CN104774756A - 一种基于sers检测技术的微流控药物筛选芯片及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于SERS检测技术的微流控药物筛选芯片及方法，本发明芯片包括4个基本功能单元：①药物加样单元、②细胞培养及检测单元1(SERS表征单元)、③细胞培养及检测单元2(荧光表征单元)、④细胞分泌物检测单元。所述细胞培养与检测单元1采用无标记SERS检测技术监测药物在细胞内的分布以及药物分子的代谢过程；所述细胞培养与检测单元2采用荧光检测技术表征细胞的存活率；所述细胞分泌物检测单元分别用微流控SERS基底和SERS免疫探针实现无标记和有标记的检测。整个芯片系统可从多个角度评价新型药物的安全性、有效性。

Description

一种基于SERS检测技术的微流控药物筛选芯片及方法

技术领域

本发明涉及光谱学和生物分析领域，具体涉及基于表面增强拉曼散射和微流控的药物筛选芯片的设计与应用方法。

背景技术

近年来，基于微加工技术的微流控芯片技术由于具有分析速度快、试剂消耗少、易于集成和高通量分析等诸多优点，成为近年来炙手可热的前沿分析技术之一，为研究药物活性中药物靶点的选择、药物筛选、临床前试验及剂量的确定等提供了新的平台。微流控芯片可将细胞的培养、分选、裂解以及药物效果检测等多个功能集成到一块芯片上，以流体和阵列多通道的形式缩短分析时间，在低耗量的状态下提供一个可以精确控制的细胞微环境，并可以实现单细胞水平的药效分析，具有效率高、成本低、操作简便等优点，为大规模高通量药物筛选提供了强有力的实验和检测技术平台。将微流控技术与细胞培养技术相结合,构建药物筛选的细胞微系统平台是目前的研究热点。

尽管如此，当前人们所研究的微流控药物筛选平台普遍存在输出指标单一、对药效的评估不够全面的问题,不能对药物的有效性、安全性进行综合评价，难以适应新型药物开发的需要。要了解细胞与药物相互作用的过程，就必须对药物的代谢，细胞内相关酶活性的变化，相关细胞分泌物含量的变化以及细胞自身的生理活性等多个参数进行同时监测。

微流控药物筛选平台中较为常用的检测手段包括荧光光谱、质谱、色谱分析和电化学检测。其中，质谱和色谱检测方法需要复杂的样品分离过程和昂贵的仪器；电化学检测方法芯片制作过程复杂、成本高、检测特异性不理想。因此，荧光光谱技术凭借其检测灵敏度高、速度快等优点成为目前最主要的检测手段。尽管如此，但它也存在谱峰较宽，不同荧光标记分子的发射谱易重叠的缺点，同时还易受到生物组织自身发出的荧光信号干扰等问题，难以满足高内涵药物筛选对多个参数同时监测的要求。此外，在已有的药物筛选微流控平台中，对于药物与细胞作用后自身的结构变化和细胞分泌物检测鲜少提及。因此，发展新的光谱表征手段实现多参数的大容量信息输出是微流控药物筛选芯片急需解决的问题。

作为另一种极具应用前景的光谱技术，表面增强拉曼散射光谱(Surface EnhancedRaman Scattering,SERS)能够提供丰富的物质结构信息，且SERS谱峰比荧光谱峰窄，能减小不同分子之间的谱峰重叠，因而在多元检测当中具有特有的优势。此外，利用拉曼光谱能够反映物质结构这一特性，还可以研究药物在代谢过程中分子结构所发生的变化，有助于从分子水平研究药物的作用机理，评价药物疗效。将SERS检测技术与微流控芯片相结合，对于高通量药物筛选具有重要意义。

发明内容

发明目的：为了克服现有技术中存在的不足，本发明提供一种基于SERS技术的药物筛选芯片，可以集成药物进样、细胞捕获、细胞培养、细胞检测等基本操作单元，利用SERS检测技术并结合荧光成像手段对药物与细胞相互作用过程中药物的代谢、细胞分泌物含量的变化以及细胞自身的生理活性等多个参数进行同时监测，从而实现对新型药物其安全性、有效性的全面评估。

技术方案：为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种基于SERS检测技术的微流控药物筛选芯片，包括4个单元：①药物加样单元、②SERS表征单元、③荧光表征单元、④细胞分泌物检测单元。

进一步的，在本发明中，所述药物加样单元采用“圣诞树”结构，形成不同浓度的单类药物的药液，或不同比例的两种及两种以上药物的混合药液。

进一步的，在本发明中，所述SERS表征单元采用大坝状的结构拦截细胞，所述细胞在固定区域内生长繁殖，用SERS纳米探针对细胞内药物的分布进行成像，并表征药物分子的结构变化。

进一步的，在本发明中，所述荧光表征单元采用大坝状的结构拦截细胞，所述细胞在固定区域内生长繁殖，用荧光指示剂对细胞的存活率进行监测。

进一步的，在本发明中，所述细胞分泌物检测单元采用无标记和有标记的两种SERS检测技术对细胞分泌物进行检测。

进一步的，在本发明中，所述无标记SERS检测通过微流控金属基底实现；所述有标记SERS检测通过“三明治”结构的液相免疫检测来实现。

进一步的，在本发明中，包括若干平行排列的SERS表征单元，监测细胞对不同类型药物刺激的响应。

进一步的，在本发明中，包括若干平行排列的荧光表征单元，监测细胞对不同类型药物刺激的响应。

进一步的，在本发明中，所述药物加样单元所加药物呈药液，所述4个单元之间通过横、纵两组空气微阀控制所述药液在各单元之间的流动。

一种基于SERS检测技术的微流控药物筛选芯片的方法，包括以下步骤：

1)细胞培养：采用大坝状的结构拦截细胞，所述细胞在固定的区域内生长、繁殖；

2)药物加样：采用“圣诞树”结构的两入口、多出口微流控通道，利用通道内层流和混流效应，从通道出口处收集到不同浓度的单类药物的药液，或两种及两种以上的不同比例的多类药物的混合药液；引入步骤1)培养所得细胞中；

3)SERS表征：用SERS纳米探针对细胞内药物的分布进行成像，并通过SERS光谱表征药物分子的结构变化；

4)荧光表征：引入荧光指示剂，对细胞进行荧光成像，监测细胞的存活率；

5)细胞分泌物检测：采用无标记或有标记的SERS检测技术对细胞分泌物进行检测。

有益效果：本发明提供的基于SERS检测技术的微流控药物筛选芯片及方法，与现有技术比较，具有以下优点：

1、从药物的代谢过程、细胞的存活率、细胞分泌物含量变化等多个方面综合评估药效，克服了单一指标评价的局限性；

2、整个药物筛选过程在一块微流控芯片上完成，具有简便、经济、高效的优点。

附图说明

图1为本发明微流控药物筛选芯片系统示意图；

图2为细胞内药物分子无标记SERS检测方法示意图；

图3为细胞分泌物有标记SERS检测方法示意图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作更进一步的说明。

如图1所示为一种基于SERS药物筛选芯片，包括4个单元：①药物加样单元、②SERS表征单元(即细胞培养及检测单元1)、③荧光表征单元(即细胞培养及检测单元2)、④细胞分泌物检测单元。

其中，优选的，药物加样单元采用“圣诞树”结构的两入口、多出口微流控通道，利用通道内层流和混流效应，两个入口分别通入药物1、缓冲液(或药物1、药物2)，从通道出口处收集到不同浓度的一组单类药物的药液1，或两种及两种以上的不同比例的多类药物的混合药液，如一组不同比例的药物1与药物2的混合药液。

细胞培养单元包括SERS表征单元即细胞培养及检测单元1和荧光表征单元即细胞培养及检测单元2，均采用大坝状的结构拦截细胞，将悬浮的细胞通入细胞培养单元中，细胞在运动的过程中被通道内的大坝状结构拦截并固定在特定区域内，定期更新培养液，使得细胞在固定区域内持续生长繁殖。

本发明芯片分别包括一组若干平行排列的SERS表征单元，和一组若干平行排列的荧光表征单元，监测细胞对不同类型药物刺激的响应。将药物加样单元得到的一组不同组分的药物溶液引入平行排列的一组细胞培养单元，监测细胞与药物的相互作用过程：SERS表征单元用金属SERS纳米探针对细胞内药物的分布进行拉曼成像，并通过SERS光谱表征药物与细胞作用前后分子的结构变化；荧光表征单元用特定的荧光指示剂对细胞进行荧光成像，对细胞的存活率进行监测及表征。

细胞分泌物检测单元可以采用无标记和有标记的两种SERS检测技术对细胞分泌物进行检测具体如下：

其中，无标记SERS检测通过微流控金属基底实现，利用制备具有高SERS活性的金属纳米粒子制备微流控金属基底，对细胞分泌物自身的SERS信号进行检测，监测细胞的药物响应过程；

有标记SERS检测通过“三明治”结构的液相免疫检测来实现，利用“三明治”结构免疫检测原理，制备SERS免疫探针和纳米磁球，在其表面修饰能够识别细胞分泌物的抗体，捕获待测的细胞分泌物，借助抗体与抗原之间的特异性识别作用和SERS免疫探针定量分析细胞分泌物的含量的变化，借助于磁性分离，定量检测其含量。

本发明的芯片其各模块单元之间通过横、纵两组空气微阀控制药液在各单元之间的流动，芯片通道分为流体层和空气层，通过给空气层施压、减压来控制流体通道的流通与断开。

利用本发明微流控药物筛选芯片监测细胞与药物的相互作用过程，分析细胞的药物响应过程，对新型药物的安全性、有效性进行综合评估。

实施例

如图1所示，一种基于SERS技术的肝癌药物筛选芯片的方法，包括以下步骤：

1)微流控SERS基底的制备：用柠檬酸钠还原硝酸银的方法制备银纳米粒子，用物理或化学方法将其修饰在微流控通道内表面得到SERS基底；

2)SERS免疫探针的制备：所述银纳米粒子表面用物理或化学方法修饰拉曼分子和抗体，使得探针能够激发出SERS信号，并特异性识别肝癌细胞分泌物；

3)免疫磁球的制备：用化学方法制备磁性纳米粒子并在其表面用物理或化学方法修饰上特定种类的抗体，以识别肝癌细胞分泌物；

4)细胞培养：将肝癌细胞的悬浮液通入所述两组细胞培养与检测单元中，肝癌细胞被通道内的大坝结构拦截并在固定的区域内生长繁殖；每隔6-12小时更新培养液以保持细胞的生理活性；

5)药物刺激细胞：将抗肝癌的药物(如香柑内酯)和缓冲液分别注入药物加样单元的两个入口，得到一组不同浓度的药物溶液，并引入相应的细胞培养单元中；

6)细胞与药物相互作用的SERS检测：如图2所示，将银纳米粒子引入细胞培养单元，并通过细胞的内吞作用进入细胞，激光作用下，银纳米粒子作为SERS探针检测药物的SERS信号，借助SERS成像监测药物在细胞内的分布，同时通过SERS光谱检测药物分子在代谢前后分子结构的变化；

7)细胞与药物相互作用的荧光检测：将荧光指示剂引入细胞培养单元，通过荧光成像检测细胞在药物作用前后的存活率；

8)细胞分泌物的SERS检测：将细胞分泌物分别引入微流控金属基底与微流控免疫基底；一方面，在微流控SERS基底上用无标记光学检测的方法直接检测分泌物的拉曼光谱；另一方面，如图3所示，首先进行SERS纳米探针和免疫磁球进样，借助免疫磁球，利用抗体与肝癌细胞分泌物(如白蛋白)的特异性结合作用，进行免疫反应，利用磁性物质进行磁性分离，捕获细胞分泌物，并引入SERS纳米探针构成“三明治”结构实现有标记的SERS检测。

本实施例所用药物筛选芯片使用过程中样品、反应试剂等的引入均通过空气微阀和注射泵来控制。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种基于SERS检测技术的微流控药物筛选芯片，其特征在于：包括4个单元：①药物加样单元、②SERS表征单元、③荧光表征单元、④细胞分泌物检测单元。

2.根据权利要求1所述的基于SERS检测技术的微流控药物筛选芯片，其特征在于：所述药物加样单元采用“圣诞树”结构，形成不同浓度的单类药物的药液，或不同比例的两种及两种以上药物的混合药液。

3.根据权利要求1所述的基于SERS检测技术的微流控药物筛选芯片，其特征在于：所述SERS表征单元采用大坝状的结构拦截细胞，所述细胞在固定区域内生长繁殖，用SERS纳米探针对细胞内药物的分布进行成像，并表征药物分子的结构变化。

4.根据权利要求1所述的基于SERS检测技术的微流控药物筛选芯片，其特征在于：所述荧光表征单元采用大坝状的结构拦截细胞，所述细胞在固定区域内生长繁殖，用荧光指示剂对细胞的存活率进行监测。

5.根据权利要求1所述的基于SERS检测技术的微流控药物筛选芯片，其特征在于：所述细胞分泌物检测单元采用无标记和有标记的两种SERS检测技术对细胞分泌物进行检测。

6.根据权利要求5所述的基于SERS检测技术的微流控药物筛选芯片，其特征在于：所述无标记SERS检测通过微流控金属基底实现；所述有标记SERS检测通过“三明治”结构的液相免疫检测来实现。

7.根据权利要求1－6任一所述的基于SERS检测技术的微流控药物筛选芯片，其特征在于：包括若干平行排列的SERS表征单元，监测细胞对不同类型药物刺激的响应。

8.根据权利要求1－6任一所述的基于SERS检测技术的微流控药物筛选芯片，其特征在于：包括若干平行排列的荧光表征单元，监测细胞对不同类型药物刺激的响应。

9.根据权利要求1－6任一所述的基于SERS检测技术的微流控药物筛选芯片，其特征在于：所述药物加样单元所加药物呈药液，所述4个单元之间通过横、纵两组空气微阀控制所述药液在各单元之间的流动。

10.一种基于SERS检测技术的微流控药物筛选芯片的方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)细胞培养：采用大坝状的结构拦截细胞，所述细胞在固定的区域内生长、繁殖；

2)药物加样：采用“圣诞树”结构的两入口、多出口微流控通道，利用通道内层流和混流效应，从通道出口处收集到不同浓度的单类药物的药液，或两种及两种以上的不同比例的多类药物的混合药液；引入步骤1)制备所得细胞中；

3)SERS表征：用SERS纳米探针对细胞内药物的分布进行成像，并通过SERS光谱表征药物分子的结构变化；

4)荧光表征：引入荧光指示剂，对细胞进行荧光成像，监测细胞的存活率；

5)细胞分泌物检测：采用无标记或有标记的SERS检测技术对细胞分泌物进行检测。