CN101275114A - 一种微流细胞培养阵列及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种微流细胞(微生物)培养阵列,其包括一个或多个微流细胞培养阵列单元,所述微流细胞培养阵列单元包括主沟道以及若干个与主沟道相连通的细胞培养单元,每个培养单元包含一扩散沟道和细胞培养室,细胞培养室通过扩散沟道与主沟道相连通。本发明微流细胞(微生物)阵列不仅能够实现单细胞分离培养,而且在更换培养液或其它试剂的时候细胞始终处于零流速状态,这为细胞的培养和观测特别是非贴壁细胞的培养和观测带来了极大的便利,非常适用于基于细胞表型的高通量药物筛选的研究工作。
Description
技术领域
本发明属于微流控技术与细胞生物学领域,具体地,涉及一种适于细胞或微生物微环境培养的微流控芯片装置。
背景技术
微流控芯片(Microfluidic chip)最初起源于分析化学领域,是一种采用精细加工技术,在数平方厘米的基片,制作出微通道网络结构及其它功能单元,以实现集微量样品制备、进样、反应、分离及检测于一体的快速、高效、低耗的微型分析实验装置。
微流控芯片技术用于细胞培养及其生化分析已引起较广泛的关注,如细胞操作,绿色荧光蛋白的表达,基因转染,细胞活性测试,细胞分离,细胞内钙离子的测量,激素分泌监测以及高通量的细胞含量分析等。自从Harrison等人首次在微流控芯片上对细胞进行操纵及传输试验后,Yang等人用微流控芯片研究细胞群体的排列行为,并用荧光检测其摄取钙离子的反应情况。
采用微流控芯片进行细胞培养能够精确控制培养环境,便于生化分析。前面的工作中报道了很多用化学的图形以及物理的固定选择性将细胞连接在表面上的方法。这些方法虽然很有用,但是它们需要特别的表面处理,同时需要复杂的微加工工艺或者操作,使得在微流体系的细胞阵列不能广泛地为生物学家所使用。而且这些方法,主要通过流体在细胞周围的流动来实现对细胞营养的供给,细胞会处于一定的流速之下,这对部分非贴壁细胞的培养和观测都会带来不便。同时它们也不能对细胞长时间的生长进行很好的观测。
总体来说,微流相关研究在国际上才刚刚起步,一方面研究比较初步,实验不够丰富;另一方面偏重实验室阶段的探索,离应用尚有较大距离。
发明内容
本发明的目的在于针对上述不足提供一种微流细胞(微生物)培养阵列,用于细胞的培养及分析。
本发明的另一目的在于提供使用上述微流细胞(微生物)培养阵列的细胞(微生物)培养方法。
本发明微流细胞(微生物)培养阵列包括一个或多个微流细胞(微生物)培养阵列单元,所述微流细胞(微生物)培养阵列单元包括主沟道以及若干个与主沟道相连通的细胞培养单元,每个培养单元包含一段扩散沟道与细胞培养室,细胞培养室通过扩散沟道与主沟道相连通。
当微流细胞(微生物)培养阵列由多个微流细胞(微生物)培养阵列单元构成时,可用一总沟道分别与各个主沟道的一端相连通。
上述细胞培养单元优选分布在主沟道的两侧。细胞培养室可以呈多种形状,优选为三角形,其一顶点通过扩散沟与主沟道连通。扩散沟道截面积比细胞培养室截面积小,优选扩散沟道截面积小于细胞培养室截面积的20%,但允许细胞通过,细胞培养室的高度优选不超过细胞线度的1.5倍。本领域技术人员应能理解,这里所述的截面积是指扩散沟道的宽与高之积,细胞培养室的截面积亦是指其宽与高之积。本领域技术人员也很容易理解,对于不同形状的扩散沟道,这里的截面积是指最小截面积,对于不同形状的细胞培养室,这里的截面积是指最大截面积。
本发明微流细胞(微生物)培养阵列的材料优选采用PDMS(聚二甲基硅氧烷)以及玻片,其中玻片作为基片,PDMS作为盖片。
本发明进一步提供利用微流细胞(微生物)培养阵列的细胞(微生物)培养实现方法:
(1)将芯片置于真空环境去气若干分钟;
(2)将细胞悬液震荡均匀后注射入主沟道,由于PDMS材料特殊的可吸收气体以及透过气体的特性,细胞溶液自动被吸收入细胞(微生物)培养室,当细胞培养室被液体填充完成,细胞培养室内液体流速降为零;
(3)换液操作:通过更替主沟道的液体实现去除主沟道的细胞溶液并实现对细胞培养室内细胞(微生物)的环境更替。
本发明微流细胞(微生物)培养阵列利用扩散的方式实现培养室营养液(试剂)的替换,在替换营养液(试剂)时营养液(试剂)在主沟道中流过,营养物质物(试剂)通过扩散实现培养室的营养(化学物质)的更替,而细胞(微生物)处于零流速的状态。
本发明能够实现细胞培养室的单细胞分布,而布置时间只需一分钟左右。改变主沟道溶液,通过扩散可以十分方便的在一分钟左右更替培养室内的营养,而细胞仍能处于零流速的状态。由于培养室厚度的限制细胞为单层生长,使得显微观测十分的方便。
本发明微流细胞培养阵列,将在细胞生物学,特别药物筛选中发挥巨大的作用。
附图说明
图1本发明微流控细胞(微生物)培养阵列示意图之一;
图2本发明微流控细胞(微生物)培养阵列示意图之二;
图3利用吸气方法布置的酵母细胞微腔体阵列,其中a为酵母细胞溶液被自动吸入细胞培养单元的显微时序图;b为细胞培养室被布置上细胞的显微图像;c为进液的酵母细胞密度为3*107细胞/ml时,100个细胞培养单元被布置上的细胞数量分布;d为进液的酵母细胞密度为107细胞/ml时,100个细胞培养单元被布置上的细胞数量分布;
图4酵母细胞在微腔体中单层生长,箭头所指处为酵母细胞;
图5并行的观测酵母细胞在不同铜离子浓度下的表型。
图中,1为主沟道,2为细胞培养室,3为扩散沟道,4为细胞培养单元,5为总沟道。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容,但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下,对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换,均属于本发明的范围。
若未特别指明,实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1 微流控细胞(微生物)培养阵列
如图1所示,主沟道1宽度为100微米,细胞培养室2为边长125微米的等边三角,三角形顶点处通过一段20微米宽、20微米长的扩散沟道3与主沟道1相连,主沟道1、培养室2、扩散沟道3的高度均为6微米。细胞培养室2与扩散沟道3构成细胞培养单元4,若干个重复排列的细胞培养单元4分列在主沟道1的两侧,构成了微流控细胞(微生物)培养阵列的基本单元,由一个或多个上述微流控细胞(微生物)培养阵列单元构成本发明微流控细胞(微生物)培养阵列。图2中所示的是有7个微流控细胞(微生物)培养阵列单元构成的微流控细胞(微生物)培养阵列,在图2中7个微流控细胞(微生物)培养阵列单元同一端的主沟道与总沟道5相连,A为装载细胞的入口,B为替换溶液的入口,这样可以在A端同时对七条主沟道的培养室布置上同一种群的酵母细胞,从B端给七条道不同的培养环境以作平行对照,对每一种培养环境有足够数量的细胞以作统计。当然,从A端或B装载细胞或替换溶液并不受此限制。
在本例中,微流控细胞(微生物)培养阵列的基片为玻片,盖片为PDMS。芯片的制作可采用下述方法:
在干净的硅片上按照设计的模板采用软光刻的方法(Y.N.Xia andG.M.Whitesides,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.,1998,37,5,550-575.Luo,C.X.,Fu,Q.,Li,H.,Xu,L.P.et al.,Lab Chip 2005,5,726-729.)制得高度为6微米的模具,并用液态的PDMS(A∶B=10∶1,A:聚二甲基硅氧烷单体,B:相应的交联剂;购自GE公司,产品型号为RTV615)倒在模具上,PDMS的高度大约为5mm,在80度烘箱中30分钟使得PDMS固化。切下后在相应的入口和出口处钻孔后,将PDMS与清洁好的玻片粘和,从而形成芯片。
实施例2 单细胞培养观察
本例中使用实施例1的微流控细胞(微生物)培养阵列(图1)对酵母细胞进行单细胞培养观测。
具体方法:
(1)将酵母细胞培养于YPG培养液中,使用前震荡均匀并稀释到合适的浓度,浓度大约为107细胞/ml。
(2)取芯片放于真空环境10分钟左右,将菌从入口注入,推速为20微升/小时。如图3,酵母细胞会被自动吸入细胞培养单元(图3a),当细胞培养单元被溶液占满(图3b),可用培养液将主沟道的细胞溶液冲走,对酵母细胞进行培养,如图4。
研究表明,通过上述方法操作,酵母细胞溶液被自动吸入细胞培养室中(图3a),可以实现单细胞的分离,并且布置细胞的操作可在一分钟内完成;当当细胞室充满培养液时,主沟道的流过的液体不会对细胞培养室产生直接影响,细胞培养室中的细胞基本处于零流速状态(图3b)。当进液的酵母细胞密度为3*107细胞/ml时,约35%的细胞培养室被布置上单个细胞(图3c)。当进液的酵母细胞密度为107细胞/ml时,约45%的细胞室被布置上单个细胞。
实施例3 环境变化对细胞表型的影响观察
本例中使用实施例1的微流控细胞(微生物)培养阵列(图2)对酵母细胞在不同培养环境的生长进行观测以及统计。
具体方法:
(1)将包含铜离子诱导绿色荧光蛋白的酵母细胞培养于YPG培养液中,使用前震荡均匀并稀释到合适的浓度,浓度大约为107细胞/ml。
(2)取芯片放于真空环境10分钟左右,将菌从A入口注入,推速为40微升/小时,使得七条细胞培养道中的培养室都被填充满菌液。
(3)从b入口1到7通道分别通入含有不同铜离子浓度的培养液,铜离子浓度分别为0;0.2;0.4;0.6;1;1.5;2mM。细胞培养温度控制在30摄氏度。实验中观测每条通道中含有单细胞的30个培养室,每15分钟利用X-Y自动平移平台扫描一次芯片记录并一次显微图,总实验时间为20小时,在20小时结束时,扫描一次芯片的荧光数据。分析各个通道的酵母细胞的分裂周期以及荧光数据与对应铜离子浓度的关系并绘制图5。
结果表明:a、铜离子的加入影响了细胞的分裂,当铜离子浓度逐渐增加时,细胞分裂周期显著延长;b、铜离子浓度对绿色荧光蛋白的诱导量呈正相关,但当铜离子浓度超过1mM时,其对绿色荧光蛋白的诱导表达没有显著变化。
Claims (10)
1、一种微流细胞培养阵列,其包括一个或多个微流细胞培养阵列单元,所述微流细胞培养阵列单元包括主沟道以及若干个与主沟道相连通的细胞培养单元,每个培养单元包含一扩散沟道和细胞培养室,细胞培养室通过扩散沟道与主沟道相连通。
2、如权利要求1所述的微流细胞培养阵列,其由多个微流细胞培养阵列单元构成,且阵列一侧具有分别与各个主沟道的一端相连通的总沟道。
3、如权利要求1或2所述的微流细胞培养阵列,其特征在于,细胞培养单元分布在主沟道的两侧。
4、如权利要求1或2所述的微流细胞培养阵列,其特征在于,扩散沟道截面积比细胞培养室截面积小。
5、如权利要求4所述的微流细胞培养阵列,其特征在于,扩散沟道截面积小于细胞培养室截面积的20%。
6、如权利要求1或2所述的微流细胞培养阵列,其特征在于,细胞培养室的高度不超过细胞线度的1.5倍。
7、如权利要求1或2所述的微流细胞培养阵列,其特征在于,细胞培养室呈三角形,其一顶点通过扩散沟与主沟道相连通。
8、如权利要求1或2所述的微流细胞培养阵列,其特征在于,其由基片和粘在其上的盖片构成,所述基片为玻片,所述盖片由PDMS制成。
9、权利要求1~8任一项所述微流细胞培养阵列在细胞培养和/或分析中的应用,特别是在药物筛选中的应用。
10、一种利用权利要求1~8任一项所述的微流细胞培养阵列培养细胞的方法:
(1)将权利要求1~8任一项所述的微流细胞培养阵列置于真空环境去气若干分钟;
(2)将细胞悬液震荡均匀后注射入主沟道,使细胞悬液充满微流细胞培养阵列;
(3)在培养过程中,更替主沟道的液体。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Open date: 20081001 |