ES2323662T3

ES2323662T3 - Protesis de injerto vascular producidas por bioingenieria.

Info

Publication number: ES2323662T3
Application number: ES99928418T
Authority: ES
Inventors: Ginger A. Abraham; Susan J. Sullivan; James Murray
Original assignee: Organogenesis Inc
Current assignee: Organogenesis Inc
Priority date: 1998-06-05
Filing date: 1999-06-04
Publication date: 2009-07-22
Anticipated expiration: 2019-06-04
Also published as: EP1083828B1; CA2334435C; EP1083828A4; JP4341050B2; AU4548799A; JP2002516702A; EP1083828A2; ATE424147T1; CA2334435A1; WO1999062425A2; US6986735B2; US20030167088A1; AU753773B2; MXPA00012061A; DE69940507D1; WO1999062425A3; US20060100717A1

Abstract

Una prótesis tubular biorremodelable que comprende una primera capa de matriz tisular procesada formada dentro de un tubo que tiene una superficie luminal y una superficie abluminal, en donde la matriz tisular procesada está sustancialmente libre de componentes de matriz extracelular no-colagenosa y comprende telopéptido de colágeno, y una segunda capa de colágeno fibrilar denso en la superficie luminal de la primera capa.

Description

Prótesis de injerto vascular producidas por bioingeniería.

1. Campo de la invención

Esta invención se encuentra en el campo de la ingeniería de tejidos. La invención está dirigida a prótesis de injerto producidas por bioingeniería preparadas a partir de material tisular limpio obtenido a partir de fuentes animales. Las prótesis de injerto producidas por bioingeniería de la invención se preparan utilizando métodos que conservan la compatibilidad celular, firmeza y capacidad de biorremodelación de la matriz tisular procesada. Las prótesis de injerto producidas por bioingeniería se utilizan para implante, reparación o para utilizarse en un anfitrión mamífero.

2. Descripción breve de los antecedentes de la invención

El campo de la ingeniería de tejidos combina los métodos de ingeniería con los principios de la ciencia de la vida para entender las relaciones estructurales y funcionales en los tejidos de mamíferos normales y patológicos. El objetivo de la ingeniería de tejidos es el desarrollo y aplicación final de sustitutos biológicos para restaurar, mantener y mejorar las funciones tisulares.

El colágeno es la proteína estructural principal en el cuerpo y constituye aproximadamente un tercio de la proteína corporal total. Comprende la mayoría de la materia orgánica de la piel, tendones, huesos y dientes y aparece como inclusiones fibrosas en la mayoría de las demás estructuras corporales. Algunas de las propiedades del colágeno son su alta resistencia a la tensión; su capacidad de intercambio iónico; su baja antigenicidad, debida en parte al enmascaramiento de determinantes antigénicos potenciales por la estructura helicoidal; y su baja extensibilidad, semipermeabilidad y solubilidad. Además, el colágeno es una sustancia natural para la adhesión celular. Estas propiedades y otras hacen que el colágeno sea un material adecuado para la ingeniería de tejidos y la fabricación de sustitutos biológicos que se pueden implantar y prótesis biorremodelables.

Los métodos para obtener tejido y estructuras tisulares colagenosas a partir de tejidos de mamíferos extirpados y los procesos para construir prótesis a partir de tejido, se han investigado ampliamente para la reparación quirúrgica o para el reemplazo de tejidos u órganos. Todavía es un objetivo irresoluto de los investigadores el desarrollo de prótesis que puedan utilizarse con éxito para reemplazar o reparar tejidos de mamíferos.

Compendio de la invención

Los materiales colagenosos biológicos tales como la submucosa intestinal han sido propuestos por muchos investigadores para utilizarse en la reparación o reemplazo de tejidos. Se describen métodos para el procesamiento mecánico y químico del yeyuno proximal porcino para generar una capa única acelular de colágeno intestinal (ICL) que puede utilizarse para formar laminados para aplicaciones bioprostéticas. El procesamiento elimina las células y los restos celulares a la vez que mantiene la estructura nativa del colágeno. La lámina resultante de matriz tisular procesada se utiliza para fabricar construcciones laminadas con múltiples capas con unas especificaciones deseadas. Hemos investigado la eficacia de parches laminados para la reparación de tejidos blandos así como la utilización de ICL entubada como un injerto vascular. Este material proporciona el soporte físico necesario mientras que genera mínimas adherencias y es capaz de integrarse en el tejido nativo circundante y resultar infiltrado con células anfitrionas. La remodelación in vivo no afecta a la integridad mecánica. Las propiedades intrínsecas y funcionales del implante, tales como el módulo de elasticidad, retención de sutura y UTS son parámetros importantes que pueden manipularse para requerimientos específicos variando el número de capas de ICL y las condiciones de entrecruzamiento.

Descripción de las figuras

La figura 1 es un diagrama del aparato utilizado para la deposición de colágeno fibrilar denso en la superficie lumenal del tubo ICL.

Descripción detallada de la invención

Esta invención está dirigida a una prótesis producida por ingeniería de tejidos, que, cuando se implanta en un anfitrión mamífero, puede servir como una parte corporal o estructura tisular de reparación, aumento o reemplazo funcional y que sufrirá una biodegradación controlada que se produce de manera concomitante con la remodelación por las células del anfitrión. La prótesis de esta invención, cuando se utiliza como un tejido de reemplazo, tiene así propiedades dobles: en primer lugar, funciona como una parte corporal sustituyente y, en segundo lugar, aún funcionando como una parte corporal sustituyente, funciona como un molde de remodelación para el crecimiento de las células anfitrionas hacia el interior del tejido receptor. Con el fin de hacer esto, el material prostético de esta invención es una matriz tisular procesada desarrollada a partir de tejido colagenoso obtenido de mamíferos que es capaz de unirse a sí misma o a otra matriz tisular procesada para formar una prótesis para ser injertada en un
paciente.

La invención está dirigida hacia métodos para hacer prótesis producidas por ingeniería de tejidos a partir de material tisular limpio en los que los métodos no requieren adhesivos, suturas o grapas para unir las capas entre sí a la vez que se mantiene la capacidad de biorremodelación de la prótesis. Los términos "matriz tisular procesada" y "material tisular procesado", quiere decir nativo, normalmente tejido celular que ha sido obtenido de una fuente animal, preferiblemente de un mamífero, y mecánicamente limpiado de tejidos circundantes y químicamente limpiado de células, de restos de células, y convertido sustancialmente en libre de componentes de matriz extracelular no-colagenosa. La matriz tisular procesada, mientras que esté sustancialmente libre de componentes no-colagenosos, mantiene mucha de su resistencia, forma y estructura matriz nativa. Las composiciones preferidas para preparar los injertos producidos por bioingeniería de la invención son los tejidos animales que contienen colágeno, incluyendo, pero no limitándose a: intestino, fascia-lata, pericardio, dura-mater, y otros tejidos planos o de estructura plana que contiene una matriz tisular colagenosa. La estructura plana de esas matrices de tejidos las hace capaces de ser fácilmente limpiadas, manipuladas y reunidas para preparar los injertos producidos por bioingeniería de la invención. Otras fuentes apropiadas de tejidos colagenosos con la misma estructura laminar plana y composición de matriz pueden ser identificadas en otras fuentes animales por los expertos en la técnica.

Una composición preferida más para preparar los injertos producidos por bioingeniería de la invención es una capa de colágeno intestinal obtenida de la túnica submucosa del intestino delgado. Las fuentes adecuadas del intestino delgado son organismos mamíferos tales como ser humano, vaca, cerdo, oveja, perro, cabra o caballo aunque la fuente preferida es el intestino delgado de cerdo.

La composición más preferida para preparar la prótesis de la invención es una capa de colágeno intestinal procesada obtenida de la túnica submucosa del intestino delgado de cerdo. Para obtener la capa de colágeno intestinal procesada, se recoge el intestino delgado de un cerdo y los tejidos mesentéricos relacionados se diseccionan groseramente del intestino. La túnica submucosa se separa, o deslamina, preferiblemente de las otras capas del intestino delgado estrujando mecánicamente el material intestinal bruto entre rodillos opuestos para eliminar las capas musculares (túnica muscularis) y la mucosa (túnica mucosa). La túnica submucosa del intestino delgado es más dura y rígida que el tejido circundante y los rodillos estrujan los componentes más blandos y los separan de la submucosa. En los ejemplos siguientes, la túnica submucosa se recogió mecánicamente a partir del intestino delgado porcino utilizando una máquina limpiadora de intestino Bitterling y posteriormente se limpió químicamente para rendir una matriz tisular limpia. Esta capa de colágeno intestinal limpiada mecánicamente y químicamente se refiere en la presente memoria como "ICL".

De manera importante, la capacidad de biorremodelación de la matriz tisular se conserva en parte por el proceso de limpieza ya que no contiene restos de detergente unidos que afectarían adversamente la capacidad de biorremodelación del colágeno. Además, las moléculas de colágeno han retenido sus regiones de telopéptido ya que el tejido no se ha sometido a tratamiento con enzimas durante el proceso de limpieza.

Las capas de colágeno del dispositivo prostético puede ser del mismo material colágeno, tal como dos o más capas de ICL, o de diferentes materiales colágenos, tal como uno o más capas de ICL y una o más capas de fascia-lata.

Las matrices tisulares procesadas pueden tratarse o modificarse, bien físicamente o químicamente, antes de la fabricación de una prótesis de injerto producida por bioingeniería. Pueden realizarse modificaciones físicas tales como moldeado, acondicionamiento por extensión y relajación, o perforando las matrices tisulares limpias así como modificaciones químicas tales como la unión de factores de crecimiento, componentes de la matriz extracelular seleccionados, material genético, y otros agentes que afectarían la biorremodelación y reparación de la parte corporal que se está tratando, reparando o reemplazando.

Ya que el ICL es el material de partida más preferido para la fabricación de prótesis de injertos producidas por bioingeniería de la invención, los métodos descritos en adelante son los métodos preferidos para fabricar prótesis de injertos producidas por bioingeniería que contienen ICL y colágeno fibrilar denso.

En la realización más preferida, la túnica submucosa del intestino delgado porcino se utiliza como un material de partida para la prótesis de injerto producida por bioingeniería de la invención. El intestino delgado del cerdo se recoge, se eliminan sus tejidos circundantes y se limpia mecánicamente utilizando una máquina limpiadora de intestinos que elimina enérgicamente las capas de grasa, músculo y mucosa de la túnica submucosa utilizando una combinación de acción mecánica y lavado utilizando agua. La acción mecánica puede describirse como una serie de rodillos que comprimen y eliminan las capas sucesivas de la túnica submucosa cuando el intestino intacto se pone entre ellos. La túnica submucosa del intestino delgado es comparativamente más dura y rígida que el tejido circundante y los rodillos estrujan los componentes más blandos y los separan de la submucosa. El resultado de la limpieza con la máquina fue tal que sólo permaneció la capa submucosal del intestino.

Después de la limpieza mecánica, se empleó una limpieza química para eliminar los componentes celulares y de la matriz y se realizó preferiblemente en condiciones asépticas a temperatura ambiente. El intestino se corta longitudinalmente hacia el lumen y después se corta en secciones de lámina de aproximadamente 15 cm cuadrados. El material se pesó y se puso en contenedores en una proporción de aproximadamente 100:1 v/v de disolución respecto al material intestinal. En el tratamiento de limpieza química más preferido, tal como el método descrito en la Solicitud Internacional PCT WO 98/49969, cuya descripción ser incorpora aquí, el tejido colagenoso se pone en contacto con un agente quelante, tal como sal de tetrasodio del ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) en condiciones alcalinas, preferiblemente mediante la adición de hidróxido de sodio (NaOH); después se pone en contacto con un ácido en el que el ácido contiene una sal, preferiblemente ácido clorhídrico (HCl) que contiene cloruro de sodio (NaCl); después se pone en contacto con una disolución salina tamponada tal como 1 M cloruro de sodio (NaCl)/10 mM disolución salina tamponada con fosfato (PBS); seguido finalmente de una etapa de lavado utilizando agua.

Cada etapa del tratamiento se realiza preferiblemente utilizando una plataforma giratoria o de agitación. Después del lavado, el agua se elimina de cada contenedor y la ICL puede almacenarse congelada a -80ºC, a 4ºC en tampón fosfato estéril o secarse hasta su utilización en la fabricación de una prótesis. Si se almacena seca, las láminas de ICL se aplanan en una superficie tal como una placa plana, preferiblemente o relativamente de un material no reactivo o inerte, tal como una lámina de policarbonato rígida, y se elimina cualquier etiqueta linfática del lado abluminal del material utilizando un escalpelo y se deja que las láminas de ICL se sequen en una campana de flujo laminar a temperatura y humedad ambiente.

La ICL es una estructura laminar plana que puede utilizarse para fabricar varios tipos de construcciones que se pueden utilizar como una prótesis dependiendo la forma de la prótesis de su utilización pretendida. Para formar prótesis de la invención, las construcciones deben fabricarse utilizando un método que mantenga la capacidad de biorremodelación del material de matriz procesado pero que también sea capaz de mantener sus características de firmeza y estructurales en su comportamiento como un tejido de reemplazo. La capa estructural de la prótesis es una construcción tubular formada por una lámina única, generalmente rectangular, de matriz tisular procesada. La lámina de matriz tisular procesada se enrolla de manera que un borde está en contacto y se superpone al borde opuesto de la lámina. La superposición sirve como una región de unión. Tal y como se utiliza en la presente memoria, "región de unión" significa un área de contacto entre dos o más capas de la misma o diferente matriz tisular procesada tratada de manera que las capas se superponen entre sí y están lo suficientemente unidas mediante auto-laminación y unión química. El área de contacto es una región de unión en la que las capas entran en contacto. La región de unión debe ser capaz de aguantar la sutura y la extensión cuando se manipulan en la clínica, en el momento del implante y durante la fase de cicatrización inicial hasta que las células del paciente se dividan y biorremodelen posteriormente la prótesis para formar un tejido nuevo. Cuando se utilizan como un conducto o canal, la región de unión debe ser capaz de aguantar las presiones de la materia que contiene o que pasa a su través, particularmente cuando se utiliza como un injerto vascular bajo las presiones sistólicas y diastólicas del flujo sanguíneo sistémico.

En una realización preferida, una matriz tisular procesada es formada dentro de una prótesis tubular revestida con una capa de colágeno fibrilar sobre cualquier superficie luminal, superficie abluminal o en ambas.

En una realización más preferida, una matriz tisular procesada proviene de la submucosa túnica del intestino delgado y es formada dentro de una estructura tubular y es provista de un revestimiento de colágeno fibrilar denso.

Incluso en una realización todavía más preferida, una matriz tisular procesada comprende ICL procesado formado dentro de una estructura tubular y es provista de una revestimiento de colágeno fibrilar denso sobre la superficie luminal.

En la realización más preferida, una matriz tisular procesada comprende ICL procesado formado dentro de una estructura tubular y es provista con un revestimiento de colágeno fibrilar denso sobre la superficie luminal que es a su vez provista con un agente antitrombogénico, tal como la heparina para formar una prótesis vascular.

El tubo de ICL puede fabricarse con varios diámetros, longitudes y número de capas y puede incorporar otros componentes dependiendo de la indicación para su utilización. La construcción de ICL tubular puede utilizarse como un injerto vascular. Para esta indicación, el injerto comprende al menos una capa con al menos un 5% de superposición para actuar como una región de unión que forma una juntura firme y la superficie luminal se trata preferiblemente con heparina o un agente que previene la trombosis. En otra indicación vascular, la construcción de ICL tubular puede utilizarse como una prótesis externa en los casos en los que se transplantan autoinjertos venosos en el cuerpo y se desea un soporte externo para la vena transplantada. En otra indicación vascular más, la construcción de ICL tubular se conforma en una prótesis metálica para proporcionar una cubierta para la prótesis. Cuando se implanta, la ICL es beneficiosa para el receptor ya que proporciona un recubrimiento protector suave para la prótesis, para prevenir un daño adicional del tejido anfitrión durante el despliegue. Las prótesis de ICL tubular también pueden utilizarse para reparar o reemplazar otras estructuras normalmente tubulares tales como secciones del tracto gastrointestinal, uretra, canales, etc. También puede utilizarse en la reparación del sistema nervioso cuando se fabrica en un tubo para el crecimiento de los nervios empaquetado con componentes de la matriz extracelular, factores de crecimiento o células cultivadas.

Para formar una construcción tubular, se elige un mandril con una medida de diámetro que determinará el diámetro de la construcción formada. El mandril tiene preferiblemente una sección transversal cilíndrica u oval y está hecho de vidrio, acero inoxidable o de una composición no reactiva de grado médico. El mandril puede ser lineal, curvo o anguloso, puede tener ramificaciones o bifurcaciones o varias de estas cualidades. El número de capas pretendido para la construcción tubular que se va a formar se corresponde con el número de veces que una ICL se enrolla alrededor de un mandril y sobre sí misma. El número de veces que la ICL puede enrollarse depende del ancho de la lámina de ICL procesada. Para una construcción tubular de dos capas, el ancho de la lámina debe ser suficiente para enrollar la lámina alrededor del mandril al menos dos veces. Es preferible que el ancho sea suficiente para enrollar la lámina alrededor del mandril el número requerido de veces y un porcentaje adicional más como una superposición que sirva como una región de unión. Aproximadamente entre el 5% y el 20% de la circunferencia del mandril es suficiente para servir como una región de unión y para formar una juntura firme. De manera similar, la longitud del mandril dictará la longitud del tubo que puede formarse en él. Para facilitar el manejo de la construcción en el mandril, el mandril debería ser más largo que la longitud de la construcción de manera que sea el mandril, y no la construcción que se está formando, lo que se toque durante el procedimiento para fabricar la construcción.

La ICL tiene una cualidad de lateralidad derivada de su estado tubular nativo. La ICL tiene dos superficies opuestas: una superficie mucosal interna que da al lumen intestinal y una superficie serosal externa. Se ha encontrado que estas superficies tienen características que pueden afectar al rendimiento post-operatorio de la prótesis pero que pueden aprovecharse para un rendimiento incrementado del dispositivo. En la formación de una construcción tubular para utilizarse como un injerto vascular, se prefiere que la superficie mucosal del material sea la superficie luminal del injerto tubular cuando se forma. El hecho de que la superficie mucosal esté en contacto con el flujo sanguíneo proporciona una ventaja ya que tiene algunas propiedades no trombogénicas que se prefieren para prevenir la oclusión del injerto cuando se ha implantado en un paciente.

Se prefiere que el mandril se proporcione con un recubrimiento de un material no reactivo, con una calidad de grado médico, elástico, de goma o látex en la forma de un manguito. Cuando puede formarse una construcción de ICL tubular directamente en la superficie del mandril, el manguito facilita la separación del tubo formado del mandril y no se adhiere a, reacciona con o deja restos en la ICL. Para separar la construcción formada, se puede tirar del manguito desde un extremo hacia fuera del mandril para arrastrar la construcción fuera del mandril con él. Debido a que la ICL procesada sólo se adhiere ligeramente al manguito y es más adherente a otras capas de ICL, se facilita la fabricación de tubos de ICL ya que la construcción tubulada puede separarse del mandril sin extender o estresar de otra forma o presentar un riesgo de daño para la construcción. En la realización más preferida, el manguito comprende KRATON® (Shell Chemical Company), una goma termoplástica compuesta por copolímeros estireno-etileno/butileno-estireno con un bloque central saturado muy estable.

Para simplificar la ilustración, se forma una construcción tubular de dos capas con un diámetro de 4 mm y una superposición de 10% en un mandril que tiene un diámetro de aproximadamente 4 mm. El mandril se proporciona con un manguito KRATON® aproximadamente tan largo como la longitud del mandril y más largo que la construcción que se va a formar en él. Una lámina de ICL se ajusta de manera que la dimensión del ancho es aproximadamente 28 mm y la dimensión de longitud puede variar dependiendo de la longitud deseada de la construcción. En al ámbito estéril de una cabina de flujo laminar, la ICL se conforma en un tubo de ICL de colágeno por el proceso siguiente. La ICL se humedece a lo largo de un borde y se alinea con el mandril recubierto con el manguito y, aprovechando la naturaleza adhesiva de la ICL, se "marca" en el manguito y se seca en posición durante al menos 10 minutos o más. La ICL marcada se hidrata y se enrolla alrededor del mandril y luego sobre sí misma una vuelta completa más 10% de la circunferencia para proporcionar una juntura firme.

Para la formación de construcciones tubulares con una única capa, la ICL debe ser capaz de enrollarse alrededor del mandril una vuelta completa y al menos aproximadamente un 5% de una vuelta adicional como superposición para proporcionar una región de unión que es igual a aproximadamente 5% de la circunferencia de la construcción. Para una construcción de dos capas, la ICL debe ser capaz de enrollarse alrededor del mandril al menos dos veces y preferiblemente un 5% a 20% de vuelta adicional como una superposición. Mientras que el enrollamiento de dos capas proporciona una región de unión de 100% entre las superficies de la ICL, el porcentaje adicional para superposición asegura una juntura firme e impermeable. Para una construcción de tres capas, la ICL debe ser capaz de enrollarse alrededor del mandril al menos tres veces y preferiblemente un 5% a 20% de vuelta adicional como una superposición. La construcción puede prepararse con cualquier número de capas dependiendo de las especificaciones para un injerto requeridas por la indicación pretendida. Típicamente, una construcción tubular tendrá 10 capas o menos, preferiblemente entre 2 a 6 capas y más preferiblemente 2 ó 3 capas con diferentes grados de superposición. Después del enrollamiento, cualquier burbuja de aire, pliegue y arruga se elimina de debajo del material y entre las capas.

La ICL puede enrollarse bien manualmente o con la ayuda de un aparato que permite incluso la tensión y eliminación de burbujas de aire o agua o arrugas que pueden producirse por debajo del mandril o entre las capas de ICL. El aparato tendrá una superficie con la que el mandril pueda contactar a lo largo de su longitud al girarse para enrollar la ICL.

Las capas de la ICL enrollada se unen entre sí deshidratándolas mientras están en una disposición enrollada en el mandril recubierto con el manguito. Mientras que no se desee estar limitado por la teoría, la deshidratación hace que los componentes de la matriz extracelular, tales como las fibras de colágeno, de las capas se junten cuando se elimina el agua de los espacios entre las fibras de la matriz. La deshidratación puede realizarse en aire, en vacío o por medios químicos tales como con acetona o un alcohol tal como alcohol etílico o alcohol isopropílico. La deshidratación puede hacerse a humedad ambiente, normalmente entre alrededor del 10% Rh a 20% Rh, o menos; ó alrededor del 10% a 20% de humedad en peso. La deshidratación puede realizarse fácilmente orientando el mandril con las capas de ICL hacia el flujo de aire estéril entrante de la cabina de flujo laminar durante al menos alrededor de 1 a 24 horas a temperatura ambiente, aproximadamente 20ºC, y a humedad ambiente. El tubo de ICL es luego sacado del manguito al quitar el manguito del mandril llevando el tubo de ICL con él y el manguito sacado del lumen de la construcción al tirar del manguito por los extremos y deslizarlo fuera del mandril. Las construcciones son luego rehidratadas con un agente de rehidratación acuoso, preferiblemente agua, al transferirlos a un recipiente estéril a temperatura ambiente que contiene un agente de rehidratación al menos durante 10 a 15 minutos, para rehidratar las capas sin separarlas o deslaminarlas.

En otra realización preferida, un revestimiento de colágeno puede ser añadido a cualquier superficie luminal o abluminal, o a ambas superficies luminal y abluminal del tubo formado. El colágeno puede ser depositado sobre las superficies del ICL tal como se describe en el ejemplo 5 de la Patente de Estados Unidos Nº 5.256.418. Esta capa de colágeno depositada es descrita como "colágeno fibrilar denso", también llamada "DFC", y es una capa de telopéptido de colágeno fibrilar formada a partir de una solución de colágeno. La capa de DFC sirve como una superficie de flujo suave en la superficie interna de la capa estructural del ICL cuando la construcción es utilizada como un injerto vascular. La etapa de deposición puede también ser realizada tal como se ha descrito en la solicitud de patente referenciada anteriormente, utilizando una cabeza de presión hidrostática formada utilizando el aparato de la Figura 1. La Figura 1 muestra un depósito de colágeno, 10, un tubo bifurcado, 20, accesorios luer, 25, una construcción tubular de ICL unido, 50, y un contenedor, 30, que contiene PEG, 35. Para crear una cabeza de presión hidrostática, el depósito de colágeno, 10, que contiene una solución de colágeno se monta a una distancia de entre 0,91 m a 2,43 m (3 a 8 pies) por encima de la construcción tubular, 50, y se conecta a la construcción por medio de la tubería bifurcada, 20, adjunta a los accesorio luer, 25, asegurado a cualquier extremo de la construcción. Resumiendo, después de que el ICL sea tubulado (dado forma de tubo), el tejido multicapa es fijado a un extremo por los accesorios luer, 25, rehidratado con agua desionizada y rellenado el tubo con el colágeno del depósito de colágeno, 10. La capa interna de colágeno puede también depositarse al fluir el colágeno dentro de ambos extremos del tubo simultáneamente. Una composición de colágeno preferida es una concentración de colágeno extractado en ácido solubilizado entre 1 a 5 mg/ml en ácido acético. El tubo es colocado luego dentro de un baño de polietilenglicol (PEG) de 600 a 650 mmol/kg de p/v, de peso molecular 8000, tamponado al 20% en solución salina tamponada con fosfato isotónico (PBS), de pH neutro. Los injertos son montados sobre un armazón durante la deposición del colágeno para facilitar una presión hidrostática de entre 100 a 150 mmHg, preferiblemente alrededor de 120 mmHg. El gradiente osmótico entre la solución de colágeno interna y la solución de colágeno externa en combinación causa una concentración y deposición simultánea del colágeno a lo largo del lumen de la pared de la capa estructural interna. Se deja que ocurra la deposición de DFC durante un tiempo, preferiblemente de entre 10 minutos a 6 horas, más preferiblemente de entre 10 minutos a 60 minutos, mejor aún alrededor de 30 minutos. Una deposición de 10 minutos producirá un revestimiento de DFC de alrededor de entre 15 a 20 \mum; una deposición de 30 minutos, alrededor de entre 40 a 50 \mum. Un tiempo de deposición más largo producirá un revestimiento de DFC más grueso. El tubo es luego sacado del baño de PEG, limpiado con PBS y el lumen de la construcción es mantenido mientras que la prótesis se deja secar. Un medio para mantener el lumen es insertar dentro del lumen un segundo mandril con un diámetro más pequeño que el primero. Un medio preferido para mantener un lumen es provocar o introducir aire dentro de la construcción. Luego la prótesis se deja secar. El tubo posteriormente es rehidratado con una solución salina tamponada con fosfato isotónico (PBS). Este proceso permite a la capa de colágeno depositada rellenar las irregularidades leves de la capa estructural intestinal, resultando de este modo una capa que tiene una superficie suave y un grosor uniforme aproximado. El procedimiento también facilita la unión del gel de colágeno con la capa de colágeno intestinal. Una capa de colágeno de grosor y densidad variables puede ser producida simplemente cambiando las condiciones de deposición, tales como: la concentración o pH de la solución de colágeno, la concentración o pH de la solución de PEG, el tiempo o la temperatura. Los cambios de parámetros pueden ser fácilmente determinados por los expertos en el campo de los colágenos. Los mismos procedimientos pueden ser utilizados para aplicar el colágeno a la superficie externa del ICL para crear una prótesis de tres capas.

Para unir juntas las capas de ICL y DFC, la prótesis es hidratada y deshidratada al menos durante dos ciclos de hidratación y deshidratación. La hidratación es preferiblemente con un agente de hidratación tal como, indistintamente, agua o una solución salina tamponada con fosfato isotónico (PBS) con un pH neutro. La deshidratación es realizada al exponer la prótesis al aire, preferiblemente insuflando aire bajo condiciones asépticas tales como en el flujo de aire entrante de una cabina de flujo laminar y dejada secar durante alrededor de 18 \pm 2 horas en la cabina a temperatura ambiente, aproximadamente a 20ºC en condiciones de humedad del ambiente o menos. La deshidratación puede también realizarse por medio de un disolvente, tal como etanol, acetona o isopropanol.

La prótesis es químicamente enlazada o entrecruzada utilizando un agente de enlace químico. Un agente de enlace preferido es EDC en agua, en una concentración entre alrededor de 0.1mM a 100mM, más preferiblemente en una concentración entre alrededor de 1.0 mM a 10 mM, la más preferida es una concentración entre alrededor de 0.1 mM a 1 mM. El agente de enlace más preferido es 1mM de EDC en agua. EDC es hidrocloruro de 1-[3-(dimetilamino)propil]-3-etilcarbodiimida. Además del EDC, otros carbodiimidas y sus complementos tales como las colas basadas en fibrina o adhesivos de grado médico tales como cianocrilatos, poliuretano, acetatos de vinilo o poliepoxi pueden ser utilizados como enlazadores. Agua, solución salina tamponada con fosfato, o tampón de ácido etanosulfónico 2-[N-morfolino] (MES) pueden ser utilizados para disolver el enlazador. Los tubos de ICL hidratados son luego transferidos a un recipiente tal como un tubo de ensayo o probeta, o una bandeja poco profunda (bandeja de cultivo) y el agente de enlace es cuidadosamente trasvasado a la bandeja asegurándose que ambas capas sean cubiertas y floten libremente y que no haya dentro de los tubos ninguna burbuja de aire. Se cubre la bandeja y se deja reposar durante alrededor de 18 \pm 2 horas en una campana de extracción, transcurrido este tiempo la solución de enlace esta decantada y dispuesta. Después del enlace, los tubos son enjuagados o lavados. Los tubos de ICL son enjuagados tres veces con agua esterilizada en un tubo de ensayo o probeta, o bandeja durante unos cinco minutos por enjuague.

Las prótesis son luego químicamente esterilizadas utilizando un esterilizante químico en fase líquida o de vapor. Las construcciones son esterilizadas en una solución de ácido paracético diluido, tal como se describe en la Patente de Estados Unidos No. 5.460.962. Otros sistemas de esterilización para utilizar con colágenos son conocidos en la técnica y pueden ser utilizados. En el método preferido y en los ejemplos que siguen, el ICL fue desinfectado con una solución de ácido paracético al 0,1% y guardado o almacenado hasta su uso a 4ºC. Si los residuos esterilizantes permanecen después del contacto con el esterilizante, las construcciones son enjuagadas o lavadas. Los tubos de ICL son enjuagados tres veces en una bandeja o tubo de ensayo o probeta con agua esterilizada durante aproximadamente 15 minutos por enjuague.

Los vasos pueden convertirse en no trombogénicos aplicando heparina al lumen del tubo formado. La heparina puede aplicarse a la prótesis mediante diferentes técnicas muy conocidas. Como ilustración, la heparina puede aplicarse a la prótesis de las tres maneras siguientes. En primer lugar, se aplica una disolución de heparina benzalconio (BA-Hep) en alcohol isopropílico a la prótesis rellenando verticalmente el lumen o sumergiendo la prótesis en la disolución y secándola al aire. Este procedimiento trata el colágeno con un complejo BA-Hep unido iónicamente. En segundo lugar, puede utilizarse EDC para activar la heparina y luego para unir covalentemente la heparina a la fibra de colágeno. En tercer lugar, puede utilizarse EDC para activar el colágeno, unir covalentemente protamina al colágeno y unir iónicamente heparina a la protamina. También podrían utilizarse muchos otros procedimientos de recubrimiento, unión y enlace muy conocidos en la técnica. Cuando se completa fabricación de las construcciones, estas se colocan en contenedores estériles hasta su utilización o uso.

Las construcciones se esterilizan finalmente utilizando medios conocidos en la técnica de la esterilización de dispositivos médicos. Un método preferido para la esterilización es poner en contacto las construcciones con tratamiento de ácido peracético (PA) al 0,1% estéril neutralizado con una cantidad suficiente de hidróxido de sodio (NaOH) 10 N, según la Patente de EEUU No. 5.460.962. La descontaminación se realiza en un contenedor en una plataforma agitadora, tal como contenedores Nalge de 1 L, durante 18 \pm 2 horas. Las construcciones se lavan poniéndolas en contacto con tres volúmenes de agua estéril durante 10 minutos cada lavado.

Las prótesis tubulares pueden utilizarse, por ejemplo, para reemplazar secciones transversales de órganos tubulares tales como vasculatura, esófago, traquea, intestino y trompas de falopio. Estos órganos tienen una forma básica tubular con una superficie exterior y una superficie interior luminal. También pueden utilizarse láminas planas para el soporte de órganos, por ejemplo, para soportar órganos prolapsados o hipermóviles utilizando la lámina como un cabestrillo para los órganos, tales como vejiga o útero. Además, las láminas planas y las estructuras tubulares pueden formarse juntas para formar una estructura compleja para reemplazar o aumentar las válvulas cardiacas o venosas.

Las prótesis de injerto obtenidas por bioingeniería de la invención pueden utilizarse para reparar o reemplazar estructuras corporales que se han dañado o enfermas en el tejido anfitrión. A la vez que funciona como una parte o soporte corporal sustitutivo, la prótesis también funciona como un armazón de matriz biorremodelable para el crecimiento de células anfitrionas hacia el interior del tejido receptor. "Biorremodelado" se utiliza en la presente memoria para significar la producción de colágeno estructural, vascularización y repoblación celular mediante el crecimiento de células anfitrionas hacia el interior del tejido receptor a una velocidad funcional igual aproximadamente a la velocidad de biodegradación, reformado y reemplazo de los componentes de la matriz de la prótesis implantada por las células y enzimas del anfitrión. La prótesis de injerto retiene sus características estructurales mientras que se remodela por el anfitrión completamente, o sustancialmente, en tejido del anfitrión y como tal es funcional como un análogo del tejido que repara o al que reemplaza.

La temperatura de contracción (ºC) de la prótesis de matriz tisular es un indicador del grado de entrecruzamiento de la matriz. Cuanto más alta sea la temperatura de contracción más entrecruzado está el material. La ICL no entrecruzada tiene una temperatura de contracción de entre 68 \pm 0,3ºC. En la realización preferida, las prótesis entrecruzadas con EDC deberían tener una temperatura de contracción entre 68 \pm 0,3ºC y 75 \pm 1ºC.

Las propiedades mecánicas incluyen la integridad mecánica de manera que la prótesis resista la fluencia durante el biorremodelado y adicionalmente es flexible y suturable. El término "flexible" significa buenas propiedades de manejo para facilitar el uso en la clínica.

El término "suturable" significa que las propiedades mecánicas de la capa incluyen la retención de la sutura que permite que las agujas y los materiales de sutura atraviesen el material de la prótesis en el momento de la sutura de la prótesis a secciones del tejido nativo, un proceso conocido como anastomosis. Durante la sutura, dichas prótesis no deben romperse como resultado de las fuerzas de tensión aplicadas en ellas por la sutura, ni deben romperse cuando se anuda la sutura. La suturabilidad de las prótesis, es decir, la capacidad de las prótesis para resistir la rotura cuando se suturan, está relacionada con la fuerza mecánica intrínseca del material de la prótesis, el espesor del injerto, la tensión aplicada a la sutura y la velocidad con la que el nudo se cierra. La retención de la sutura para una prótesis tubular de 2 capas entrecruzada en 1 mM EDC en agua es entre 3,9 N \pm 0,9 N. La fuerza más baja de la retención de la sutura preferida es aproximadamente 2 N para una prótesis plana entrecruzada de 2 capas; la fuerza de anudado de un cirujano cuando sutura es aproximadamente 1,8 N.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, el término "anti-fluencia" significa que las propiedades biomecánicas de la prótesis imparten durabilidad de manera que la prótesis no se alargue, distienda o expanda más allá de los límites normales después del implante. Como se describe más adelante, la extensión total de la prótesis implantada de esta invención está dentro de los límites aceptables. La prótesis de esta invención adquiere una resistencia al alargamiento como función del biorremodelado celular posterior al implante por el reemplazo del colágeno estructural por las células anfitrionas a una velocidad mayor que la pérdida de fuerza mecánica de los materiales implantados debida a la biodegradación y remodelado.

El material tisular procesado de la presente invención es "semipermeable", incluso si se ha hecho capas y unido. La semipermeabilidad permite el crecimiento de células anfitrionas hacia el interior del tejido receptor para el remodelado o para la deposición de agentes y componentes que afectarán la capacidad de biorremodelación, crecimiento celular hacia el interior del tejido receptor, prevención o estimulación de la adhesión o flujo sanguíneo. La cualidad "no porosa" de la prótesis previene el paso de fluidos que quieren retenerse mediante el implante de la prótesis. A la inversa, los poros pueden formarse en la prótesis si se requiere una cualidad porosa o perforada para una aplicación de la prótesis.

En algunas realizaciones, después de que la ICL se vuelve a conformar en una construcción para la reparación o reemplazo tisular y tiene la capa de colágeno fibrilar denso depositada en él, puede poblarse con células para formar una construcción tisular celular que comprende capas unidas de ICL y células cultivadas. Las construcciones tisulares celulares pueden formarse para mimetizar los órganos que van a reparar o reemplazar.

Los cultivos celulares se establecen a partir de fuentes de tejidos de mamíferos disociando el tejido o por el método del explante. Los cultivos primarios se establecen y se conservan en frío en bancos de células principales de los que partes del banco se descongelan, siembran y subcultivan para aumentar el número de células. Para poblar una construcción de ICL acelular con células, la construcción se pone en una placa o matraz de cultivo y se pone en contacto por inmersión con medio que contiene células suspendidas. Como el colágeno es una sustancia natural para la adhesión celular, las células se unen a la construcción de ICL y proliferan sobre y dentro de la matriz colagenosa de la construcción.

Los tipos de células preferidos para utilizarse en esta invención se obtienen a partir del mesénquima. Los tipos de células más preferidos son fibroblastos, células del estroma y otras células de tejido conectivo de soporte o fibroblastos dérmicos humanos. Las cepas de células de fibroblastos humanos pueden obtenerse de varias fuentes, incluyendo, pero sin estar limitadas a, prepucio neonatal, dermis, tendón, pulmón, cordones umbilicales, cartílago, uretra, estroma de la córnea, mucosa oral e intestino. Las células humanas pueden incluir pero no necesitan estar limitadas a: fibroblastos, células de músculo liso, condrocitos y otras células de tejido conectivo de origen mesenquimal. Se prefiere, pero no se requiere, que el origen de la célula que produce la matriz utilizada en la producción de una construcción de tejido se obtenga a partir de un tipo de tejido al que debe parecerse o mimetizarse después de emplear los métodos de cultivo de la invención. Por ejemplo, una construcción de lámina de múltiples capas se cultiva con fibroblastos para formar una construcción de tejido conectivo vivo; o mioblastos, para una construcción de músculo esquelético. Puede utilizarse más de un tipo de célula para poblar una construcción de ICL, por ejemplo, una construcción de ICL tubular puede cultivarse en primer lugar con células de músculo liso y después el lumen de la construcción poblado con el primer tipo de células se cultiva con células endoteliales vasculares como segundo tipo de células para formar un dispositivo de reemplazo celular vascular. De manera similar, una prótesis de parche de la pared de la vejiga urinaria se prepara de manera similar en construcciones de lámina de ICL de múltiples capas utilizando células de músculo liso como primer tipo de células y células endoteliales urinarias como segundo tipo de células. Los donantes de células pueden variar en el desarrollo y la edad. Las células pueden obtenerse a partir de tejidos donantes de embriones, neonatos o individuos de más edad incluyendo adultos. Las células progenitoras embrionarias tales como células madre mesenquimales pueden utilizarse en la invención y se inducen para diferenciarse y convertirse en el tejido deseado.

Aunque se prefieren las células humanas para utilizarse en la invención, las células que se van a utilizar en el método de la invención no están limitadas a células de fuentes humanas. Pueden utilizarse células de otras especies de mamíferos incluyendo, pero sin limitarse a, fuentes equina, canina, porcina, bovina, ovina y murina. Además, también pueden utilizarse en esta invención, células modificadas por ingeniería genética transfectadas espontáneamente, químicamente o viralmente. Para las realizaciones que incorporan más de un tipo de células, pueden utilizarse mezclas de células normales y modificadas genéticamente o transfectadas y pueden utilizarse mezclas de células de dos o más especies o fuentes de tejido, o ambas.

Pueden utilizarse células recombinantes o modificadas por ingeniería genética en la producción de la construcción de la matriz celular para crear una construcción de tejido que actúe como un injerto de administración de fármaco para un paciente que necesite unos niveles incrementados de productos celulares naturales o tratamiento con un agente terapéutico. Las células pueden producir y administrar al paciente a través del injerto productos celulares recombinantes, factores de crecimiento, hormonas, péptidos o proteínas durante una cantidad continuada de tiempo o como se necesite cuando esté indicado biológicamente, químicamente o termalmente debido a las condiciones presentes en el paciente. Las células también pueden modificarse por ingeniería genética para expresar proteínas o diferentes tipos de componentes de la matriz extracelular que son bien "normales" pero expresados a niveles altos o modificados de alguna manera para hacer un dispositivo de injerto que comprende matriz extracelular y células vivas que es ventajoso terapéuticamente para mejorar la cicatrización de heridas, neovascularización facilitada o dirigida. Estos procedimientos se conocen generalmente en la técnica y están descritos en Sambrook et al, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1989). Todos los tipos de células mencionados anteriormente pueden utilizarse en esta invención para la producción de una construcción tisular celular formada a partir de una construcción acelular formada a partir de capas de ICL unidas.

Los ejemplos siguientes se proporcionan para explicar mejor la práctica de la presente invención y no deberían interpretarse de ninguna manera como límite del alcance de la presente invención. Se apreciará que el diseño del dispositivo en su composición, forma y espesor debe seleccionarse dependiendo de la indicación final para la construcción. Los expertos en la técnica reconocerán que pueden hacerse varias modificaciones a los métodos descritos aquí, sin salirse del alcance de la presente invención.

Ejemplos Ejemplo 1 Limpieza Química del Intestino Delgado Porcino Limpiado Mecánicamente

El intestino delgado de un cerdo se recogió y se limpió mecánicamente utilizando una máquina limpiadora de intestino Bitterling (Nottingham, UK) que elimina enérgicamente las capas de grasa, músculo y mucosales de la túnica submucosa utilizando una combinación de acción mecánica y lavado utilizando agua. La acción mecánica puede describirse como una serie de rodillos que comprimen y arrancan las capas sucesivas de la túnica submucosa cuando el intestino intacto pasa entre ellos. La túnica submucosa del intestino delgado es comparativamente más dura y rígida que el tejido circundante y los rodillos estrujan los componentes más blandos eliminándolos de la submucosa. El resultado de la limpieza de la máquina fue tal que sólo permaneció la capa submucosal del intestino. El resto del procedimiento se realizó en condiciones asépticas y a temperatura ambiente. Las disoluciones químicas se utilizaron todas a temperatura ambiente. El intestino se cortó entonces a lo largo hasta el lumen y después se cortó en secciones de 15 cm. El material se pesó y se puso en contenedores en una proporción de aproximadamente 100:1 v/v de disolución respecto al material intestinal.

A. A cada contenedor que contiene intestino se añadió aproximadamente 1 L de disolución de etilendiaminotetraacético sal tetrasodio (EDTA) 100 mM /disolución de hidróxido de sodio (NaOH) 10 mM esterilizada con un filtro de 0,22 \mum (micrómetros). Los contenedores se pusieron en una mesa agitadora durante aproximadamente 18 horas a aproximadamente 200 rpm. Después de agitar, la disolución EDTA/NaOH se eliminó de cada botella.

B. A cada contenedor se añadió aproximadamente 1 L de disolución de ácido clorhídrico (HCl) 1 M/disolución de cloruro de sodio (NaCl) 1 M esterilizada con un filtro de 0,22 \mum. Los contenedores se pusieron en una mesa agitadora durante entre aproximadamente 6 y 8 horas a aproximadamente 200 rpm. Después de agitar, la disolución HCl/NaCl se eliminó de cada contenedor.

C. A cada contenedor se añadió aproximadamente 1 L de disolución de cloruro de sodio (NaCl) 1 M/disolución salina tamponada con fosfato (PBS) 10 mM esterilizada con un filtro de 0,22 \mum. Los contenedores se pusieron en una mesa agitadora durante aproximadamente 18 horas a 200 rpm. Después de agitar, la disolución NaCl/PBS se eliminó de cada contenedor.

D. A cada contenedor se añadió aproximadamente 1 L de disolución de PBS 10 mM esterilizada con un filtro de 0,22 \mum. Los contenedores se pusieron en una mesa agitadora durante aproximadamente dos horas a 200 rpm. Después de agitar, la disolución salina tamponada con fosfato se eliminó de cada contenedor.

E. Finalmente, a cada contenedor se añadió aproximadamente 1 L de agua esterilizada con un filtro de 0,22 \mum. Los contenedores se pusieron en una mesa agitadora durante aproximadamente una hora a 200 rpm. Después de agitar, el agua se eliminó de cada contenedor.

Las muestras tratadas se cortaron y se fijaron para análisis histológicos. La tinción con hemotoxilina y eosina (H y E) y tricrómico de Masson se realizó tanto en las muestras de sección transversal como longitudinal de los tejidos control y de los tratados. Las muestras de tejidos tratadas aparecieron sin células ni restos celulares mientras que las muestras control no tratadas aparecieron como era normal y esperado con muchas células.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 2 Estudio Comparativo de Otros Tratamientos de Limpieza para Tejido Colagenoso

Se compararon otros métodos para desinfectar y esterilizar tejidos colagenosos descritos en la Patente de EEUU No. 5.460.962 de Kemp con métodos similares descritos por Cook, et al. en la solicitud PCT Internacional WO 98/22158. Se hicieron los ejemplos 1,2 y 3, de Kemp, además de un método con ácido peracético no tamponado.

Se recogieron los intestinos delgados de 4 cerdos grandes. Los intestinos se obtuvieron, se eliminó la capa mesentérica exterior y los intestinos se limpiaron con agua.

El estudio incluyó siete condiciones: la Condición A se realizó según la descripción del Ejemplo 1 en Cook et al. en la Solicitud PCT Internacional WO 98/22158. La Condición B fue una variación de A respecto a que el material intestinal se limpió mecánicamente antes de emplear el tratamiento químico descrito. Las Condiciones C, D y E se realizaron según los métodos de los Ejemplos 1, 2 y 3 de la Patente de EEUU No. 5.460.962 de Kemp. En todas las condiciones, se utiliza una proporción de diez a uno de disolución a material, esto es, 100 g de material tisular se trata con 1 L de disolución.

A. Se puso material de cada uno de los 4 intestinos en botellas separadas que contienen un litro de disolución de ácido peracético al 0,2% en etanol al 5% (pH 2,56) y se agitó en una plataforma agitadora. Después de dos horas de agitación, la condición A se limpió mecánicamente en la máquina limpiadora de intestinos Bitterling.

Para las otras seis condiciones, B a G, el intestino se limpió mecánicamente utilizando la máquina limpiadora de intestinos Bitterling antes del tratamiento químico. Después de la limpieza mecánica, se pusieron piezas representativas de los 4 intestinos en botellas que contienen disolución para el tratamiento químico. Las botellas se agitaron 18 \pm 2 horas en una plataforma. Las seis condiciones restantes, B a G, fueron como sigue:

B. Una disolución de un litro de ácido peracético al 0,2% en etanol al 5% (pH 2,56).

C. Una disolución de un litro de ácido peracético al 0,1% en disolución salina tamponada con fosfato (pH 7,2).

D. Una disolución de un litro de ácido peracético al 0,1% y cloruro de sodio 1M (NaCl) (pH 7,2).

E. Una disolución de un litro de ácido peracético al 0,1% y 1M NaCl (pH 2,9).

F. Una disolución de un litro de disoluciones de "limpieza química" como se ha mencionado anteriormente en el Ejemplo 1.

G. Una disolución de un litro de ácido peracético al 0,1% en agua desionizada, tamponada a pH 7,0.

Después de los tratamientos químicos y mecánicos, todas las condiciones se lavaron durante un total de 4 veces con agua purificada esterilizada por filtración. El material tratado mecánicamente y químicamente se tiñó groseramente para examinar los restos celulares con hematoxilina de Mayer. La evaluación morfológica incluyó técnicas de tinción de Hematoxilina y Eosina, Tricrómico de Masson y Rojo de Alizarina. Los resultados histológicos de los diferentes tratamientos muestran que el método de la condición A rindió un material del que fue difícil eliminar las capas mucosales en Bitterling después del tratamiento químico. El material se tuvo que someter a Bitterling aproximadamente 10-12 veces más. El material estaba muy hinchado al principio y tenía una cantidad significativamente grande de restos celulares en la superficie y en la vasculatura del material. El método de la condición B también estaba muy hinchado y también demostró una cantidad significativamente grande de restos celulares en la superficie y en la vasculatura del material. Los métodos de las condiciones C y D rindieron un material no hinchado que tenía restos celulares mínimos en la vasculatura. La condición E rindió un material que estaba ligeramente hinchado y que contenía restos celulares mínimos en la vasculatura.

Se utilizó un kit de aislamiento de ADN/ARN (Amersham Life Sciences) para cuantificar el ADN/ARN residual contenido en los tejidos limpiados. Los resultados se resumen en la Tabla 1.

1

Los análisis morfológicos se correlacionan con la cuantificación de ADN/ARN para mostrar que los regímenes de limpieza de las condiciones A y B resultan en una matriz tisular colagenosa que todavía tiene un alto contenido celular y que contiene ADN residual como resultado de esto. Los métodos de limpieza de Kemp son mucho más eficaces para eliminar las células y restos celulares de las matrices tisulares colagenosas. Finalmente, el método de limpieza química de la Condición F, descrito en la Solicitud PCT Internacional No. WO 98/49969 de Abraham, et al. y mostrado en el Ejemplo 1 anterior, elimina todas las células y restos celulares y su ADN/ARN hasta un nivel indetectable por estos métodos.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 3 Método para Hacer un injerto tubular de ICL/DFC

En el campo estéril de una cabina de flujo laminar, la ICL se conformó en tubos de ICL de colágeno por el proceso siguiente. Las etiquetas linfáticas se recortan de la superficie serosal de la ICL. La ICL se secó con toallitas absorbentes estériles para absorber el exceso de agua del material y se pulverizó en una lámina de policarbonato porosa y se dejó secar en el flujo de aire entrante de la cabina de flujo laminar. Una vez seca, la ICL se cortó en piezas de 28,5 mm x 10 cm para un injerto de 2 capas con aproximadamente un 10% de superposición. Para proporcionar un soporte para la ICL en la formación de los tubos, se cubrió un mandril cilíndrico de acero inoxidable con un diámetro de aproximadamente 4 mm con KRATON®, un material de manguito elástico que facilita la separación del tubo de colágeno formado del mandril y no se adhiere ni reacciona con la ICL. El borde largo de la ICL se humedeció con agua estéril y se adhirió al mandril y se dejó secar durante aproximadamente 15 minutos para formar una "marca". Una vez adherida, la ICL se enrolló alrededor del mandril y sobre sí misma una vuelta completa. Después de terminar el enrollamiento, se eliminaron las burbujas de aire, plegamientos y arrugas de debajo del material y entre las capas. Las construcciones enrolladas (en los mandriles) se dejaron secar en el flujo de aire de la cabina de flujo laminar durante aproximadamente una hora en la cabina a temperatura ambiente, aproximadamente 20ºC. El tubo de ICL formado y el Kraton fueron quitados juntos del mandril y el tubo de ICL fue quitado del Kraton.

Para depositar el colágeno fibrilar denso (DFC) sobre la superficie luminal del tubo, los dispositivos antideslizantes (barbs) luer se adjuntan a ambos extremos del tubo para añadir tuberías para facilitar la entrega de colágeno y de agente de deposición al interior del tubo. Se añade una solución ácida de colágeno extractado en ácido acético en aproximadamente 2,5 mg/ml a través de un dispositivo antideslizante (barb) luer hasta el lumen del tubo, se rellena con la solución de colágeno bajo la presión estática interna de 120 mmHg o bajo flujo de aire insuflado durante un tiempo de 10, 30 ó 60 minutos, dependiendo del grosor deseado para el revestimiento final de DFC. Cuando el aire es desplazado del interior del tubo por la solución de colágeno, el segundo extremo es conectado a una rama o brazo del tubo que abastece de colágeno al primer extremo. El tubo es sumergido en un baño de polietilenglicol (PEG) circulante N600, de peso molecular 8000, de aproximadamente 500 ml. Luego, a través de los dispositivos antideslizantes (barbs) luer, los tubos son enjuagados o lavados con una solución salina tamponada con fosfato para neutralizar los volúmenes de colágeno, aproximadamente 60 cc, con presión hidrostática para no dañar el nuevo recubrimiento luminal depositado de DFC. Entonces el dispositivo antideslizante (barb) luer es conectado a una fuente de aire estéril filtrado y se seca el tubo con el flujo del aire bajo la presión estática interna de 120 mmHg durante un tiempo deseado de unas 2 a 3 horas, o hasta alcanzar aproximadamente la humedad relativa del ambiente. El tubo es rehidratado en PBS al menos durante una hora y secado de nuevo por lo menos durante 2 horas a toda la noche (18 \pm 2 horas), utilizando el mismo método de secado por aire. Posteriormente cada uno de los tubos es químicamente enlazado con alrededor de 50 ml de un agente de enlace de 1mM de EDC en agua estéril durante alrededor de 18 \pm 2 horas. Los tubos son luego enjuagados con tres volúmenes iguales de agua estéril para eliminar los residuos del agente de enlace y de los productos de reacción. Posteriormente los tubos en la fase terminal son esterilizados en una solución de ácido paracético al 0,1% en agua desionizada, neutralizada de acuerdo al método Kemp, con un pH de 6,9 a 7,1. Los tubos son luego enjuagados o lavados en dos volúmenes de agua estéril para eliminar los residuos de esterilizantes. Finalmente los tubos son colgados verticalmente y el lumen es rellenado con BA-HEP durante al menos un minuto, y drenado y dejado secar durante al menos una hora. Este proceso se repite dos veces para un total de tres tratamientos con heparina de benzalconio. Posteriormente, las construcciones de los tubos son empaquetadas o embaladas en tubos de ensayo estériles de policarbonato, hasta su utilización.

Ejemplo 4 Ensayo Mecánico de las Prótesis de ICL en Tubo

Se midieron varias propiedades mecánicas de una construcción tubular de ICL de 2 capas formada a partir de una única lámina de ICL enrollada alrededor de un mandril con una superposición de 20%, entrecruzada a 1 mM EDC en agua. Se realizaron ensayos de retención de sutura, rotura, porosidad y distensibilidad según la "Guidance for the Preparation of Research and Marketing Applications for Vascular Graft Prostheses", FDA Draft Document, Agosto 1993. Los análisis de retención de sutura, rotura y distensibilidad se realizaron utilizando un sistema de ensayo servohidráulico MTS con el programa informático TestStar-SX.

Brevemente, el ensayo de retención de sutura consistió en tirar de una sutura 2,0 mm desde el borde de un injerto a una proporción constante. Se midió el pico de fuerza cuando la sutura se desgarró del injerto. La medida media obtenida estuvo por encima de los límites requeridos lo que indica que la construcción puede soportar las presiones físicas de sutura en la clínica.

En el ensayo de rotura, se aplicó presión al injerto en incrementos de 13,8 kPa (2,0 psi) durante intervalos de un minuto hasta que el injerto se rompió. Como referencia, la presión sistólica es aproximadamente 120 mmHg (16,0 kPa) en una persona normotensiva. La fuerza de rotura obtenida por el ensayo demostró que la construcción podría soportar presiones de aproximadamente 7,75 veces la presión sistólica indicando así que la construcción puede injertarse para indicaciones vasculares y que soporta el rigor de la circulación sanguínea.

Para el ensayo de distensibilidad, el injerto se llevó a 80 y 120 mmHg sucesivamente. El diámetro del injerto se midió a cada presión utilizando programas informáticos de análisis por imagen y la distensibilidad se calculó como (D_{120}-D_{80})/(D_{80} x 40 mmHg) x 100%. La distensibilidad de una arteria carótida de conejo es aproximadamente 0,07%/mmHg, de arteria humana es aproximadamente 0,06%/mmHg y de vena humana es aproximadamente 0,02%/mmHg, lo que indica que la construcción presenta la distensibilidad requerida para servir como un injerto vascular.

Para medir la porosidad, se aplicó PBS bajo presión hidrostática de 120 mmHg al injerto. El volumen de PBS que permeó a través del injerto durante un periodo de 72 horas se normalizó con el tiempo y el área superficial del injerto para calcular la porosidad.

La temperatura de contracción se utilizó para evaluar el grado de entrecruzamiento en un material colagenoso. Cuanto más entrecruzado esté un injerto, mayor energía se requiere para desnaturalizarlo, y por lo tanto mayor temperatura de contracción. Se utilizó un calorímetro diferencial de barrido para medir el flujo de calor a y desde una muestra bajo condiciones termales controladas. La temperatura de contracción se definió como la temperatura de inicio del pico de desnaturalización en la gráfica temperatura-energía.

La retención de sutura está muy por encima de 2 N sugerida para suturar una prótesis en lugar. La fuerza de rotura medida estaba siete veces por encima de la presión sistólica. La distensibilidad estaba en el intervalo de las arterias y venas humanas. La porosidad del tubo de ICL era baja comparada con un injerto de tejido y no requería precoagulación. La temperatura de contracción era próxima a la de ICL no entrecruzada lo que indica una baja cantidad de entrecruzamiento

2

Ejemplo 5 Estudio animal utilizando las Prótesis de ICL/DFC

Las construcciones de ICL envueltas en dos capas unidas con EDC de 1mM en agua desionizada y teniendo la cara mucosal del ICL como la superficie luminal revestida con DFC fueron preparadas. Se probaron dos capas delgadas de DFC: una deposición de 10 minutos que tiene una capa de DFC de aproximadamente 15 a 20 \mum y una deposición que tiene una capa de DFC de grosor de aproximadamente 40 a 50 \mum. Los injertos fueron utilizados como un injerto de sustitución de carótida en un modelo de conejo.

Los conejos blancos de Nueva Zelanda pesaban aproximadamente entre 2 a 2,5 Kg justo antes de operar y la anestesia fue inducida utilizando hidrocloruro de ketamina (30 a 60 mg/kg) y Xilazina (3 a 6 mg/kg) inyectado subcutáneamente. Se mantuvo la anestesia con Ketamina al 50% de dosis de inducción. La zona quirúrgica fue esquilada, preparada y cubierta para mantener la esterilidad de la zona. Se administró Baytril (10 mg/kg) por vía intramuscular en el preoperatorio y se mantuvo caliente a los animales durante la operación mediante una almohadilla eléctrica o de calor. A través de una incisión cervical oblicua derecha, la vena yugular fue movilizada, ligada y dividida para acceder a la arteria carótida. Siguiendo a la movilización completa de la artería carótida derecha y previo al pinzamiento arterial, se administró heparina (200 IU/kg) por vía intravenosa. Posteriormente se colocaron pinzas arteriales atraumáticas de manera proximal y distal a los puntos de la arteriotomía para ocluir el flujo y se realizó la arteriotomía proximal. Una anastomosis termino-lateral proximal de la artería a injertar fue realizada utilizando suturas Ethilon 10-0. Después de un rápido enjuague o lavado del injerto, se realizó la anastomosis de una manera similar. El segmento de la arteria carótida entre la anastomosis fue extirpada dejando un injerto de interposición de 3 a 4 cm de largo. El flujo de la arteria fue restablecido y se realizó el cierre en capas utilizando Vicryl 3-0 para la fascia y Ethilon 4-0 para la piel. Inmediatamente después de la operación, los animales fueron alojados individualmente y observados cada 15 minutos hasta que se mantuvo el decúbito esternal. Todas las heridas quirúrgicas fueron revisadas al menos una vez al día por si hubiera algún signo de complicación. Cualquier acción correctiva necesaria fue realizada y anotada en el expediente.

Antes del sacrificio, se realizó un examen físico general para evaluar el peso corporal y las condiciones generales de los animales. Se tomó el pulso del injerto mediante palpación y se calculó la circulación periférica. Se indujo la anestesia tal como se hizo para la implantación. La incisión previa fue abierta de nuevo. Después de que el injerto fue movilizado, se administró heparina tal como se describió anteriormente. La carótida proximal fue canulada y el animal fue sacrificado con Pentobarbital (100 mg/kg) administrado por vía intravenosa. Inmediatamente después del sacrificio o eutanasia, el injerto fue lavado o enjuagado con una solución de sal equilibrada de Hank con presión fisiológica (80 mmHg) in situ. Para ser analizados histológicamente, los segmentos del injerto fueron fijados con una solución McDowell-Trump a la misma presión durante 30 a 60 minutos. El análisis de las propiedades mecánicas y la receptividad fisiológica fueron realizados utilizando explantes que no han sido fijados. Los injertos fueron extirpados con una manipulación mínima para evitar quitar tejido periadventicial. Se realizó un examen de necropsia y cualquier lesión o tejido anómalo fue puesto en formalina neutra para análisis.

Todas las prótesis de injerto vascular con una capa de DFC de aproximadamente 40 a 50 \mum de grosor eran evidentes (n = 20). Las prótesis que tenían una capa de DFC de aproximadamente 10 a 20 \mum de grosor fueron evidentes al 50% (n = 4). La histología por tinción de hematoxilina y eosina y por inmunohistoquínica mostraba una disminución suave de músculos y la migración de células vasculares endoteliales en y a lo largo de los explantes evidentes. Estos resultados demuestran que las construcciones vasculares fueron capaces de ser biorremodeladas por células anfitrionas mientras que sirven a una prótesis vascular.

Aunque la anterior invención ha sido descrita en algunos detalles por medio de ilustraciones y ejemplos con fines de esclarecimiento y entendimiento, será obvio para cualquier experto en la técnica que ciertos cambios y modificaciones pueden ser practicadas dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims

1. Una prótesis tubular biorremodelable que comprende una primera capa de matriz tisular procesada formada dentro de un tubo que tiene una superficie luminal y una superficie abluminal, en donde la matriz tisular procesada está sustancialmente libre de componentes de matriz extracelular no-colagenosa y comprende telopéptido de colágeno, y una segunda capa de colágeno fibrilar denso en la superficie luminal de la primera capa.

2. La prótesis tubular biorremodelable de la reivindicación 1 en la que los bordes opuestos de la capa se superponen para formar una región de unión entre el 5% y 20% de la circunferencia del tubo.

3. La prótesis tubular biorremodelable de las reivindicaciones 1 y 2 en la que la matriz tisular procesada se obtiene a partir de la túnica submucosa del intestino delgado.

4. La prótesis tubular biorremodelable de las reivindicaciones 1 y 2 en la que la región de unión está entrecruzada con EDC.

5. Un método para producir una construcción en tubo prostética biorremodelable que comprende dos capas de matriz tisular procesada, en el que la matriz tisular procesada está sustancialmente libre de componentes de matriz extracelular no-colagenosa y comprende telopéptido de colágeno, y en el que el método comprende:

a) marcar la matriz tisular procesada alrededor de un mandril cubierto con un manguito hidratando un borde de la matriz tisular procesada y poniendo en contacto el mandril recubierto con un manguito con el borde hidratado de la matriz tisular procesada;

b) secar la matriz tisular procesada en el mandril recubierto con un manguito;

c) rehidratar la matriz tisular procesada con un agente de hidratación para formar la matriz tisular procesada hidratada;

d) girar el mandril dos veces para enrollar la matriz tisular procesada hidratada para formar dos capas hidratadas enrolladas de matriz tisular procesada;

e) deshidratar las capas de la matriz tisular procesada; y

f) quitar la matriz tisular procesada del mandril;

g) poner en contacto la matriz tisular procesada con un agente de entrecruzamiento para entrecruzar el colágeno;

h) depositar una capa de colágeno fibrilar denso sobre la superficie luminal del tubo.

6. Una prótesis tubular biorremodelable para reemplazar una porción o parte dañada o afectada de vasculatura, comprendiendo dicha prótesis tubular biorremodelable dos capas de matriz tisular procesada formadas dentro de un tubo, en el que la matriz tisular está sustancialmente libre de componentes de matriz extracelular no-colagenosa y comprende telopéptido de colágeno, y una capa de colágeno fibrilar denso en la superficie luminal de la prótesis tubular.