CN111019828B - 一种开放式高通量微流控卵母细胞动态三维培养芯片及其应用 - Google Patents

一种开放式高通量微流控卵母细胞动态三维培养芯片及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生命科学与工程领域，具体涉及一种开放式高通量微流控卵母细胞动态三维培养芯片及其应用。所述芯片包括微流通道、在微流通道末端用于收集废液的腔体和圆柱腔体，所述圆柱腔体设置在微流通道上，其上端开口，下端与微流通道连通；所述微流通道包括通道入口部、树状结构扩散通道、与树状结构扩散通道连接的若干排微流直通道，所述圆柱腔体设置在各微流直通道上。本发明提供了一种开放式高通量微流控卵母细胞动态三维培养芯片，利用微流通道内的细胞培养液的流动给水凝胶中的细胞带来新鲜营养物质，同时也能带走代谢产物，通过圆柱腔体的上端开口使气体能直接渗透水凝胶满足细胞培养所需，实现了细胞的三维动态培养。

Description

一种开放式高通量微流控卵母细胞动态三维培养芯片及其 应用
技术领域
本发明属于生命科学与工程领域，具体涉及一种开放式高通量微流控卵母细胞动态三维培养芯片及其应用。
背景技术
在生命科学领域，模拟细胞在体内所处的动态三维环境是下游相关生物研究以及药物筛选等应用重要前提，同时这些应用往往需要高通量的技术来提高研究效率。传统的细胞培养往往是在细胞培养板上的二维培养，在培养过程中细胞由于缺乏基质支撑而直接与异质基底接触，因此细胞在三维方向上的行为特性无法展现并且会对细胞活性以及细胞的功能表达产生重要影响，同时这种培养方式培养液无法及时更新带来营养并排除代谢产物，因此随着生命科学研究的深入，动态的三维的细胞培养显得越来越重要。水凝胶作为一种生物亲和性材料其能够很好的模拟细胞外基质环境(ECM)，并且已经被广泛应用于细胞的三维培养，在提供细胞支撑的同时保证营养物质的传递，从而更加真实模拟体内的细胞环境。但是作为一种块状材料，水凝胶培养技术大多在细胞培养板上使用，在培养板中进行培养其培养液处于无法更新状态，细胞代谢废物无法及时被带走，而新鲜营养物质也无法及时得到补充，而且这种方式在进行不同实验条件时需要多个培养板同时进行培养，导致其效率低下。为了更加真实的模拟细胞在体内动态更新环境下的状态，在生物研究亟需引入一种能够在保证细胞三维环境的同时动态更新营养物和代谢物的新的细胞培养平台。
微流控技术是能够对流体进行精准动态控制，其能够动态更新在系统中的流体，特别适合用于细胞培养，另一方面是其能精准控制流体扩散，创造梯度药物浓度场，因此在药物筛选等需要高通量的场景中涌现了大量的应用。微流控平台运用于三维细胞培养时也有其自身缺陷，由于其封闭腔体和有限沟道高度(一般低于300微米)难以将水凝胶等生物三维包裹材料集成同时不限制液体流动，另一方面封闭的芯片无法允许气体透过，难以满足细胞生长所需的气氛条件。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，目的在于提供了一种开放式高通量微流控卵母细胞动态三维培养芯片及其应用。
为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案为：
一种开放式高通量微流控卵母细胞动态三维培养芯片，所述芯片包括微流通道、在微流通道末端用于收集废液的腔体和圆柱腔体，所述圆柱腔体设置在微流通道上，其上端开口，下端与微流通道连通。
上述方案中，所述微流通道包括通道入口部、树状结构扩散通道、与树状结构扩散通道连接的若干排微流直通道，所述圆柱腔体设置在各微流直通道上。
上述方案中，所述微流通道包括2个通道入口部、树状结构扩散通道、与树状结构扩散通道连接的6排微流直通道。
上述方案中，所述芯片的高度为5mm～10mm，所述用于收集废液的腔体为2cm×4cm，所述圆柱腔体的高度为5mm～10mm。
上述方案中，所述微流通道的沟道深度为5mm，各排微流直通道之间的间距为4mm～8mm，每排微流直通道上设置有6～10个圆柱腔体。
基于开放式高通量微流控卵母细胞动态三维培养芯片的应用，具体包括如下步骤：
(1)将海藻酸钠(SA)溶液调节pH至7.8，然后将从小鼠卵巢取得的卵母细胞放入其中，用注射器吸取备用；
(2)将氯化钙溶液调节pH至7.8，然后泵入到微流通道的通道入口部，由于重力和流体在微流沟道流动阻力作用，氯化钙溶液会充满整个微流通道，并且会在圆柱腔体内形成一段小液柱；
(3)将步骤(1)所准备包含卵母细胞的海藻酸钠溶液从圆柱腔体的上端开口处滴入，海藻酸钠溶液与氯化钙溶液接触，由于扩散作用，两者结合发生凝胶化，在圆柱腔体中形成一定高度的凝胶柱，而卵母细胞则被水凝胶三维支撑在中间不与基底接触；
(4)最后将卵母细胞培养液泵入到微流通道的通道入口部，由于微流通道中的氯化钙并未发生胶凝化，卵母细胞培养液的流入带走了微流通道中多余的氯化钙，并且当卵母细胞培养液流经圆柱腔体下端时其直接与凝胶层接触，从而实现物质的动态交换，同时，圆柱腔体的上端开口能与培养箱中的气体直接接触完成气体动态交换。
上述方案中，所述海藻酸钠的质量浓度为2％～4％，所述氯化钙溶液的质量浓度为1.5％～3％，所述卵母细胞的加入量为1～20个。
上述方案中，所述圆柱腔体中凝胶柱的高度为1mm～3mm。
上述方案中，所述通道入口部为2个时，将2种含不同药物组分或不同浓度的卵母细胞培养液分别泵入到2个通道入口部中，利用树状结构扩散通道在6排微流直通道中形成6种不同组分或不同浓度梯度的卵母细胞培养液。
本发明的有益效果：本发明提供了一种开放式高通量微流控卵母细胞动态三维培养芯片，结合水凝胶给予细胞三维支撑，通过圆柱腔体的下端与微流通道连接，利用微流通道内的细胞培养液的流动给水凝胶中的细胞带来新鲜营养物质，同时也能带走代谢产物，通过圆柱腔体的上端开口使气体能直接渗透水凝胶满足细胞培养所需，实现了细胞的三维动态培养，同时满足了体内三维环境、物质交换、气体氛围的条件以及高效率高通量的优势。本发明所述芯片还可以利用树状结构扩散通道产生不同浓度梯度的药物或者溶液浓度梯度，每条微流直通道中流过的液体浓度都不一样，使其可以运用于高通量的细胞培养场景。本发明所述芯片系统应用于卵母细胞三维培养，多个卵母细胞得以同时在不同的梯度药物场中培养，在培养一段时间后表现出很高活性，并保持良好功能，成功排出极体。本发明所述芯片系统能够很好地实现细胞地三维动态培养，同时又可以根据需求创造多种培养条件，使其面向实际需求，在未来的细胞生物研究中展现了巨大的应用前景。
附图说明
图1为本发明所述芯片的结构和原理示意图；其中(a)为芯片结构示意图；(b)为芯片应用时水凝胶及细胞培养液流动示意图；(c)为芯片装置实物图；(d)为芯片利用树状结构扩散通道产生的不同浓度梯度分布模拟图；
1-通道入口部1，2-通道入口部2，3-使用聚二甲基硅氧烷制作的微流通道，4-树状结构扩散通道，5-微流直通道，6-用于细胞培养的圆柱形腔体，7-用于存储废液的腔体，8-玻璃基底，9-三维包裹了细胞的水凝胶柱，10-下层培养液，11-实物装置图，12-模拟两个入口通入不同浓度药物时不同微流直通道内药物浓度分布。
图2为每个圆柱形腔体中细胞培养液与水凝胶三维共聚焦分布图；其中1～2为图中结构的侧视图，3为图中结构的俯视图，4为当只有罗丹明B的荧光被显示时拍摄的共聚焦荧光图，表明SA在圆柱形腔体中呈现圆柱状；
1-当海藻酸钠溶液(SA)使用罗丹明B染荧光(上层深色部分，红色荧光)，而细胞培养液用罗丹明6G染荧光(下层较亮色部分，绿色荧光)时，拍摄的共聚焦荧光图，其中水凝胶在上方呈圆柱状，而细胞培养液则分布在圆柱水凝胶下方，两者中间由于扩散两种荧光混合也呈现出了亮色。
图3为使用该芯片系统进行卵母细胞培养的细胞显微图，1-当卵母细胞刚被放入该芯片系统中时的显微图像；2为当卵母细胞使用该芯片系统进行培养一天，细胞保持活性和功能并成功排出极体的显微图像。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
实施例1
本发明中所描述的基于开放式高通量微流控芯片平台的卵母细胞三维培养技术创新型地使用了开放式的微流控芯片平台，并在该芯片系统中集成了用于细胞三维支撑的水凝胶，来保证细胞的三维动态培养，同时利用微流控技术的优势允许高通量的多种培养条件被同时应用，来大大提高效率。
该开放式高通量微流控芯片系统模型以及实物图如附图1所示，该芯片主要有三个部分，微流通道3、在微流通道末端用于收集废液的腔体7和圆柱腔体6。所述圆柱腔体6设置在微流通道上，其上端开口，下端与微流通道连通，所述微流通道包括通道入口部1、2，树状结构扩散通道4，与树状结构扩散通道连接的若干排微流直通道5，所述圆柱腔体6设置在各微流直通道5上。当两种不同配比的细胞培养液分别经两个通道入口部流入微流通道之后，利用树状结构扩散通道形成了后方六条微流直通道，在六条微流直通道中形成了不同成分和浓度的细胞培养液，创造了不同的培养条件。当细胞培养液与每个圆柱腔体下端的水凝胶接触时，由于水凝胶的多孔特性而允许物质的无阻碍扩散，将细胞培养液的营养物质带到细胞周围，而将细胞代谢产物带到下方微流直通道，并且随着培养液的液体流动而被带到后方收集废液腔体中。
本发明中微流通道是通过标准的紫外光刻技术制作而成，即首先使用软件绘制微流通道的形状，制作出掩模版。然后在硅片上使用匀胶机均匀甩一层厚度为200微米的光刻胶。烘干后将掩模版贴紧硅片，经过紫外曝光后，使用显影液洗掉未被曝光区域的光刻胶，而曝光区域由于硬化不会被洗掉而留下形成预期微流通道模板。最后再在其上浇注未凝固的PDMS，烘干脱模，再经过打孔切割即得到开放式高通量微流控芯片。本发明为了产生不同的浓度梯度，设计了一种基于树状结构扩散通道的微流通道，两种不同培养液通过注射器连接的针头分别注射进入微流通道的两个入口，并且通过注射泵控制其注射速度相同，这样情况下，在后方的六排微流直通道中将产生不同浓度分布的细胞培养液。根据浇注PDMS量差异，整个开放式高通量微流控芯片的高度也有差异，本实施例中芯片高度为5mm，每排微流直通道之间相距4mm，每排微流直通道上有六个开孔，开孔处与圆柱腔体联通，所述开孔内径为3mm，该孔使用内径为3mm的打孔器打孔得到，并且每个孔间距同样为4mm。在微流通道末端切割了一个2cm×4cm的腔体用于存储收集的废液。由于整个芯片高度为5mm，所以最终得到的微流通道和腔体高度的同样为5mm。
基于开放式高通量微流控芯片进行卵母细胞动态三维培养，具体包括如下步骤：(1)将2％的海藻酸钠(SA)使用tris-HCl来调节pH至7.8，然后将从小鼠卵巢取得的卵母细胞放入其中，用注射器吸取备用；(2)将1.5％的氯化钙溶液调节pH至7.8，然后泵入到微流通道的通道入口部，由于重力和流体在微流沟道流动阻力作用，氯化钙溶液会充满整个微流通道，并且会在圆柱腔体内形成一段约2mm的小液柱；(3)将步骤(1)所准备包含卵母细胞的海藻酸钠溶液从圆柱腔体的上端开口处滴入，海藻酸钠溶液与氯化钙溶液接触，由于扩散作用，两者结合发生凝胶化，在圆柱腔体中形成一定高度的凝胶柱，而卵母细胞则被水凝胶三维支撑在中间不与基底接触，满足了三维培养要求(如图2的三维图所示)；(4)最后将卵母细胞培养液泵入到微流通道的通道入口部1、2，其中从通道入口部2泵入的培养液含有一种对卵母细胞有伤害的药物，控制两个入口部液体泵入的流速一致(50微升每小时)，这样六条微流直通道中就含有不同浓度的药物，从而方便研究不同药物浓度对卵母细胞的影响。泵入细胞培养液过程中，由于微流通道中的氯化钙并未发生胶凝化，所以培养液液体得以顺利流过，细胞培养液的流入带走了微流通道中多余的氯化钙，并且当细胞培养液流经圆柱腔体下端时其直接与凝胶层接触，从而实现物质交换满足物质动态更新的要求，同时，圆柱腔体的上端开口能与培养箱中的气体直接接触发生气体交换，满足气体动态更新要求。
本实施例中，将上述基于开放式高通量微流控芯片放入二氧化碳细胞培养箱在恒定温度湿度以及气体条件下培养，并且使用微流泵持续稳定推入细胞培养液，并在第二天在显微镜下观察。如图2所示，水凝胶的引入允许细胞的三维培养，而开放式微流控芯片系统的引入则允许细胞环境(营养物质、代谢产物、气体)动态更新，同时也允许多种不同培养液条件下的高效同时培养。我们使用卵母细胞作为样本实例进行了培养验证，结果如图3所示，细胞被从卵巢取出后即放入该芯片系统培养，在经过一天培养后大部分成功排除第一极体，标志着该卵母细胞保持很高的活性同时正常地发挥其功能性。证明此系统和培养技术能够很好地满足细胞培养地需求，并且能够解决目前传统培养方式地弊端，并且大大提高了效率。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的实例，而并非对实施方式的限制。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而因此所引申的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种开放式高通量微流控三维芯片在卵母细胞三维培养中的应用，其特征在于，所述开放式高通量微流控三维芯片包括微流通道、在微流通道末端用于收集废液的腔体和圆柱腔体，所述圆柱腔体设置在微流通道上，其上端开口，下端与微流通道连通，所述微流通道包括通道入口部、树状结构扩散通道、与树状结构扩散通道连接的若干排微流直通道，所述圆柱腔体设置在各微流直通道上；所述芯片的高度为 5mm~10mm，所述用于收集废液的腔体为 2cm×4cm，所述圆柱腔体的高度为 5mm~10mm；所述微流通道的沟道深度为 5mm，各排微流直通道之间的间距为 4mm~8mm，每排微流直通道上设置有 6~10 个圆柱腔体；
所述卵母细胞三维培养的应用具体包括如下步骤：（1）将海藻酸钠（SA）溶液调节pH至7.8，然后将从小鼠卵巢取得的卵母细胞放入其中，用注射器吸取备用；（2）将氯化钙溶液调节 pH 至 7.8，然后泵入到微流通道的通道入口部，由于重力和流体在微流沟道流动阻力作用，氯化钙溶液会充满整个微流通道，并且会在圆柱腔体内形成一段小液柱；（3）将步骤（1）所准备包含卵母细胞的海藻酸钠溶液从圆柱腔体的上端开口处滴入，海藻酸钠溶液与氯化钙溶液接触，由于扩散作用，两者结合发生凝胶化，在圆柱腔体中形成1~3mm的凝胶柱，而卵母细胞则被水凝胶三维支撑在中间不与基底接触；（4）最后将卵母细胞培养液泵入到微流通道的通道入口部，由于微流通道中的氯化钙并未发生胶凝化，卵母细胞培养液的流入带走了微流通道中多余的氯化钙，并且当卵母细胞培养液流经圆柱腔体下端时其直接与凝胶层接触，从而实现物质的动态交换，同时，圆柱腔体的上端开口能与培养箱中的气体直接接触完成气体动态交换。
2.根据权利要求1 所述应用，其特征在于，所述海藻酸钠的质量浓度为 2%~4%，所述氯化钙溶液的质量浓度为1.5%~3%，所述卵母细胞的加入量为 1~20 个。
3.根据权利要求1 所述应用，其特征在于，所述通道入口部为 2 个时，将 2 种含不同药物组分或不同浓度的卵母细胞培养液分别泵入到 2 个通道入口部中，利用树状结构扩散通道在 6 排微流直通道中形成 6 种不同组分或不同浓度梯度的卵母细胞培养液。
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