CN102586105B - 微流扩散和开放介入的细胞培养阵列芯片及其制作方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微流扩散和开放介入的细胞培养阵列芯片及其制作方法和应用,适用于细胞培养、干细胞增殖及分化、药物筛选、再生医学等。细胞培养阵列芯片包括一个基底和固定在基底上的基片；基片上分布有若干个孔形的细胞培养单元；基片上有相互联通的微流主通道和微流扩散通道，并联通每个细胞培养单元，并与外界环境相通。本发明的优点是：1.所需的培养液、生长因子等是通过微流扩散网络来提供，使细胞剪切力为零，还保证了细胞生长所需的气体和湿度环境;2.模拟细胞在体内的微环境多通道的微流控浓度梯度,实现药物的定时、定量释放等功能；3.适用于细胞表型的高通量的药物筛选研究;4.芯片结构紧凑，且成本低，可大批量生产。

Description

微流扩散和开放介入的细胞培养阵列芯片及其制作方法和应用

技术领域

本发明涉及微流扩散和开放介入的细胞培养阵列芯片及其制作方法和应用,适用于细胞培养、干细胞增殖及分化、细胞组织工程、药物筛选、再生医学、微流控及纳米技术等,属于生物技术领域。

背景技术

在细胞生物学的研究中,细胞培养是很关键的。虽然用传统的培养皿也能够实现细胞的培养与扩增,但是这种静态培养的方式与动物体内细胞的真实环境是有很大差别的。事实证明,动物组织结构中，细胞的代谢是动态的，即其营养及其它生长因子是通过血管输送，再以微流扩散的方式传递到细胞。由此，大多数体内细胞的生命的维持和扩增是基于微流扩散的。近年来，有许多有关在微流条件下细胞培养的报道。但这些工作基本上是灌注式的，即营养液直接流经细胞所在的微流通道或微流腔体，从而引入不利于细胞生长的剪切力。因此，灌注式的微流培养也与体内细胞的真实环境有很大差别的。另外，在封闭的微流芯片中,细胞的生长环境将受到很大的影响，培养条件也难以控制，也因此会导致细胞繁殖缓慢或凋亡。但是，微流芯片用于细胞培养有其独特的优势。例如，可用微流芯片进行高通量的细胞分析等。

综上所述，传统的及灌注式的微流细胞培养方式是不完善的。微流调控的方式虽然很好，但迄今为止所发展的有关细胞培养的设计方案存在根本的缺陷，导致了它的应用局限性。事实上，微流细胞培养当前仍停留在实验室的研究阶段, 离临床应用还有很大一段的距离。

发明内容

本发明的目的在于，克服现有技术的缺点，提供一种微流扩散和开放介入的细胞培养阵列芯片及其制作方法和应用。所述细胞培养阵列芯片由多个重复的开放式细胞培养单元阵列构成，每个细胞培养单元均与微流主通道和微流扩散通道联通，使所需的培养液、生长因子或药物是通过与外界相连的微流扩散网络来提供，从而使细胞剪切力为零；每个细胞培养单元上口对外部环境开放,有效地保证了细胞生长所需的气体和湿度环境；模拟细胞在体内的微环境多通道的微流控浓度梯度,实现药物的定时、定量释放等功能；特别适用于基于细胞表型的高通量的药物筛选研究工作,能够广泛地应用于基础细胞研究和临床诊断领域；同时，芯片结构紧凑，且成本低，并可大批量生产；制作方法简单，易于操作；该微流扩散网络的主通道类似动物体内的毛细血管，相关细胞因子通过与主通道相连的微流扩散通道来实现；本发明是仿真的、动态的、开放的和微流扩散型的研究细胞，效率高，质量稳定。

本发明的微流扩散和开放介入的细胞培养阵列芯片一种技术方案是：

微流扩散和开放介入的细胞培养阵列芯片包括一个基底和固定在基底上的基片；所述基片上分布有若干个孔形的细胞培养单元；每个细胞培养单元一端有朝上开放的上口，另一端下口朝向基底表面；若干个细胞培养单元组成开放式细胞培养单元阵列；基片的与基底相结合的平面上有相互联通的蜂窝状微流主通道和微流扩散通道，并联通每个细胞培养单元，用于将细胞培养液、或细胞因子、或药物通过单路或多路通道定时定量地注入微流主通道中，并通过微流扩散通道与细胞培养单元进行物质交换，而细胞处于零流速状态；每个细胞培养单元上口与外界环境相通，用于调控细胞生长所需的气体和湿度。

在上述技术方案基础上更进一步的技术方案是：

所述的微流扩散和开放介入的细胞培养阵列芯片，所述的基片的与基底相结合的平面上的微流主通道和微流扩散通道为化学修饰的三维几何形状。

所述的微流扩散和开放介入的细胞培养阵列芯片，其细胞培养单元由多边形或圆形微流主通道包围，并由微流扩散通道联通细胞培养单元和微流主通道，用于实现多通道的微流控浓度梯度,使药物定时、定量释放，实现高通量的药物筛选。

所述的微流扩散和开放介入的细胞培养阵列芯片，其微流主通道其流体进出口处有集成微泵和微阀,用于实现化学物质的定时、定量注入。 

所述的微流扩散和开放介入的细胞培养阵列芯片，其构成细胞培养单元阵列的基片其材料为生物兼容高分子材料，选自于聚合物聚二甲基硅氧烷PDMS，或热塑性材料聚甲基丙烯酸甲酯PMMA，或聚碳酸酯PC，或聚苯乙烯PS。

所述的微流扩散和开放介入的细胞培养阵列芯片，其微流扩散通道高度小于等于5微米，宽度小于等于5微米；微流主通道高度小于等于200微米，宽度小于等于 500微米；细胞培养单元的直径大于等于0.2毫米,小于等于10毫米,高度小于等于8毫米。

所述的微流扩散和开放介入的细胞培养阵列芯片，所述的基底其材料为生物兼容材料，选自于玻璃片，或聚合物聚二甲基硅氧烷PDMS、或热塑性材料聚甲基丙烯酸甲酯PMMA、或聚碳酸酯PC、或聚苯乙烯PS制成的偏平片，或平底器皿。

所述的微流扩散和开放介入的细胞培养阵列芯片，所述的细胞培养单元阵列中植入有电的元器件，和/或磁的元器件，和/或光的元器件，或元器件组合芯片。

本发明的微流扩散和开放介入的细胞培养阵列芯片另一种技术方案是：它包括一个基底和固定在基底上的基片；所述基片上分布有若干个孔形的细胞培养单元；每个细胞培养单元一端有朝上开放的上口，另一端下口朝向基底表面；若干个细胞培养单元组成开放式细胞培养单元阵列；基底的与基片相结合的平面上有相互联通的蜂窝状微流主通道和微流扩散通道，并联通每个细胞培养单元；每个细胞培养单元上口与外界环境相通，用于调控细胞生长所需的气体和湿度。

本发明的微流扩散和开放介入的细胞培养阵列芯片的制作方法的技术方案是：包括以下步骤：

A、制作基片：

1) 制作阳模：先绘图并制作光学模板，包括微流主通道和微流扩散通道及细胞培养单元，并用不同颜色区分；然后用光学曝光和离子刻蚀的方法制作包括微流主通道和微流扩散通道的阳模；

2)模制成型基片： 通过软光刻和热压印的方法复制阳模，制成具有微流主通道和微流扩散通道及具有细胞培养单元相对位置标记的PDMS，或PMMA，或PC，或PS基片；

3)加工细胞培养单元和流体进出口：通过微细加工机床定位打通基片上的各细胞培养单元和相应流体进出口；

B、键合基片和基底：将具有微流主通道和微流扩散通道及细胞培养单元的细胞培养单元阵列的基片键合到基底表面上。

本发明的一种微流扩散和开放介入的细胞培养阵列芯片，其应用是用于干细胞增殖及分化、细胞组织工程和药物筛选及临床诊断、再生医学。

本发明的微流扩散和开放介入的细胞培养阵列芯片在进行NIH3T3细胞培养中的应用方法，包括如下步骤：

1)将制作好的细胞培养阵列芯片用灭菌锅进行高温灭菌；

2)在每个细胞培养单元中注入一定量的纤维连接蛋白溶液进行表面修饰一定时间；

3)NIH3T3细胞培养于胎牛血清的DMEM培养液中，使用前震荡均匀并稀释到合适的浓度；

4)通过流体进出口注入胎牛血清的DMEM培养液；

5)通过每个细胞培养单的上口处植入细胞悬浮液；

6)在上述步骤完成一定时间后,通过注射泵向流体进出口持续注入细胞培养液。

本发明的微流扩散和开放介入的细胞培养阵列芯片在进行免疫细胞化学染色对细胞进行表征的应用方法，包括如下步骤： 

1)待细胞在细胞培养阵列芯片中培养若干天后，用甲醛/磷酸盐缓冲溶液将每个细胞培养单元1中的细胞固定；

2)然后分别用聚乙二醇辛基苯基醚/磷酸盐缓冲溶液透化和牛血清蛋白溶液封闭；

3)固定好的细胞为显绿色荧光在一定浓度的异硫氰酸荧光素鬼笔环肽溶液中染色，为显红色荧光在一定浓度的碘化丙啶溶液中染色；

4)用磷酸盐缓冲溶液清洗后用共聚焦显微镜观察细胞核和细胞骨架。

本发明的技术效果显著：微流主通道中的细胞培养液、生长因子或药物通过实时的进行精确的调控。在整个培养过程中,细胞的代谢是通过微流扩散来完成的，因此，作用于细胞剪切力为零；每个细胞培养单元上口与外界是相通的,从而有效的保证了细胞生长所需的气体和湿度环境；相对于传统的静态细胞培养体系而言,基于微流扩散和开放介入的细胞培养阵列可用于模拟细胞在体内的微环境，从而为与其相关的研究和应用，特别是干细胞增殖及分化、药物筛选、细胞组织工程、再生医学等，提供新的方法和手段；相对于现行的微流细胞培养体系,基于微流扩散和开放介入的细胞培养阵列避免细胞所受剪切力的限制，而且便于调控和分析，更能满足生物实验的需要；根据具体实验的需要,能改变微流主通道的设计,多通道的微流控浓度梯度,实现药物的定时、定量释放等功能；本发明特别适用于基于细胞表型的高通量的药物筛选研究工作,能够广泛地应用于基础细胞研究和临床诊断领域；最后，该类芯片的制作简单，成本低，并能大批量生产。

附图说明

图1为图2的A-A视图，是从下向上仰视基片5键合到基底2平面上之前的细胞培养单元1与微流扩散通道3及微流主通道4之间的位置关系和联通途径的视图，该还展示了流体进出口7的位置； 

图2为本发明微流扩散和开放介入的细胞培养阵列芯片结构的主视 (侧向)示意图；展示了位于上层的基片5与下层的基底2之间的关系，同时，局部断开部分展示了细胞培养单元1与微流扩散通道3的联通关系，还展示了流体进出口7的位置：当视图者面向图2，左侧作为流体进口时,则右侧作为流体出口，或者反过来右为进口，则左为出口；

图3为图2的俯视示意图，展示了位于上层的基片5与下层的基底2之间的吻合位置关系和细胞培养单元1上口1.1的阵列状态，同时，局部断开部分展示了细胞培养单元1与微流扩散通道3及微流主通道4及流体进出口7之间的位置关系和联通途径；所述局部断开是沿微流扩散通道3中心线局部断开；

图4为图1的M部局部放大图，是展示若干个细胞培养单元1构成的细胞培养阵列与微流扩散通道3和微流主通道4的相对位置关系示意图；

图5为本发明1个细胞培养单元1的实物俯视放大图；

图6为图5的B-B剖视示意图，展示了基片5与基底2的上下位置关系及基片5上的1个细胞培养单元1与微流扩散通道3及微流主通道4相对位置和联通关系及上口1.1的位置；

图7为本发明微流扩散和开放介入的细胞培养阵列芯片实物放在一盘中的图片；

图8 是在本发明细胞培养阵列芯片中同一细胞培养单元中细胞在不同时间段的生长状况图；

图9 是在本发明细胞培养阵列芯片中同一细胞培养单元中细胞的生长曲线图；

图10 是在本发明细胞培养阵列芯片中NIH3T3细胞的第一个红色荧光图像；

图11 是在本发明细胞培养阵列芯片中NIH3T3细胞的第一个绿色荧光图像；

图12在是在本发明细胞培养阵列阵列芯片中NIH3T3细胞的第二个红色荧光图像； 

图13在是在本发明细胞培养阵列芯片中NIH3T3细胞的第二个绿色荧光图像。

图中各附图标记的名称为：1－细胞培养单元；1.1－上口；2－基底；3－微流扩散通道；4－微流主通道；  5－基片； 6－细胞培养液、和/或细胞因子、 和/或药物；7－流体进出口。

具体实施方式

结合附图对本发明作进一步说明如下：

实施例1：如图1-7所示，是本发明的微流扩散和开放介入的细胞培养阵列芯片第一个较优的实施例。所述微流扩散和开放介入的细胞培养阵列芯片，它包括一个基底2和固定在基底2上的基片5；所述基片5上分布有若干个孔形的细胞培养单元1；每个细胞培养单元1一端有朝上开放的上口1.1，另一端下口朝向基底2表面；若干个细胞培养单元1组成开放式细胞培养单元阵列；基片5的与基底2相结合的平面上有相互联通的蜂窝状微流主通道4和微流扩散通道3，并联通每个细胞培养单元1，用于将细胞培养液、或细胞因子、或药物通过单路或多路通道定时定量地注入微流主通道4中，并通过微流扩散通道3与细胞培养单元1进行物质交换，而细胞处于零流速状态；每个细胞培养单元1上口1.1与外界环境相通，用于调控细胞生长所需的气体和湿度。所述的基片5的与基底2相结合的平面上的微流主通道4和微流扩散通道3为化学修饰的三维几何形状。所述的细胞培养单元1由多边形或圆形微流主通道4包围，本实施例包围细胞培养单元1的微流主通道4为等六边形，也可以选八边形或圆形，由微流扩散通道3联通细胞培养单元1和微流主通道4，用于实现多通道的微流控浓度梯度,使药物定时、定量释放，实现高通量的药物筛选。所述的微流主通道4其流体进出口7处有集成微泵和微阀,用于实现化学物质的定时、定量注入。所述的构成细胞培养单元阵列的基片5其材料为生物兼容高分子材料，选自于聚合物聚二甲基硅氧烷PDMS，或热塑性材料聚甲基丙烯酸甲酯PMMA，或聚碳酸酯PC，或聚苯乙烯PS，本实施例选为聚合物聚二甲基硅氧烷PDMS。所述的微流扩散通道3高度小于等于5微米， 宽度小于等于5微米；微流主通道4高度小于等于200微米，宽度小于等于500微米； 细胞培养单元1的直径大于等于0.2毫米,小于等于10毫米,高度小于等于8毫米，本实施例选为：微流扩散通道3高度为3微米，宽度为4微米；微流主通道4高度为100微米，宽度为200微米；细胞培养单元1的直径等于2毫米, 细胞培养单元1的高度5毫米。所述的基底2其材料为生物兼容材料，选自于玻璃片，或聚合物聚二甲基硅氧烷PDMS、或热塑性材料聚甲基丙烯酸甲酯PMMA、或聚碳酸酯PC、或聚苯乙烯PS制成的偏平片，或平底器皿，本实施例选为玻璃片。所述的细胞培养单元阵列中植入有电的元器件，和/或磁的元器件，和/或光的元器件，或元器件组合芯片。本实施例选为微电控元件和微电极、微泵及微阀，还可以选微电控元件、微电极、微泵、微阀、微光控元件、微磁控元件的一种或多种组合。

实施例2：与上述实施例1不同的是：所述的构成细胞培养单元阵列的基片5其材料为热塑性材料聚甲基丙烯酸甲酯PMMA。所述的微流扩散通道3高度等于5微米，宽度为5微米；微流主通道4高度等于200微米，宽度等于480微米；细胞培养单元1的直径等于10毫米, 细胞培养单元1的高度等于8毫米；所述的基底2其材料为热塑性材料聚甲基丙烯酸甲酯PMMA，也可以选聚碳酸酯PC、或聚苯乙烯PS制成的偏平片。所述的细胞培养单元阵列中植入有电的元器件和光的元器件，为微电极、微泵及微阀，微电控元件、微光控元件。

实施例3：是本发明的微流扩散和开放介入的细胞培养阵列芯片第二个较优的基本实施例。与实施例1不同的是：基底2的与基片5相结合的平面上有相互联通的蜂窝状微流主通道4和微流扩散通道3，并联通每个细胞培养单元1；所述的基底2的与基片5相结合的平面上的微流主通道4和微流扩散通道3为化学修饰的三维几何形状。也就是：微流主通道4和微流扩散通道3制作在基底2上平面上，基片5上只有细胞培养单元1，且基片5的下平面只有细胞培养单元1的下口。本实施例在键合基底2与基片5时，细胞培养单元1的定位非常重要，一但错位，细胞培养单元1与微流主通道4和微流扩散通道3就不能很好联通，会影响使用效果。

实施例4：是本发明的微流扩散和开放介入的细胞培养阵列芯片的制作方法的基本实施例，步骤包括：

A、制作基片5：

1) 制作阳模：先绘图并制作光学模板，包括微流主通道4和微流扩散通道3及细胞培养单元1，并用不同颜色区分；然后用光学曝光和离子刻蚀的方法制作包括微流主通道4和微流扩散通道3的阳模；

2)模制成型基片： 通过软光刻和热压印的方法复制阳模，制成具有微流主通道4和微流扩散通道3及具有细胞培养单元1相对位置标记的PDMS，或PMMA，或PC，或PS基片；

3)加工细胞培养单元1和流体进出口7：通过微细加工机床定位打通基片上的各细胞培养单元1和相应流体进出口7；

B、键合基片5和基底2：将具有微流主通道4和微流扩散通道3及细胞培养单元1的细胞培养单元阵列的基片5键合到基底2表面上。

实施例5：是本发明的微流扩散和开放介入的细胞培养阵列芯片的制作方法的一个更具体实施例，芯片结构如图1-7所示；  

具体步骤中： 

 A、制作基片5：

1)用L-Edit绘图并制作如图1的光学模板，主要包括3部分：微流主通道 4用红色、微流扩散通道3用绿色和细胞培养单元1用蓝色绘制；其中, 微流扩散通道3宽度为5微米，另外长度为500微米，微流主通道4宽度为150微米；蜂窝状微流扩散通道3与每个细胞培养单元1相连,每个细胞培养单元1的直径为1毫米，高度为4毫米；在干净的硅片上用光学曝光的方法制做微流扩散通道3，并用离子刻蚀的方法将图案转移到硅片上，其高度为2微米；然后在模具上通过对位方式用光学曝光的方法制做微流主通道4,其高度为50微米；

2)模制成型基片： 液态的PDMS单体/固化剂按10:1的比例混合，充分搅拌，除气泡后倒在固定在制作好的模具上，PDMS厚度小于等于8毫米，本实施例为4毫米，于80℃固化3小时左右，然后将固化的PDMS从阳模剥离，成为具有微流主通道4和微流扩散通道3及具有细胞培养单元1相对位置标记的PDMS基片；

3)加工细胞培养单元1和流体进出口7：通过微细加工铣床定位用1毫米针头打通基片5上的各细胞培养单元1和相应流体进出口7： 

B、键合基片5和基底2：用等离子体氧化处理基片5和基底2玻片的表面2分钟，实现将PDMS基片5与载玻片基底2的键合，即得到细胞培养阵列芯片。

实施例6：微流扩散和开放介入的细胞培养阵列芯片的应用实例：用于干细胞增殖及分化，还可以是细胞组织工程和药物筛选及临床诊断及再生医学研究。

实施例7：本发明的微流扩散和开放介入的细胞培养阵列芯片在进行NIH3T3细胞培养中的应用方法的一个基本实施例，包括如下步骤：

1)将制作好的细胞培养阵列芯片用灭菌锅进行高温灭菌；

2)在每个细胞培养单元1中注入一定量的纤维连接蛋白溶液进行表面修饰一定时间；

3)NIH3T3细胞培养于胎牛血清的DMEM培养液中，使用前震荡均匀并稀释到合适的浓度；

4)通过流体进出口7注入胎牛血清的DMEM培养液；

5)通过每个细胞培养单元1的上口1.1处植入细胞悬浮液；

6)在上述步骤完成过后过一定时间,通过注射泵向流体进出口7持续注入细胞培养液。

实施例8：如图8-9所示，是本发明的一种微流扩散和开放介入的细胞培养阵列芯片在进行NIH3T3细胞培养中的应用方法的一个更具体的实施例，在上述实施例5的基础上，相应的具体步骤：

2)在每个细胞培养单元1中注入一定量的的纤维连接蛋白溶液进行表面修饰一定时间；注入量选值为45～55微克/毫升，表面修饰时间约10～20分钟; 本实施例是在每个细胞培养单元1中注入50微克/毫升的纤维连接蛋白溶液进行表面修饰一定时间15分钟；

3)NIH3T3细胞培养于胎牛血清的DMEM培养液中，使用前震荡均匀并稀释到合适的浓度；本实施例NIH3T3细胞培养于1%胎牛血清的DMEM培养液中，使用前震荡均匀并稀释到合适的浓度，浓度大约为10⁵个/毫升；

4)通过流体进出口7注入胎牛血清的DMEM培养液；本实施例通过流体进出口7注入1%胎牛血清的DMEM培养液；

5)通过每个细胞培养单1的上口1.1处植入细胞悬浮液；植入细胞悬浮液为4～65微升；本实施例植入50微升细胞悬浮液；

6)在上述步骤完成一定时间后,通过注射泵向流体进出口7持续注入细胞培养液；注入速度为0.5～1.51微升/分钟，本实施例是待2小时以后,通过注射泵以1微升/分钟的速度向流体进出口7持续注入细胞培养液。

实施例9：本发明的微流扩散和开放介入的细胞培养阵列芯片在进行免疫细胞化学染色对细胞进行表征的应用方法的一个基本实施例，包括如下步骤：

1)待细胞在细胞培养阵列芯片中培养若干天后，用甲醛/磷酸盐缓冲溶液将每个细胞培养单元1中的细胞固定；

2)然后分别用聚乙二醇辛基苯基醚/磷酸盐缓冲溶液透化和牛血清蛋白溶液封闭；

3)固定好的细胞为显绿色荧光在一定浓度的异硫氰酸荧光素鬼笔环肽溶液中染色，为显红色荧光在一定浓度的碘化丙啶溶液中染色；

4)用磷酸盐缓冲溶液清洗后用共聚焦显微镜观察细胞核和细胞骨架。

实施例10：是在本发明的微流扩散和开放介入的细胞培养阵列芯片中进行免疫细胞化学染色对细胞进行表征的应用方法的一个更具体的实施例。 

如图10所示，是在本发明的微流扩散和开放介入的细胞培养阵列芯片中NIH3T3细胞的第一个红色荧光图像；如图11 所示，是在微流扩散和开放介入的细胞培养阵列芯片中NIH3T3细胞的第一个绿色荧光图像；如图12 所示，是在基于微流扩散和开放介入的细胞培养阵列芯片中NIH3T3细胞的第二个红色荧光图像；如图13 所示，是在基于微流扩散和开放介入的细胞培养阵列芯片中NIH3T3细胞的第二个绿色荧光图像。

本发明的微流扩散和开放介入的细胞培养阵列芯片在进行免疫细胞化学染色对细胞进行表征的应用方法，在上述实施例7的基础上，相应的具体步骤为： 

1)待细胞在细胞培养阵列芯片中培养4天后，用4%甲醛/磷酸盐缓冲溶液将每个细胞培养单元1中的细胞固定约10分钟；

2)然后分别用0.5%聚乙二醇辛基苯基醚/磷酸盐缓冲溶液透化和3%牛血清蛋白溶液封闭约30分钟；

3)固定好的细胞为显绿色荧光在含1微克/毫升的的异硫氰酸荧光素鬼笔环肽溶液中染色约20分钟，为显红色荧光在100纳克/毫升的碘化丙啶溶液中染色约20分钟；

4)用磷酸盐缓冲溶液清洗3次后用共聚焦显微镜观察细胞核和细胞骨架。

本发明权利要求保护范围不限于上述实施例。

Claims (10)

1.一种微流扩散和开放介入的细胞培养阵列芯片，其特征在于，它包括一个基底（2）和固定在基底（2）上的基片（5）；所述基片（5）上分布有若干个孔形的细胞培养单元（1）；每个细胞培养单元（1）一端有朝上开放的上口（1.1），另一端下口朝向基底（2）表面；若干个细胞培养单元（1）组成开放式细胞培养单元阵列；基片（5）的与基底（2）相结合的平面上或基底（2）的与基片（5）相结合的平面上，有相互联通的蜂窝状微流主通道（4）和微流扩散通道（3），并联通每个细胞培养单元（1），用于将细胞培养液、或细胞因子、或药物通过单路或多路通道定时定量地注入微流主通道（4）中，并通过微流扩散通道（3）与细胞培养单元（1）进行物质交换，而细胞处于零流速状态；每个细胞培养单元（1）上口（1.1）与外界环境相通，用于调控细胞生长所需的气体和湿度。

2.如权利要求1所述的微流扩散和开放介入的细胞培养阵列芯片，其特征在于, 细胞培养单元（1）由多边形或圆形微流主通道（4）包围，并由微流扩散通道（3）联通细胞培养单元（1）和微流主通道（4），用于实现多通道的微流控浓度梯度,使药物定时、定量释放，实现高通量的药物筛选。

3.如权利要求1所述的微流扩散和开放介入的细胞培养阵列芯片，其特征在于，微流主通道（4）其流体进出口（7）处有集成微泵和微阀,用于实现化学物质的定时、定量注入。

4.如权利要求1所述的微流扩散和开放介入的细胞培养阵列芯片，其特征在于，构成细胞培养单元阵列的基片（5）其材料选自于聚合物聚二甲基硅氧烷PDMS，或热塑性材料聚甲基丙烯酸甲酯PMMA，或聚碳酸酯PC，或聚苯乙烯PS。

5.如权利要求1所述的微流扩散和开放介入的细胞培养阵列芯片，其特征在于，微流扩散通道（3）高度小于等于5微米，宽度小于等于5微米；微流主通道（4）高度小于等于200微米，宽度小于等于500微米；细胞培养单元（1）的直径大于等于0.2毫米,小于等于10毫米,高度小于等于8毫米。

6.如权利要求1所述的微流扩散和开放介入的细胞培养阵列芯片，其特征在于，所述的基底（2）其材料选自于玻璃片，或聚合物聚二甲基硅氧烷PDMS、或热塑性材料聚甲基丙烯酸甲酯PMMA、或聚碳酸酯PC、或聚苯乙烯PS制成的偏平片，或平底器皿。

7.如权利要求1所述的微流扩散和开放介入的细胞培养阵列芯片，其特征在于，所述的细胞培养单元阵列中植入有电的元器件，和/或磁的元器件，和/或光的元器件，或元器件组合芯片。

8.一种权利要求1所述微流扩散和开放介入的细胞培养阵列芯片的制作方法，其特征在于，包括如下步骤：

A、制作基片（5）：

1) 制作阳模：

先绘图并制作光学模板，包括微流主通道（4）和微流扩散通道（3）及细胞培养单元（1），并用不同颜色区分；然后用光学曝光和离子刻蚀的方法制作包括微流主通道（4）和微流扩散通道（3）的阳模；

2)模制成型基片： 

通过软光刻和热压印的方法复制阳模，制成具有微流主通道（4）和微流扩散通道（3）及具有细胞培养单元（1）相对位置标记的PDMS，或PMMA，或PC，或PS基片；

3)加工细胞培养单元（1）和流体进出口（7）：

通过微细加工机床定位打通基片上的各细胞培养单元（1）和相应流体进出口（7）；

B、键合基片（5）和基底（2）：

将具有微流主通道（4）和微流扩散通道（3）及细胞培养单元（1）的细胞培养单元阵列的基片（5）键合到基底（2）表面上。

9.一种权利要求1所述的微流扩散和开放介入的细胞培养阵列芯片在进行NIH3T3细胞培养中的应用方法，其特征在于，包括如下步骤： 

1)将制作好的细胞培养阵列芯片用灭菌锅进行高温灭菌；

2)在每个细胞培养单元（1）中注入一定量的纤维连接蛋白溶液进行表面修饰一定时间；

3)NIH3T3细胞培养于胎牛血清的DMEM培养液中，使用前震荡均匀并稀释到合适的浓度；

4)通过流体进出口（7）注入胎牛血清的DMEM培养液；

5)通过每个细胞培养单元（1）的上口（1.1）处植入细胞悬浮液；

6)在上述步骤完成过后过一定时间,通过注射泵向流体进出口（7）持续注入细胞培养液。

10.一种权利要求1所述的微流扩散和开放介入的细胞培养阵列芯片在进行免疫细胞化学染色对细胞进行表征的应用方法，其特征在于，包括如下步骤： 

1)待细胞在细胞培养阵列芯片中培养若干天后，用甲醛/磷酸盐缓冲溶液将每个细胞培养单元(1)中的细胞固定；

2)然后分别用聚乙二醇辛基苯基醚/磷酸盐缓冲溶液透化和牛血清蛋白溶液封闭；

3)固定好的细胞为显绿色荧光在一定浓度的异硫氰酸荧光素鬼笔环肽溶液中染色，为显红色荧光在一定浓度的碘化丙啶溶液中染色；

4)用磷酸盐缓冲溶液清洗后用共聚焦显微镜观察细胞核和细胞骨架。

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