CN111534454A - 一种基于pdms微孔阵列芯片的细菌分离培养方法 - Google Patents

一种基于pdms微孔阵列芯片的细菌分离培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于PDMS微孔阵列芯片的细菌分离培养方法，在PDMS微孔阵列芯片上设置直径为140‑160μm、深度为30‑50μm的圆柱形微孔，且任意相邻的两个微孔的圆心距离为250‑350μm；芯片经预处理后，将细菌密度为102‑104个/ml的样品溶液滴加芯片上，使样品溶液覆盖、填满所有微孔，倾斜芯片去除其表面残留的溶液；然后将芯片有微孔的一面倒扣在琼脂培养基上，进行细菌分离培养，最后揭除芯片进行挑菌鉴定。本发明方法可以一步地高效地分离样品溶液中的单细菌，避免了培养时的优势菌株干扰，适用于各类细菌分离培养，大大提高了细菌分离的效率，实现了高通量的单细菌分离。

Description

一种基于PDMS微孔阵列芯片的细菌分离培养方法
技术领域
本发明涉及微孔阵列芯片和细菌检测技术领域，尤其涉及一种基于PDMS微孔阵列芯片的细菌分离培养方法。
背景技术
细菌作为生物界中数量最多的一类，在自然界中大都是混杂地生活在一起，细菌的分离是指从这些混杂的微生物群体中获取某一种细菌的过程。细菌的分离培养对于人类认识病原菌、开发利用细菌资源、了解生命起源等都具有非常重大的意义。传统的细菌分离一般是在选择性的琼脂培养基上进行的，通常使用稀释或者划线的方法将混合细菌尽可能地以单细菌的方式分散到固体培养基上进行培养；培养后固体培养基上就可以形成肉眼可见的菌落，然后从菌落中挑取细菌在显微镜下进行观察，证明其为单一形态的菌体；最后进行鉴定、扩大培养及保藏。
但是，在传统的细菌分离培养研究中，通过一次性的平板划线等方法很难得到理想的结果，特别是对于一些菌群组成成分复杂的样品，需要经过多次的分离培养。反复多次的不同种类培养基的筛选和培养对于人力和物力的投入都有很高的要求，而且多次的分离培养过程也大大增加了分离培养过程中杂菌污染出现的概率。另外，一些样品中可能还会存在具有生长优势的菌株，比如数量优势或者生长适应优势等，这也将会导致一些特定菌株难以分离培养。
微流控芯片因具有体积小、比表面积大、试剂和样品用量少、反应时间短、分析速度快、灵敏度高、易集成化及自动化等优点，在分析处理细菌样品时具有独特优势，非常适用于微生物的各类操作和处理，其高通量的特点可以大大削减人力成本的投入，提高细菌分离的效率，加快相关研究的进程。但现有的微流控芯片一般是通过设计复杂的芯片结构，来精准地控制样品在芯片上的分布或者流动等，从而实现对目标菌种的分离和培养，这从技术和操作层面大大限制了微流控芯片在细菌分离培养中的推广应用。
此外，在细菌的分离培养研究中，单菌株的培养和保藏是最终目的，当实现了细菌的分离且培养长出单菌落之后，还需要将单菌落挑出进行鉴定和扩大培养或者保藏。在现有的利用微流控技术进行细菌分离培养的研究中，有些研究是通过在基底表面构建亲疏水阵列的方式进行细菌的分离。这种亲疏水阵列的制备方式非常的繁琐和精细，需要投入很大的精力和物力去制备。其次，大多数亲疏水阵列所选用的基底材料都是不透气的玻璃等，当将在亲疏水阵列上的单细菌倒扣到琼脂培养基上进行培养时，玻璃基底的不透气性将严格限制了分离的细菌的种类。在有些研究中会直接将形成细菌阵列置于各种油内进行培养，但对于细菌阵列而言，单个液滴里面的营养物质是有限的，由于油相的隔离营养物质得不到补充，难以进行长时间的培养；同时油相在确保细菌液滴减少挥发的同时，也阻碍了气体的传播，因此也不利于某些好氧菌的分离培养。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种基于PDMS微孔阵列芯片的细菌分离培养方法，利用微流控技术，设计了简单的PDMS微孔阵列芯片，结合特定密度的样本，通过对流体的控制，可以一步地高效地分离样品溶液中的单细菌，避免了优势菌株干扰，适用于各类细菌分离培养，大大提高了细菌分离的效率，实现了高通量的单细菌分离，削减了人力成本的投入。
本发明的目的采用如下技术方案实现：
一种基于PDMS微孔阵列芯片的细菌分离培养方法，包括以下步骤：
(1)芯片预处理：将PDMS微孔阵列芯片经灭菌处理后，在真空干燥箱进行处理；所述PDMS微孔阵列芯片上设置有直径为140-160μm、深度为30-50μm的圆柱形微孔，且任意相邻的两个微孔的圆心距离为250-350μm；
(2)细菌分离：将细菌密度为102-104个/ml的样品溶液滴加到真空预处理后的PDMS微孔阵列芯片上，使样品溶液覆盖所有微孔；待样品溶液填满所有微孔后，倾斜PDMS微孔阵列芯片去除芯片表面残留的样品溶液；
(3)细菌培养：将经步骤(2)处理后的PDMS微孔阵列芯片倒扣在琼脂培养基上，使设置有微孔的一面与琼脂培养基接触连接，进行细菌培养，然后揭除芯片进行挑菌鉴定。
优选地，所述微孔的直径为150μm、深度为40μm，且任意相邻的两个微孔的圆心距离为300μm。
进一步地，步骤(2)中，所述真空干燥箱的处理条件为：真空度为-980mbar，处理时间为30-40min。
优选地，所述样品溶液中细菌的密度为103个/ml。
若所需分离的细菌是厌氧菌，则步骤(2)和(3)在厌氧培养箱内进行。
所述PDMS微孔阵列芯片是通过以下方法制备的：
(1)根据微孔阵列芯片的结构制备光刻模板，然后以单晶硅作为基底进行光刻，制备得到具有微柱结构的硅片模板；
(2)采用氟硅烷对步骤(1)得到的硅片模板进行处理；
(3)将PDMS预聚体和固化剂混匀后进行脱气处理，然后倾倒在步骤(2)处理后的硅片模板上，控制PDMS预聚体和固化剂混合物的厚度为4-6mm；
(4)将步骤(3)处理后的硅胶模板在60-70℃下固化处理3-5h，冷却后将PDMS从硅片模板上剥离下来，即得所述PDMS微孔阵列芯片。
优选地，步骤(1)中，所述光刻时采用的光刻胶为Microchem SU 8-2025，所述光刻胶的厚度为40μm。
所述PDMS预聚体和固化剂的质量比为10:1。
所述PDMS预聚体和固化剂混合物的厚度为5mm。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
1、本发明方法利用微流控技术结合对流体的控制，简单高效地将混合细菌分离成为一个个独立的单细菌，进而实现一步地、高效地分离样品溶液中单细菌的目的。本发明设计了特殊结构的聚二甲基硅氧烷(PDMS)微孔阵列芯片，然后通过控制样品溶液中细菌的密度，来调节微孔中细菌的数目，当细菌密度维持在较低水平时，可确保实现单细菌的分离培养，从而大大提高了细菌分离的效率，实现了高通量的单细菌分离。同时，由于实现了单细菌的分离，避免了培养时优势菌株干扰的情况，这也极大地有利于传统培养组学中难以分离培养的菌株的分离培养，为新菌株的发现创造了条件。
2、本发明采用的PDMS具有独特的化学物理性质，透气性好，具有较低的可控的杨氏模量，有利于细菌的正常增殖；芯片对各类细菌的培养都比较友好，具有适用于各类细菌分离培养的潜力。PDMS微孔阵列芯片和琼脂培养基的培养模式也确保了细菌在增殖过程中对营养物质以及生长空间的需求，当PDMS微孔阵列芯片分离出的单细菌长到一定程度形成单菌落时，可直接揭除芯片进行挑菌；通过控制细菌的增殖时间，菌落的大小可以得到控制，使其可以长到肉眼可见的尺寸，相比于现有的基于微流控技术的分离培养模式，本发明提供了方便简单的挑菌方法，能够让操作者更方便地进行肉眼挑菌，这将极大地降低实验的成本及提高实验的效率。
附图说明
图1为本发明PDMS微孔阵列芯片用于细菌分离培养的流程图；
图2为实施例1细菌密度为105个/ml时大肠杆菌分离后的激光扫描共聚焦显微镜图；
图3为实施例1细菌密度为104个/ml时大肠杆菌分离后的激光扫描共聚焦显微镜图；
图4为实施例1细菌密度为103个/ml时大肠杆菌分离、培养后的激光扫描共聚焦显微镜图；
图5为实施例1细菌密度为105个/ml时大肠杆菌分离、培养后的激光扫描共聚焦显微镜图；
图6为实施例2分离、培养后的大肠杆菌的菌落图片；
图7为实施例3分离、培养后的混合菌的菌落图片；图中：a、粪肠球菌；b、坚强芽孢杆菌；c、金黄色葡萄球菌。
具体实施方式
下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。
一种基于PDMS微孔阵列芯片的细菌分离培养方法，如图1所示，包括以下步骤：
(1)设计微孔阵列芯片结构，在PDMS微孔阵列芯片上设置直径为140-160μm、深度为30-50μm的圆柱形微孔，且任意相邻的两个微孔的圆心距离为250-350μm，微孔的数目可根据需求进行控制；
(2)芯片预处理：将步骤(1)的PDMS微孔阵列芯片经灭菌处理后，置于真空干燥箱中，于室温、真空度-980mbar下脱气处理30-40min；
(3)细菌分离：将细菌密度为102-104个/ml的样品溶液滴加到步骤(2)处理后的PDMS微孔阵列芯片上，使样品溶液覆盖所有微孔，完成上样；待样品溶液填满所有微孔后，倾斜PDMS微孔阵列芯片去除芯片表面残留的样品溶液，形成微液滴阵列；
(4)细菌培养：将经步骤(3)处理后的PDMS微孔阵列芯片倒扣到固体琼脂培养基上，使设置有微孔的一面与琼脂培养基接触连接，进行细菌培养，然后揭除芯片进行挑菌鉴定。
本发明在利用PDMS微孔阵列芯片进行细菌分离时，微孔中的细菌的数目可以通过样品溶液中细菌的密度进行控制。细菌的密度情况首先决定了微孔中出现单细菌的比例，如果密度太高则微孔中出现多个细菌的概率增加。为了确保能够进行单细菌的分离培养，样品溶液的细菌密度需维持在较低水平。当密度较低时，可以保证大部分微孔中是单细菌，此时可通过进一步控制密度来控制有细菌的微孔的比例。如果该比例过高，则容易出现临近的微孔都有细菌的情况，在菌株长大过程中，易产生交叉污染；若密度太低，则会导致大部分微孔中是空的，降低了分离效率。在保证分离效率的情况下，为了保证微孔中是单细菌，且有单细菌的微孔之间距离合适以排除交叉污染，本发明优选样品溶液中细菌的密度为103个/ml。
实际使用过程中细菌溶液的密度可进行优化调整，在满足泊松分布的情况下，可以保证大多数微孔中细菌数目是0或者1。细菌分离后，如果在显微镜下挑菌扩大培养，细菌密度可以按照泊松分布情况来确定；如果需培养菌落一段时间后再进行挑菌，则应适当降低细菌密度，避免菌落生长过程中交叉污染的产生。本发明采用的是物理分离，不受细菌本身的性质限制；而且本发明芯片的微孔相比于细菌的体积而言非常大，细菌间体积的差别影响几乎忽略不计。因此，针对不同种类的细菌，该平台都可以较好地进行分离。
上述PDMS微孔阵列芯片是通过以下方法制备的，如图1所示，包括以下步骤：
1)根据微孔阵列芯片的结构制备光刻模板，然后以单晶硅作为基底，选用Microchem SU 8-2025作为光刻胶进行光刻，匀胶厚度为40μm，光刻结束后得到具有微柱结构的硅片模板；
2)采用氟硅烷对步骤1)得到的硅片模板进行处理，以便于PDMS的剥离；具体包括以下步骤：在室温下，将上述硅片模板和敞口的、装有氟硅烷试剂的离心管置于密封的、-980mbar的真空干燥箱中处理4-6小时；
3)将PDMS预聚体和固化剂按照质量比10:1混匀后，进行脱气处理，除去气泡；然后将混合液倾倒在步骤2)处理后的硅片模板上，控制PDMS预聚体和固化剂混合物的厚度为4-6mm；
4)将步骤3)处理后的硅胶模板在60-70℃下固化处理3-5h，冷却后将PDMS从硅片模板上剥离下来，即得PDMS微孔阵列芯片。
本发明采用PDMS被用作微孔芯片的材料。PDMS是微流控技术中广泛使用的一种廉价、无毒、生物相容性高的材料，PDMS表面的微结构可以通过光刻技术及软刻蚀技术进行制备。PDMS透气性好，这样通过对PDMS芯片进行脱气处理可以使得样品溶液克服液体表面张力进入到体积极小的微孔内，进而使样品溶液中的细菌有机会进入到芯片的微孔当中。另外，PDMS材料本身是疏水的，当稍微倾斜芯片时，芯片表面的样品溶液很容易沿着倾斜角流下去，而微孔内的溶液由于表面张力的原因会被留在微孔内。因此，利用PDMS材料本身的透气性及疏水性就可以简单地一次性将细菌分散到各个微孔中，从而实现细菌的分离。
本发明的PDMS微孔阵列芯片有利于细菌的正常增殖：PDMS以其透气性和较低的可控的杨氏模量有利于细菌的正常增殖。本发明PDMS微孔阵列芯片在进行单细菌的分离后，直接倒扣到琼脂培养基上进行培养。对于好氧菌，PDMS的透气性可以保证氧气源源不断的供应；对于厌氧菌，在进行单细菌分离前，PDMS微孔阵列芯片已经在真空干燥箱中做了长时间的脱气处理，并且后面的操作都在厌氧培养箱中进行。因此PDMS微孔阵列芯片重新吸气时也只会吸收厌氧培养箱中的气体而无氧气干扰。PDMS微孔阵列芯片还确保了菌落向外扩张的能力，使其可以长到肉眼可见的尺寸；而在亲疏水阵列芯片中，油相严格限制了菌落的边界，因此一般需要在显微镜下观察和挑菌。
实施例1
基于PDMS微孔阵列芯片的大肠杆菌的分离培养方法：
1、PDMS微孔阵列芯片的制备
(1)利用AutoCAD设计微孔阵列芯片结构，微孔的直径为150μm、深度为40μm，邻近两微孔的圆心到圆心距离为300μm，微孔的数目可根据需求进行控制；
(2)根据步骤(1)设计的微孔阵列芯片结构制备光刻模板，以单晶硅作为基底，选用Microchem SU 8-2025作为光刻胶进行光刻，匀胶厚度为40μm。光刻结束后得到具有微柱结构的硅片模板；
(3)在室温下，将制作好的硅片模板和敞口的、装有氟硅烷试剂的离心管至于密封的、-980mbar的真空干燥箱中处理4-6小时，以便于PDMS的剥离；
(4)称量质量比为10：1的PDMS预聚体和固化剂，混匀后，脱气处理，除去气泡；
(5)将步骤(4)的PDMS预聚体及固化剂的混合物倾倒到步骤(3)处理后的硅片模板上，控制其厚度约为5mm，在65℃下固化4h，并将PDMS从硅片模板上剥离下来。
2、PDMS微孔阵列芯片预处理
(1)将制备的PDMS微孔阵列芯片置于生物安全柜内，并对其进行灭菌处理；
(2)将灭菌后的PDMS微孔阵列芯片置于培养皿内，并于真空干燥箱中脱气处理30min，处理条件为：室温、真空度-980mbar。
3、样品溶液处理
(1)选取表达绿色荧光蛋白的大肠杆菌作为待分离细菌，将样品进行离心，取细菌沉淀备用；
(2)向细菌沉淀中加入生理盐水，并分散细菌；
(3)利用流式细胞分选仪对细菌进行计数，并计算细菌密度；
(4)用生理盐水稀释细菌得到密度分别为103个/ml、104个/ml、105个/ml的样品溶液。
4.利用PDMS微孔阵列芯片对表达绿色荧光蛋白的大肠杆菌进行分离培养
(1)从真空干燥器中取出PDMS微孔阵列芯片，并迅速地将处理后的样品溶液滴加到芯片上，保证溶液覆盖所有微孔；
(2)约1min后待所有微孔均被溶液填满时，倾斜PDMS微孔阵列芯片；此时芯片表面的样品溶液会滑落，而微孔内的溶液由于表面张力仍保留在微孔内；
(3)待PDMS微孔阵列芯片表面无液体残留时，将芯片有微孔阵列一面倒扣到琼脂培养基(20g/L LB Broth,15g/L琼脂)上；
(4)将培养皿在37℃下进行培养；当菌落长到一定大小时即可揭除芯片进行挑菌鉴定。
测试例1
(1)取实施例1中分离后的表达绿色荧光蛋白的大肠杆菌，在培养前进行激光扫描共聚焦显微镜观察，结果如图2-3所示，其中，图2的大肠杆菌密度为105个/ml，图3的大肠杆菌密度为104个/ml。由图2-3可以看出，表达绿色荧光蛋白的大肠杆菌被分散到一个个独立的微孔阵列内，芯片的表面并无细菌残留，这也表明各个微孔内的细菌是完全独立开来的，并无相互交叉污染发生。此外，当大肠杆菌密度为103个/ml时，由于实现了单细菌的分离，培养前荧光信号较弱，故培养后再利用激光扫描共聚焦显微镜进行观察。
(2)取实施例1中细菌密度为103个/ml和105个/ml时分离后的大肠杆菌，在培养12h后，进行激光扫描共聚焦显微镜观察，结果分别如图4和图5所示。由图4和5可以看出在PDMS微孔阵列芯片上分离、培养后的表达绿色荧光蛋白的大肠杆菌的增殖情况，说明本发明的PDMS微孔阵列芯片有利于细菌的正常增殖，且微孔间细菌的培养无干扰。由图4还可以看出，当细菌密度控制在103个/ml时，培养前难以直接观察；将其培养一段时间后发现，大部分的微孔都是空的，仅有少部分微孔中包含有大肠杆菌，这说明了通过将低密度的细菌溶液分散到PDMS微孔阵列芯片上可以实现单细菌分离的目的。
实施例2
基于PDMS微孔阵列芯片的大肠杆菌的分离培养方法：
1、PDMS微孔阵列芯片的制备：与实施例1相同，此处不再详述。
2、PDMS微孔阵列芯片预处理：与实施例1相同，此处不再详述。
3、样品溶液处理：除样品溶液中大肠杆菌密度为103个/ml外，其余与实施例1相同，此处不再详述。
4.利用PDMS微孔阵列芯片对大肠杆菌进行分离培养：除步骤(4)外，其余与实施例1相同，此处不再详述；本实施例的步骤(4)为：将培养皿放入合适的条件下进行培养24h，当菌落长到肉眼可见的尺寸后，揭除芯片进行挑菌鉴定。结果如图6所示，大肠杆菌菌落大小长到了毫米级别，能够让操作者更方便地进行肉眼挑菌。
实施例3
基于PDMS微孔阵列芯片的混合菌的分离培养方法：
1、PDMS微孔阵列芯片的制备：与实施例1相同，此处不再详述。
2、PDMS微孔阵列芯片预处理：与实施例1相同，此处不再详述。
3、样品溶液处理：除样品溶液为含有粪肠球菌、坚强芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌的混合菌外，其余与实施例1相同，此处不再详述。其中，粪肠球菌、坚强芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌的个数比为1:1:1，细菌的总密度为1000个/ml；
4.利用PDMS微孔阵列芯片对混合菌进行分离培养：除步骤(4)外，其余与实施例1相同，此处不再详述；
本实施例的步骤(4)为：将培养皿在37℃下培养24h，当菌落长到肉眼可见的尺寸后，揭除芯片进行挑菌鉴定。结果如图7所示，图中可清晰的看出粪肠球菌、坚强芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌混合菌经分离培养后的菌落生长情况，粪肠球菌、坚强芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌得到了较好的分离，培养中未产生污染，分离效果好。
上述实施方式仅为本发明专利的优选实施方式，不能以此来限定本发明专利保护的范围，本领域的技术人员在本发明专利的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明专利所要求保护的范围。

Claims (8)

1.一种基于PDMS微孔阵列芯片的细菌分离培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)芯片预处理：将PDMS微孔阵列芯片经灭菌处理后，在真空干燥箱进行处理；所述PDMS微孔阵列芯片上设置有直径为140-160μm、深度为30-50μm的圆柱形微孔，且任意相邻的两个微孔的圆心距离为250-350μm；
(2)细菌分离：将细菌密度为102-104个/ml的样品溶液滴加到真空预处理后的PDMS微孔阵列芯片上，使样品溶液覆盖所有微孔；待样品溶液填满所有微孔后，倾斜PDMS微孔阵列芯片去除芯片表面残留的样品溶液；
(3)细菌培养：将经步骤(2)处理后的PDMS微孔阵列芯片倒扣在琼脂培养基上，使设置有微孔的一面与琼脂培养基接触连接，进行细菌培养，然后揭除芯片进行挑菌鉴定。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微孔的直径为150μm、深度为40μm，且任意相邻的两个微孔的圆心距离为300μm。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述真空干燥箱的处理条件为：真空度为-980mbar，处理时间为30-40min。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述样品溶液中细菌的密度为103个/ml。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PDMS微孔阵列芯片是通过以下方法制备的：
(1)根据微孔阵列芯片的结构制备光刻模板，然后以单晶硅作为基底进行光刻，制备得到具有微柱结构的硅片模板；
(2)采用氟硅烷对步骤(1)得到的硅片模板进行处理；
(3)将PDMS预聚体和固化剂混匀后进行脱气处理，然后倾倒在步骤(2)处理后的硅片模板上，控制PDMS预聚体和固化剂混合物的厚度为4-6mm；
(4)将步骤(3)处理后的硅胶模板在60-70℃下固化处理3-5h，冷却后将PDMS从硅片模板上剥离下来，即得所述PDMS微孔阵列芯片。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述光刻时采用的光刻胶为Microchem SU 8-2025，所述光刻胶的厚度为40μm。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述PDMS预聚体和固化剂的质量比为10:1。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述PDMS预聚体和固化剂混合物的厚度为5mm。
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