与细胞交互作用提供了一种方法。更进一步，如前所述，沿通道长度改变通道的接近度，宽度，深度有利于控制沿通道长度的化学环境，这通常被用来近似于在活体中，例如，沿肾小管长度细胞所经历的化学环境变化。由于沿肾小管细胞类型和功能的改变，提供改变了的化学环境可支持在生物反应器中培育时这些细胞的功能。

细胞不仅能交互作用，而且能与通道中的流体交互作用。例如，细胞增殖能够回应特殊药剂，流体中营养物质的改变，缓冲溶液的pH值的改变等等，而做出相应改变。细胞还可以吸收或分泌特定的化合物，从而改变流体组成。在一种实施方案中，全血可流经膜一侧的通道，而渗析液流经膜另一侧的通道，模拟在肾脏中的对流并引导细胞沿着通道过滤血液。

可以用多种方式观测和/或测量不同刺激对细胞的效果。光学显微镜可以用来探测细胞尺寸或形状的任何改变。流体在出口处被分流并分析特定的组成成分以确定特定化合物的吸收或分泌，以此获取细胞代谢和/或蛋白质表达的信息。流体、粒子和分子种类通过膜的速率测量，跨膜压力的测量，或跨膜电阻的测量可被用于评价细胞阻绝膜孔的好坏。

本领域技术人员将欣赏，此处描述的微流体生物反应器提供了一个多重研究和医学应用的平台，尤其是，当这种反应器被联系到肾相关细胞或干细胞培养时。通过调控多种参数将有助于在某一特定环境下培养细胞以引出所需的细胞功能。例如，可以为了特定治疗应用而培养干细胞，同时保持着向特定表型的潜能或分化。

生物反应器装置还改进了在体外，在非常接近于体内的条件下研究细胞功能的能力。由于能够很好地控制生物反应器中的环境参数，因此，观察细胞针对于给定条件组的已知输入成为可能。在特定实施方案下，充满着肾细胞的生物反应器，模拟了肾脏组成部分的重要功能。因此，肾治疗药品能够在良好控制下的平台研发。药物有效性与毒性能够，通过评价生物反应器中的肾脏相关细胞的生存能力以及接受药品作用后细胞的健康状态，在体外安全地检测。对于多参数的高水平控制，相比于传统药物检测方法，能够减少试验的不确定性，提高精确度。

生物反应器装置的特定实施方案可以被用在终末期肾脏疾病的治疗中。生物反应器和贴壁细胞可配置从而使装置发挥肾脏的某些功能，从而成为在体外在肾脏替代疗法中，辅助肾脏的装置。装置还能被用作组织工程的支架。具体的，通过提供一个可控的模仿肾脏的结构，并允许附着细胞的结构，该生物反应器能够被用作产生肾脏特定组织结构的支架。这个组织结构可以被植入到病人的体内以取代病变的肾脏组织。

通过描述本发明的一些特定实施方案，本领域技术人员将很明显地意识到，与本发明的核心理念与应用范围不背离，可使用纳入此处揭示的概念的其他实施方案。因此，本文描述的特定实施方案，在各方面上，仅作为说明而不具有限制性。

Claims (41)

1.微流体生物反应器装置，包括：

至少一个聚合物层，在其中限定第一微通道、第二微通道和第三微通道；和

在其间的几何重叠部分处将第一微通道和第二微通道与第三微通道分离的膜，第三微通道重叠第一和第二微通道，并且该膜允许所述微通道的重叠部分之间的连通，

其中在几何重叠部分内第一和第二微通道之间的距离沿着微通道的长度变化而第一和第二微通道的深度沿其长度保持不变。

2.权利要求1的装置，其中第一微通道与第二微通道通过第三微通道相连通。

3.权利要求1的装置，其中至少一个聚合物层包括由该膜分离的两个聚合物层。

4.权利要求1的装置，其中至少一个聚合物层包括生物聚合物或基本上由生物聚合物组成。

5.权利要求1的装置，其中微通道之间的连通包括流体连通或机械连通中至少一种。

6.权利要求1的装置，其中第一和第二微通道之一的宽度沿其长度变化。

7.权利要求1的装置，其中至少所述膜的至少部分是半渗透性的。

8.权利要求7的装置，其中所述膜的半渗透部分是下列至少一种：多孔的或基体半渗透性的。

9.权利要求1的装置，其中所述膜包括下列中的至少一种：绒头织物,电纺材料,微模制的聚二甲基硅氧烷,聚醚砜,或径迹蚀刻膜。

10.权利要求1的装置，进一步包括在至少一个微通道中的细胞。

11.权利要求10的装置，其中所述细胞包括肾脏细胞。

12.权利要求11的装置，其中配置微通道以便共同模拟肾脏组织。

13.权利要求10的装置，其中至少一些细胞附着于所述膜。

14.权利要求10的装置，其中至少一些细胞附着于微通道的壁。

15.权利要求10的装置，其中至少一些细胞悬浮于微通道中所含的流体内。

16.权利要求10的装置，其中所述细胞包括多种细胞类型。

17.权利要求16的装置，其中细胞类型沿着微通道长度变化。

18.权利要求1的装置，进一步包括在微通道中的流体。

19.权利要求18的装置，其中流体包括下列中的至少一种：细胞培养基、缓冲溶液、血液成分、全血、尿、透析液、水或滤液。

20.权利要求18的装置，其中流体包括模拟体液的溶液。

21.权利要求18的装置，其中在第一微通道和第二微通道中至少一个内的流体力学参数值本质上不同于在第三微通道中的流体力学参数值。

22.权利要求21的装置，其中所述流体力学参数是压力、流速、剪切率或粘性中的一个。

23.权利要求18的装置，其中在第一微通道中的流体力学参数值本质上不同于在第二微通道中的流体力学参数值。

24.权利要求18的装置，进一步包括在所述膜的与第三微通道同侧上的第四微通道，该第四微通道中的流体力学参数值本质上不同于第三微通道中的流体力学参数值。

25.权利要求18的装置，其中在第一微通道和第二微通道中的至少一个的流体中的成分的浓度本质上不同于在第三微通道中的流体中的该成分浓度。

26.权利要求18的装置，其中在第一微通道和第二微通道中的至少一个的流体中的成分的浓度梯度本质上不同于在第三微通道中的流体中的该成分的浓度梯度。

27.权利要求1的装置，其中所述第一和第二微通道之间的距离沿微通道长度逐渐变化。

28.权利要求1的装置，其中所述第一和第二微通道之间的距离基于在第一微通道和第二微通道的至少一个中预先确定的流体力学曲线变化。

29.权利要求28的装置，其中流体力学曲线包括对流传输曲线、扩散传输曲线或切应力曲线中的至少一个。

30.权利要求1的装置，其中沿着一个微通道的长度的第一和第二微通道之间的距离的变化协助沿着那个微通道的化学刺激或机械刺激中的至少之一的变化。

31.培养细胞的方法，该方法包括：

(a)提供生物反应器，该生物反应器包括(i)至少一个聚合物层，其中限定第一微通道、第二微通道和第三微通道，和(ii)在其间的几何重叠部分处将第一微通道和第二微通道与第三微通道分离的膜，第三微通道重叠第一和第二微通道，并且该膜允许所述微通道的重叠部分之间的连通，其中第一和第二微通道之间的距离在重叠部分内沿其长度变化而第一和第二微通道的深度沿着其长度保持不变；

(b)向至少一个微通道中引入细胞；和

(c)培养细胞。

32.权利要求31的方法，进一步包括将流体引入到至少一个微通道内。

33.权利要求31的方法，其中步骤(c)包括将所述细胞暴露到机械刺激、化学刺激或生物刺激中的至少一种。

34.权利要求33的方法，进一步包括测量细胞对刺激的响应。

35.权利要求34的方法，其中所述响应包括细胞功能的变化。

36.权利要求31的方法，其中步骤(b)包括将细胞种植在至少一个微通道内的选定位置。

37.权利要求36的方法，其中步骤(c)包括将种植于第一选定位置的细胞暴露于第一刺激并且将种植于第二选定位置的细胞暴露于第二刺激。

38.权利要求31的方法，其中步骤(b)包括将不同类型细胞引入到所述至少一个微通道内。

39.权利要求38的方法，其中步骤(b)包括将不同类型细胞引入到不同微通道内。

40.权利要求38的方法，其中步骤(b)包括将不同类型细胞种植到至少一个微通道内的不同选定位置。

41.权利要求31的方法，其中所述细胞是肾细胞。